Name: Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Öğrenin, akış sitometrisi ile makrofajlarda FcγR çapraz bağlanmasına yanıt olarak reaktif oksijen türlerinin üretimini ölçme yöntemini. Bu teknik, kronik granülomatöz hastalık ve otoimmün bozukluklarda immün yanıtları değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Tigno-Aranjuez Laboratuvar Laboratuvar bakım ve fare koloni bakım yardım için Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy ve Roopin Singh gibi diğer üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma için destek hibe R00 HL122365 ve J.T.T-A. başlangıç fonlar tarafından sağlanan

<ol><li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li>
<li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li>
<li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li>
<li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagocyte+respiratory+burst%3A+Historical+perspectives+and+recent+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li>
<li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li>
<li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+signaling+and+respiratory+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Immunologic+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li>
<li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li>
<li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatal+%28chronic%29+granulomatous+disease+of+childhood%3A+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Hematology%22%5BJournal%5D)">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li>
<li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li>
<li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li>
<li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li>
<li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species%3A+Measurement+of+ROS+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22White+Paper%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li>
<li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li>
<li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2%27%2C7%27-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement%3A+Forty+years+of+application+and+controversy%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li>
<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
<li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586(2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

DCFH2-DA ve DHE tabanlı algılama ROS, yaygın olarak kullanılan teknik14,15var. Kullanım kolaylığı ve Kinetik Mikroplaka biçimleri için bu ROS probları adaptasyon, floresan mikroskopi veya akış sitometrik analiz onların popülerlik için katkıda bulunmuştur. Ancak, çalışmalarımız FcγR-aracılı makrofaj fonksiyonların, değil gibi görünüyor bu tahlil için FcγR çapraz bağlı hücre akış sitometrik çözümlemesi gerçekleştirmek için standart bir protokol. Değerlen...

Reaktif oksijen türleri (ROS) reaktif molekülleri veya serbest radikallerin yan ürünleri ( 1' de gözden) Aerobik solunum vardır. Bunlar, süperoksit anyon, peroksit, hidrojen peroksit, radikal hidroksil ve hidroksil iyonları, diğerleri arasında içerir. Normal fizyolojik şartlarda ROS esas olarak mitokondri ve Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oxidases tarafından üretilen ve çeşitli enzimler ve protein süperoksit dismutaz ve glutatyon gibi hızla detoxified. ROS veya ROS çıkarılması yeteneğini bir üründe abartılı bir üretim oksidatif stres, mademki proteinler, lipidler ve hücresel stres ya da ölüm ve patolojik hastalık durumlarında yol DNA hasar Reaktif oksijen türleri teşvik neden olabilir. Ancak, bu şu anda ROS de sinyal molekülleri (redoks sinyal) hareket edebilir ve çeşitli moleküller ve yolu ara ürün ROS-aracılı değişiklik etkileyebilir hücresel metabolizma, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma, inflamatuar beğeni topluyor sinyalizasyon ve2yaşlanma. Fagositik hücreleri, ROS antimikrobiyal aktivite sırasında sözde "solunum patlama"1,3,4,5,6sağlayan önemli bir rol oynar. Dış uyaranlara karşı fagositler tepki sırasında NADPH oksidaz karmaşık (p40phox, p47phox, p67phox) bileşenlerinin sitozol gp91phox ve p22phox içeren phagosomal membran translocate alt birimleri, ve Rac1/2 eylemleri ile birlikte, bir tam işlevsel NADPH oksidaz enzimi karmaşık form. Birleştirilmiş NADPH oksidaz sonra NADPH oksijen süperoksit phagosomal çarpıtması içinde azaltmak için kullanır. Süperoksit anyon doğrudan zarar verebilir ya da hidrojen peroksit dismutated. Süperoksit ve hidrojen peroksit büyük ölçüde reaktif hidroksil radikalleri oluşturmak için diğer molekülleri ile tepki verebilir. Hasar bu ROS proteinler kümelerde demir-kükürt ile reaksiyon veya sonuçta kısıtlı mikrobiyal metabolizma veya mikrop5ölüm önde gelen DNA'ın temel oksidasyon neden aracılık ettiği. ROS esnasında solunum patlamış üretilen ve NADPH oksidaz enzimi karmaşık önemi resimli klinik hastalarda kronik Granulomatous hastalığı (ÇGD)7,8,9, 10. CGD olan bireyler sahip gp91phox, mutasyonların ROS üretim ve bakteri ve mantarlar genellikle immün bireyler ile bir endişe olmayan tekrarlayan enfeksiyonlara yatkınlık eksikliği sonuçlanan. Bu nedenle, oksidatif stres, Redoks Sinyal veya ana savunma, varlık ölçmek mümkün eğitim ROS üretim gerçek zamanlı olarak yararlı bir çaba olup.
Tedbir ROS üretim veya oksidatif stres11,12,13sonuçlarını birden çok testleri kullanılmıştır. Bunlar arasında en çok kullanılan biridir floresan sonda 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Bu renksiz ve lipofilik moleküldür. DCFH2-DA hücre zarı arasında Difüzyon hücre içi esterazlar tarafından üzerine hareket hangi hücre geçirimsiz işleme DCFH2, deacetylates sağlar. ROS (hidrojen peroksit, peroxynitrite, hidroksil radikalleri, nitrik oksit ve peroxy radikaller) DCFH2 üzerinde birden çok türde eylemler floresan olan DCF okside (Ex bildirilen / Em: 485-500 nm/515-530 nm) ve bir akış kullanarak tespit edilebilir sitometresi floresein (FL1 kanal) için ayarla Standart filtre ile donatılmıştır. Süperoksit şiddetle DCFH2 ile cevap vermiyor ama floresan ürün 2-hydroxyethidium (yanı sıra diğer floresan süperoksit bağımsız oksidasyon ürünleri)15verim için başka bir sonda dihydroethidium ile (DHE) tepki verebilir. DHE oksidasyon floresan ürünlerin bir uyarma dalga boyu 518 kullanarak tespit edilebilir nm ve emisyon dalga boyu 605 nm (FL2 kanal). Bu sondalar ROS algılanması için kullanımı gerektirir onların sınırlamalar bilgi ve yordamlar ve denetimleri geçerli olması için gerçekleştirilen özel tahlil içine deneysel boyama dikkatli ana kullanmak nispeten basit olmasına rağmen sonuçları ve sonuçlara. Aşağıdaki iletişim kuralı tarafından Akış Sitometresi ROS ölçmek için tasarlanmış bu 2 probları istihdam bir ticari olarak mevcut kit kullanımı gösterilmiştir. Bu sonda ile astarlanmış kemik iliği türevi makrofajlar leke ve FcγR cross-linking aracılığıyla ROS üretim teşvik. Bu iletişim kuralı kullanılarak elde temsilcisi verileri sunmak ve başarılı deneme için üstlenilen uygun önlemler stres.

<table><tbody><tr><td>Anti-BSA IgG1</td><td>Yenilikçi Araştırma</td><td>IBSA9E2C2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Sıçan IgG2b, &kappa; Isotype Ctrl Antibody</td><td>BioLegend</td><td>400626</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr>Alexa Fluor 647 <td>BD Biosciences</td><td>ile</td><td>konjuge anti-fare F4/80 antikoru</td> 565853 <td></td></tr><tr>FITC <td>BioLegend</td><td>ile konjuge anti-fare F4/80 antikoru</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 ile konjuge anti-fare/insan CD11b antikoru;</td><td>BioLegend</td><td>101218</td><td></td></tr><tr><td>beta-merkaptoetanol (BME)</td> <td>Sigma</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA) FraksiyonV</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL / 6J & nbsp;</td><td>Jackson laboratuvarları</td><td>Stok No.000664</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA</td><td>Moleküler Problar</td><td>C6827</td><td>Enzo kitinde oksidatif stres tespit reaktifinin yerine geçebilir</td></tr><tr><td>Dihidroetiyum (DHE)</td> <td>Moleküler Problar</td><td>D11347</td><td>Enzo kitinde süperoksit tespit reaktifinin yerine geçebilir</td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM fenol içermez kırmızı</td><td>Gibco</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>DMF Susuz&nbsp;</td><td>Acros Organics</td><td>61094-1000</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>FITC Sıçan IgG2a, &kappa; İzotip Ctrl Antikoru</td><td>BioLegend</td><td>400506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L glutamin</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>LADMAC hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>fare IFN-g</td><td>GoldBio</td><td>1360-06-100</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetil-L-sistein</td><td>EMD Milipore</td><td>106425</td><td>Enzo kitinde ROS inhibitörü/çöpçüsünün yerine geçebilir</td></tr><tr><td>Otomatik örnekleyicili Novocitte akış sitometresi</td><td>Acea</td><td>2060R</td><td></td></tr><tr><td>Piyosiyanin (ROS indükleyicisi)</td> <td>Cayman kimyasal</td><td>10009594</td><td>Enzo kitindeki indükleyicinin yerine geçebilir</td></tr><tr><td>ROS-ID toplam ROS / süperoksit tespit kiti</td><td>ENZO</td><td>ENZ-51010</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum piruvat (100mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometrik ölçüm makrofajlar fcγr cross-linking yanıt ros üretim

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Oksidatif veya solunum aşırı oksijen tüketiminin hızlı ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) nesil açıklamak için çeşitli bağışıklık uyaranlara yanıt olarak fagositler tarafından kullanılır. ROS bağışıklık etkinleştirme sırasında oluşturulan aracılığıyla öncelikle ROS yeteneklerini DNA ve proteinler, zarar vermek için güçlü antimikrobiyal aktivitesi mikroorganizmaların ölümüne neden olan uygular. ROS üretim tekrarlanarak ve kolaylıkla ölçmek için güçlü olmak çeşitli yollar ve bu konak savunma mekanizmasının moleküllerine katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu kağıt, floresan problar kullanımını gösteren ve Akış Sitometresi ROS üretim algılamak için. Her ne kadar yaygın olarak kullanılan, ROS floresan ölçümü rootkitler, özel ve değil mitogenic uyaranlara tarafından indüklenen ROS ölçümü açısından özellikle problemlidir. Biz makrofaj üretimi, astar, Boyama, FcγR cross-linking ve akış sitometrik çözümlemesi ile biten başlayarak belirli FcγR uyarılması sonucu olarak oluşturulan ROS algılamak için detaylı bir metodoloji mevcut.

İçinde özetlenen protokolü kullanarak, biz temsilcisi veri akış sitometrik algılama ROS üretim WT C57BL/6J BMDMs FcγR aracılığıyla uyarılması sonucu gösteren mevcut. Beklendiği gibi biz çok az değişiklik FL1 veya FL2 floresan arka plan düzeylerine unstimulated hücrelerdeki yukarıda içinde gözlemlemek (şekil 3A, "lekeli, unstimulated" vs "günahı, unstimulated" nokta çizer karşılaştırın). Hücreleri cross-linking agent (şekil 3A, "lekeli, unstimulated" nokta çizer ...

Bu çalışmada FcγR etkinleştirilmesinden kaynaklanan Reaktif oksijen türleri (ROS) üretim algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gösterir. Bu yöntem değişiklikleri antimikrobiyal ve fagositler yanıt bağışıklık kompleksleri, opsonized mikroorganizmalar veya doğrudan FcγR cross-linking fonksiyonlu Redoks değerlendirmek için kullanılabilir.

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Reaktif oksijen türlerinin veya ROS'un ölçümü oldukça sorunludur. Bu videoda, fc-gama reseptör çapraz floresan problar ve akış sitometri kullanarak yanıt olarak ROS tekrarlanabilir ölçüm gösterecektir. Bu tekniğin başlıca avantajları, sadece mitojenler veya bilinen ROS indükleyicileri değil, bu yöntemin spesifik antijenik uyaranlarla kullanılması ve titrenin tekrarlanabilirliğidir.Disregulated ros üretimi kronik granülomatöz hastalık veya CGD gibi birçok hastalığın gelişiminde merkezi bir yerdir. ROS'un doğru bir şekilde ölçülmesi CGD'nin moleküler tanısının bir parçasını oluşturabilir. FC aracılı ROS üretiminin incelenmesi, CGD gibi immün yetmezliklerin incelenmesinde önemlidir, aynı zamanda oto-immün hastalıkların veya çok fazla ROS'un oksidatif stres ve inflamasyona yol açtığı nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde de önemlidir.Tazbın zamanlaması çok önemli. Ben iyice hazırlamak ve mümkünse sahte bir deney yapmak için ilk kez bu protokolü deneyen birisi tavsiye ederim. Bu yöntemin görsel gösterimi, talın zamanlaması gibi özellikle dikkat gerektiren bir talın adımlarını vurgulamak için çok önemlidir.Başlamak için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi koşullu ortam kullanarak kemik iliği türevi makrofajlar hazırlayın. Makrofajları bir gecede astarladıktan sonra, supernatant aspire ve PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. Serum düşük serum DMEM aynı hacimde medya değiştirerek hücreleri açlıktan.Her fare için, bir tabak anti-BSA IgG1 ile tedavi edilirken, diğeri tedavi edilmezse serum açlıktan ölür. İşlenmemiş plakalara sadece düşük serumlu DMEM ekleyin ve tedavi edilen plakalara mililitrebaşına 2,5 mikrogram içeren düşük serumlu DMEM ekleyin. Akış sitometrik kompanse kontrolü olarak hareket etmek için her deneme için bir ek işlenmemiş plaka eklediğinden emin olun.Plakaları 4 saat 37 santigrat derecede, %5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Dört saatlik kuluçka sırasında, reaktif oksijen türleri probları bir 2X çözeltisi hazırlamak. Gerekli her 10 mililitre düşük serum DMEM için, bir oksidatif stres algılama reaktifi dört mikrolitre ve bir süperoksit algılama reaktifi dört mikrolitre ekleyin.Daha sonra, sadece oksidatif stres algılama reaktifi içeren veya sadece süperoksit algılama reaktifini içeren 2X prob çözeltilerini hazırlayın. Dört saatlik kuluçkadan sonra, hücreleri yavaşça kazıyarak, etiketli, beş mililitrelik yuvarlak dipli tüplerde toplayarak hasat edin. Tüpleri 750 kez g olarak beş dakika santrifüj edin.Hangi hücrelerin murine anti-BSA IgG1 ile tedavi edildiğini takip edin. Daha sonra, tedavi edilen hücrelerden kalan anti-BSA'dan kurtulmak için hücre peletlerini iki mililitre PBS ile yıkayın. Tüpleri 750 kez g olarak beş dakika santrifüj edin.Daha sonra, PBS aspire ve düşük serum DMEM 600 mikrolitre hücre pelet resuspend. 600 mikrolitrelik hücre süspansiyonundan, önceden etiketlenmiş beş mililitrelik yuvarlak alt tüplere 200 mikrolitre aliquot. İşlenmemiş hücrelerden, uyarılmamış olarak etiketlenmiş tüpler için 200 mikrolitre, pozitif indükleyici etiketli tüpler için 200 mikrolitre ve pozitif indükleyici artı inhibitör etiketli tüpler için 200 mikrolitre alın.Daha sonra, anti-BSA IgG1 tedavi hücrelerden, FC-gama reseptör crosslinking etiketli tüpler için 200 mikrolitre almak, ve tüpler için 200 mikrolitre FC-gama reseptör crosslinking artı inhibitörü etiketli. Tedavi edilmeyen hücrelerden telafi kontrolleri için kullanılacak, lekesiz olarak etiketlenmiş tüp için 200 mikrolitre, yeşil artı indükleyici kontrolü için 200 mikrolitre ve turuncu artı indükleyici kontrolü için 200 mikrolitre alın. Pyocyanin'i 2X prob çözeltilerinin her birine 1ila 100 oranında seyrelterek 2X pozitif indükleyici çözeltisi hazırlayın.Daha sonra, mililitre başına iki mikrogram 2X konsantrasyonu elde etmek için 2X prob çözeltisi BSA stok çözeltisini seyrelterek 2X BSA çözeltisi hazırlayın. FC-gama reseptör çapraz bağlama gibi spesifik stimülasyon başlamadan önce, tüm reaktifler ve hücrelerin hazır olduğundan emin olun ve onlar uyarılır sırasına göre buz tüpleri yerleştirin. Otomatik örnekleyicili akış sitometreleri için, sitometrenin bir örneği analiz etmek ve diğerine geçmek için aldığı zamana dikkat edin.Karıştırma ve sonda yıkama adımlarını eklediğinden emin olun. Zamanlama bu töz için çok önemlidir. Her durumun iyi kontrol edilebilmesi için, stimülasyonun her durum için tam 30 dakika içinde yapılması gerekir.Hücreleri sırayla uyarın ve akış sitometresi ile örnek alımları arasındaki gecikme süresini birleştirin. Bu noktada manuel kompanzasyon yapıyorsa, oksidatif stres algılama reaktifi ve indükleyici yi içeren 2X prob çözeltisinin 200 mikrolitresini yeşil artı indükleyici olarak işaretlenmiş tüplere ekleyerek telafi için kullanılacak kontrol tüplerini teşvik edin. Daha sonra, 200 mikrolitre 2X prob çözeltisi süperoksit algılama reaktifi ve indükleyici içeren tüpler içine turuncu artı indükleyici işaretli ekleyin.Karanlıkta hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Akış sitometri yazılımını kullanarak, analiz edilecek kanalları ve parametreleri belirtmekten emin olmak için, kontrol, lekesiz, işlenmemiş, yeşil artı indükleyici ve turuncu artı indükleyici örnekleri için üç örnek dosya oluşturun ve etiketleyin. Ayrıca, istenilen durak koşullarını girin.Kontrol örnekleri ayarlandıktan sonra, deney örnekleri için benzer bir dosya kümesi oluşturun ve etiketleyin. Şimdi, lekelenmemiş, işlenmemiş örneği çalıştırın. Y ekseninde X ekseninde ileri dağılım için bir nokta çizimi açın ve ölü hücreler ve enkaz hariç ilgi hücrelerinin etrafına bir geçit çizin.Daha sonra, Ilk floresan belirteci, FL1, X ekseni üzerinde başka bir nokta arsa açmak için bu hücrenin kapısını kullanın, ikinci floresan marker karşı, FL2, Y-ekseni üzerinde. İlk çeyreğin kapısını çizin ve ardından fl1 ile FL2 çiziminin sol alt çeyreğinde olayların görünmesi için kadranda kapıyı ayarlayın. Bittiğinde, yeşil artı indükleyici örnek çalıştırın.Fl1 ile FL2 çiziminin sol ve sağ alt çeyreğinde olayların görünmesi için voltajı ayarlayın. Ardından, bu telafi matrisini üç örnek dosyaya da uygulayın. Şimdi, portakal artı indükleyici örneğini çalıştırın.Voltajı, fl1 ile FL2 çiziminin sol üst ve alt alt kadranında görünecek şekilde ayarlayın ve bu telafi matrisini üç örnek dosyaya da uygulayın. Her tazminat dosyasını kontrol edin ve lekesiz, işlenmemiş olayların sol alt kadranda görünmesini, yeşil artı indükleyici olayların sol alt ve sağ kadranda görünmesini ve turuncu artı indükleyici olayların FL1'e karşı FL2 arsasının üst ve alt sol kadranda görünmesini sağlayın. Ardından, tüm deneme örnek dosyalarına telafi matrisi uygulayın.Manuel kompanzasyon yapıldıktan ve deneysel bir şablon alındıktan sonra deneysel numunelere geçin. Pozitif bir indükleyici ile hücreleri tedavi veya FC-gama reseptör hücre stimülasyon iletmeden önce, tüpler bir ROS inhibitörü alacak işareti. Bu hücreleri, pozitif indükleyici veya FC-gama reseptör stimülasyonundan en az 30 dakika önce, beş milimonun son konsantrasyonu için 200 mikrolitre resuspended hücreye inhibitör mikrolitresini ekleyerek ROS inhibitörü ile tedavi edin.Uyarılmamış hücreler için, hücreleri 2X prob çözeltisinin 200 mikrolitresi ile, lekeli, uyarılmamış olarak etiketlenmiş 200 mikrolitre hücre süspansiyonuna herhangi bir uyarıcı eklenmeden tedavi edin. Pozitif kontroller için, pozitif indükleyici veya pozitif indükleyici artı inhibitör etiketli hücre süspansiyon 200 mikrolitre için 2X pozitif indükleyici çözeltisi 200 mikrolitre ile hücreleri tedavi. Son olarak, FC-gama reseptör crosslinking tarafından uyarılmış hücreler için, 2X BSA çözeltisi 200 mikrolitre ile tedavi 200 hücre süspansiyon 200 mikrolitre fc-gama reseptör crosslinking veya FC-gamma reseptör crosslinking plus inhibitörü etiketli.Karanlıkta hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, ilk telafi adımları sırasında oluşturulan akış sitometresini ve analiz şablonlarını kullanarak numuneleri uyarıldıkları sırada analiz edin. Burada gösterilen veriler, fc-gama reseptörü aracılığıyla makrofajların uyarılmasından kaynaklanan reaktif oksijen türlerinin üretiminin akış sitometrik saptanmasını göstermektedir.Fc-gama reseptör çapraz bağlama ajanı ile uyarıldığında fl1 ve FL2 floresansında belirgin bir artış vardır. Fc-gama reseptör çapraz bağlama önce hücreleri reaktif oksijen türleri inhibitörü ile tedavi edildiğinde, bu artan floresan bazal seviyelere geri getirilir. Buna karşılık, bu nokta çizimler fc-gama reseptör stimülasyonu sonucu suboptimal reaktif oksijen türleri üretimi gözlendi başarısız bir deney mevcut.Beklenen yüzdeler veya MFI artışları arasındaki büyük farkları vurgulamak için, bu veriler FL1 ve FL2 floresanlarında en az artış gösteren örneklerin neye benzediğini gösterir. Geçerli protokol 24 saatlik bir astar adımı kullanır. 24 saatlik bir primleme süresi ile 48 saatlik bir astarlama süresini karşılaştırırken, yeşil oksidatif stres reaktifi için pozitif hücrelerin yüzdesi arasında belirgin bir fark yoktu.Ancak, 48 saat priming süresini artırmak turuncu floresan için pozitif hücrelerin yüzdesi arttı. Bu yordamı gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey önceden planlama ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tahkikat zamanlaması hakkında tutarlı olmaktır.

flow-cytometric-measurement-ros-production-macrophages-response-to

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz toplam bellek altkümelerini rhesus makakların CD4 + ve CD8 + T hücreleri, HIV / AIDS aşısı çalışmaları için ideal bir model gibi ayrıntılı fenotipik ve fonksiyonel karakterizasyonu için çok renkli flow sitometri yararını göstermektedir.

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

Bu videoda, poli D antikoru opsonize edilmiş R2R2 kırmızı kan hücreleri ile Fcγ reseptör aracılı fagositozu değerlendirmek için periferik kandan birincil monositleri kullanan bir monosit tek katmanlı test gösterilmektedir.

Monosit Tek Tabakalarında Fcγ Reseptörü Güdümlü Fagositozun İncelenmesi İçin Bir Test

Burada, görüntü sitometrisi kültür ev sahibi hücrelerle ilişkili olarak patojenik mantarların ölçümü için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Bu teknik, CFU sayımı için bir alternatif olarak kullanılabilir.

Ana Hücreler ile Derneği Patojen Mantarlar miktarının Image for Sitometrinin kullanın

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Bu çalışma, izole edilmiş sıçan makrofajları tarafından ksenojenik (insan) ve allojenik (sıçan) kırmızı kan hücrelerinin fagositoz oranlarını ölçmek ve karşılaştırmak için standartlaştırılmış bir in vitro protokolü açıklamaktadır.

Allojenik ve Ksenojenik Eritrositlerin Sıçan Makrofajları ile Fagositozunun İn Vitro Kantitatif Bir Değerlendirmesi

Öğrenin, akış sitometrisi ile makrofajlarda FcγR çapraz bağlanmasına yanıt olarak reaktif oksijen türlerinin üretimini ölçme yöntemini. Bu teknik, kronik granülomatöz hastalık ve otoimmün bozukluklarda immün yanıtları değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

Daha fazla video keşfet