Name: Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Keşfedin, transgenik mısır çekirdeklerinde Aspergillus flavus büyümesini ve aflatoksin üretimini analiz etmek için basit bir çekirdek tarama testi. Bu yöntem, antifungal proteinlerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

David Meints, Arkansas Üniversitesi geliştirilmesi ve transgenik Mısır sırasında erken nesiller analiz onun yardım için teşekkür ederiz. Bu eser USDA-ARS CRIS proje 6054-42000-025-00D mali destek aldı. Ticari adlar veya ticari ürünler bu makalede söz yalnızca belirli bilgileri sağlamak amacıyla ve tavsiye veya bize Tarım Bakanlığı tarafından onaylandığı anlamına gelmez. USDA-ARS eşit istihdam fırsatı (EEO) ilkesi fırsat eşitliği için tüm kişilerin görev ve Ajans'ın personel politikaları, uygulamalar ve işlemler her yönüyle ayrımcılığı yasaklar.

1. plazmid yapıları ve Mısır dönüştürme
<ol><li>PCR yükseltmek Lablab AILP 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 've 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3' primerler kullanılarak ekleme. PCR koşullar bir ilk denatürasyon adım 30 98 ° C'de yer denatürasyon 10 98 ° C'de tarafından takip s (adım 1), s (adım 2), 30 55 ° C'de tavlama s (adım 3), 20 72 ° C uzama s (adım 4), adım 2 ile adım 4 31 döngüleri , ve son bir uzama adım 5 dk. değiştirilmiş pCAMBIA 1300 PCR üründe vektör Xbakullanarak klon için 72 ° C'de ben ve Pstben kısıtlama siteleri. Sıra son bitki hedef vektör yönünü ve vektör klonlanmış AILP gen dizisini onaylamak için.</li>
	<li>Agrobacterium gerilme EHA101 son vektör yapı (Şekil 1) ile daha önce açıklanan 16olarak dönüştürmek.</li>
	<li>Olgunlaşmamış Mısır (Zea mays L. Hi-II) embriyo (bitki dönüşüm tesisi, Iowa Eyalet Üniversitesi'nde gerçekleştirilen) dönüştürmek için son bitki hedef vektör içeren Agrobacterium dönüştürülmüş kullanın 16.</li>
	<li>(26-29 ° C; 16/8 h photoperiod yüksek basınç Na-lambalar ile desteklenmiş) sera içinde T0 bitkiler büyümek ve art arda T6 nesil transgenik özelliği için homozygosity elde etmek için elde etmek için self-pollinate.</li>
</ol>2. spore çimlenme tahlil
<ol><li>Yaprak örnekleri hasat ve-80 ° C'de depolayın Yaprak örnekleri bir harç ve sıvı nitrojen kullanarak havaneli ile eziyet. 2 mL microcentrifuge tüpler 0.5 g tartmak, proteaz inhibitörü 17 µL eklemek ve tüpler buza koyun.</li>
	<li>Tüpler, 16.000 x g10 dk santrifüj kapasitesi. 0.5 mL microcentrifuge tüpler için Bitki ekstresinin 225 µL aktarmak ve buza koyun.</li>
	<li>15 mL santrifüj tüpü Aspergillus flavus 70 – GFP % 1 patates dekstroz suyu (w/v) içinde bir 5 mL spor süspansiyon hazırlamak. Girdap ve spor konsantrasyonu 105 Sporlar/ml bir haemocytometer ile ayarlayın. Dikkat: A. flavus aflatoksin üretir, bu mantar ile tüm iş biyolojik emanet dolabı yapılmalıdır.</li>
	<li>Kültür Sporlar şişkin tarafından belirtildiği gibi spor çimlenmesi inisiyasyon % 50 elde kadar PDB'de 28 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Girdap ve aliquot 25 µL spore çözüm 225 µL bitki özü. Örnekleri 28 ° C'de aralıklı sallayarak ile 20 saat kuluçkaya.</li>
	<li>Spore çözüm ölçü uzunluğu, mikrop ve mikroskop slayt üzerinde aliquot 25 µL Sporlar dijital kamera yazılımı kullanarak tüpleri. En az 20 Çoğalt ölçümler her satırı için kullanın. Not: Bu aşamada 4 ° C'de saymak için hazır kadar koloni büyümesini durdurmak için tüm kültürler yerleştirin.</li>
</ol>3. çekirdek tahlil (KSA) Eleme
<ol><li>KSA kapaklar 4 ek kapaklar (22 mm) 60 x 15 mm petri kabına yapıştırma tarafından inşa. Tutkal için 48 H kapaklar kullanmadan önce kurumasını sağlar. Her KSA kap bir rep (Şekil 2) kabul ettiğiniz anlamına gelir.</li>
	<li>Bir steril biyolojik güvenlik kabin, bir kare bioassay tepsi (24 cm x 24 cm) % 70 etanol: H2ile O (v/v) sprey ve kuru hava girsin. Steril Kromatografi kağıt tepsisi. % 70 etanol ile 9 KSA caps sprey, bioassay tepsisine yerleştirin ve kuru hava girsin.</li>
	<li>Test edilen her transgenik Mısır satırı için 20 hasarsız çekirdekleri seçin ve bir 50 mL santrifüj tüpü yerleştirin. % 70 etanol ekleyin ve 4 dakika oturup bekleyin. Yavaşça tüpler sterilizasyon sırasında sallamak. Kapalı üç kez olarak steril deiyonize H2O. etanol ve durulama çekirdekleri dökün</li>
	<li>V8 Orta (%5 V8 suyu, %2 agar, pH 5.2) yetiştirilen Aspergillus flavus 70 – GFP17 6 gün eski bir kültürden bir spor süspansiyon hazırlamak.<ol>
<li>20 mL steril %0.02 Triton X-100/deiyonize H2O (v/v) eklemek ve bir kısır döngü ile Sporlar kapalı hurda. Damlalıklı yeri bir 300 mL steril ölçek ve inoculum kapalı.</li>
		<li>0,02 ile 5-fold bir seyreltme hazırlamak % Triton X-100, sonra bir haemocytometer olan bir spor sayısı gerçekleştirin. Tekrar 4 x 106 Sporlar/mL bir konsantrasyon ile 100 mL elde etmek gerekirse oranında seyreltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdekleri steril 300 mL kabı bir heyecan çizgiyle yerleştirin. İnoculum kabı için ekleyin. Dikkat: çekirdekler için inoculum eklemek çözüm sıçrama için neden olacaktır. Kabı 3 dakika boyunca bir heyecan tabağa yerleştirin. 3 dakika sonra inoculum bir boş kabı dökün.</li>
	<li>Bir forseps kullanarak, çekirdekleri bioassay tabak (1 çekirdek/kapak) yerleştirin. 30 mL deiyonize su her bioassay tepsi altına ve 7 gün boyunca karanlıkta 31 ° C'de kuluçkaya ekleyin.</li>
	<li>Çekirdekleri Fotoğrafçılık için hazırlayın.<ol>
<li>4 çekirdekleri mikroskopik analiz ve Fotoğrafçılık her satırdan kenara. Not: Çekirdekler için artık fotoğraf tamamlamadan önce 5 gün daha 4 ° C'de muhafaza edilebilir.</li>
		<li>Aşı A. flavus (Şekil 3) ile yedi gün sonra çekirdekleri fotoğraf çekmek.</li>
		<li>Çekirdekleri bir yumuşak doku ve deiyonize su ile temiz dış. Boyuna çekirdekleri bölümlerini gerçekleştirmek ve hemen floresan mikroskop altında fotoğraf çekmek.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çekirdekleri analiz için hazırlayın.<ol>
<li>Bir yumuşak doku ve deiyonize su ile kalan çekirdeklerin temiz dış.</li>
		<li>Yer 4 badem, 1 rep, 15 mL vidalı kapak Polikarbonat oluşturan içeren 2 Paslanmaz topları şişe. Hemen şişeleri sıvı azot ve mağaza-80 ° C'de daha fazla işleme ve analiz kadar dondurmak.</li>
		<li>Şişeleri-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve çekirdekleri bir homogenizer 1500 rpm içinde 3 dakika boyunca eziyet. Not: sıvı azot ile dondurulmuş çekirdekleri tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. PCR tarama transgenik mısır çekirdekleri
<ol><li>DNA izolasyon kit genomik DNA (gDNA) izole etmek için üreticinin yönergelerine göre A. flavus ile enfekte toz mısır çekirdekleri kullanın. Kısaca, 280 µL arabellek F, 20 µL proteaz ve 3 µL dithiothreitol (DTT) toz mısır çekirdekleri için 10-15 mg ekleyin. Kuluçkaya ve bir thermomixer (56 ° C, 1200 rpm, 30 dk) sallamak. 10.000 x g 1 dk. için de santrifüj kapasitesi ve açık süpernatant dengelenmiş sütuna aktarmak. 3 dk. ve santrifüj 700 x g gDNA elute için 1 dakika için de oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
	<li>0.8 µL PCR kiti kullanarak her örnek için bir 20 µL PCR reaksiyon ayarlamak için çıkarılan gDNA al. Thermocycling koşulları olarak üreticinin iletişim kuralında tavsiye izleyin. PCR koşullar denatürasyon 5 için 98 ° C'de ardından bir ilk denatürasyon adım 5 min (adım 1) için 98 ° C'de yer s (adım 2), 55 ° c 5 tavlama s (adım 3), 20 72 ° C uzama s (adım 4), adım 2 ile adım 4 40 döngüleri ve bir son uzama adım 72 ° c için 1 dk (5. adım).</li>
	<li>İleri astar 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3'ü kullanın ' ve ters astar 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' Lablab AILP varlığını doğrulamak için gen transgenik mısır çekirdekleri içinde.</li>
</ol>5. RNA izolasyon, cDNA sentezi ve yarı kantitatif RT-PCR
<ol><li>Homojenize almak A. flavus mısır çekirdekleri daha önce RNA çıkarılması için-80 ° C'de depolanan enfekte. Bir toplam RNA izolasyon kit üreticinin protokolüne göre ama hafif değişiklik18ile kullanarak RNA ayıklayın. Homojenize mısır çekirdeği tozu 50 mg ayıklama arabellekte ekledikten sonra onsuz de (vortexing) 1 mL damlalıklı ucu kullanarak karıştırın ve buz üzerinde 5-6 dakika devam etmeden önce sonraki adımlar için üreticinin iletişim kuralında tanımlandığı gibi bırakın.</li>
	<li>CDNA üreticinin iletişim kuralı 18göre cDNA sentez seti kullanarak hazırlayın.</li>
	<li>0.5 µL PCR reaksiyon başına su katılmamış cDNA yarı kantitatif RT-PCR için daha önce açıklanan18kullanın. İleriye ve geriye doğru astar qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3'ü kullanın ' ve qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA sırasıyla Lablab AILP gen ekspresyonu, algılamak ve ileri ve ters astar qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ ve qRib-R - 3' 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ sırasıyla Mısır ribozomal yapısal gen (göğüs), GRMZM2G02483819 ev tutma gen olarak ifade.</li>
</ol>6. GFP Nefelometri
<ol><li>50 mL her 0.2 M Yem mono sodyum fosfat (NaH2PO4) ve 0.2 M dibasic sodyum fosfat (Na2HPO4·7H2O) deiyonize H2O. hazırlamak</li>
	<li>PH 7,0 Sorenson fosfat tampon 100 mL kadar olun. 19.5 mL NaH2PO4 hisse senedi, 30.5 mL NaHPO4·7H2O hisse senedi ve 50 mL deiyonize H2O. pH 7,0 için ekleyin</li>
	<li>25 mg yere çekirdek malzeme (taze ağırlık, FW) tartmak ve bir 1.0 mL microcentrifuge tüpü yerleştirin. Santrifüj tüpü ve 30 için girdap 500 µL fosfat tampon eklemek s.</li>
	<li>Örnekleri 16.000 x gde 15 dakika santrifüj kapasitesi. Damlalıklı 100 µL süpernatant siyah 96 iyi plaka içine. Örnekleri bir yer (uyarma 485 nm, emisyon 528 nm) okuyun.</li>
</ol>7. Toplam Aflatoksin Analizi
<ol><li>Örnek işleme ve aflatoksin çıkarma<ol>
<li>60 ° C'de 2 gün cebri hava fırında kuru çekirdek örnekleri Örnekleri tartmak ve 50 mL Cam tıpa ile Erlenmeyer şişeye koyun.</li>
		<li>Bir duman başlık, her şişeyi için 25 mL Metilen klorür ekleyin. Dikkat: Metilen klorür son derece kırılgandır ve tehlikeli (tahriş edici, kanserojen) olarak kabul edilir. Ne lateks ne de nitril eldiven Metilen klorür ile çalışmak için güvenlidir. Geliştirilmiş organik solvent dayanıklı PolyVinylAlcohol eldiven kullanın.</li>
		<li>30 dk için örnekleri üzerinde bilek eylem sallayıcı. 30 dakika sonra yavaş yavaş özü bir yivli filtre kağıdı daire bir 80 mL kabı dökün. Bir duman hood kadehler kuru geceleme izin.</li>
		<li>Ertesi gün, Metilen klorür (yaklaşık 5 mL) iç bücür jant kuru kadehler, etrafında girdap ve 2 Dramı cam şişe dökün. Gecede bir duman mahallede kurumaya bırakın şişe açın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aflatoksin Analizi<ol>
<li>4.0 mL % 80 metanol ekleyin: Deiyonize H2O (v/v) tüpleri için.</li>
		<li>Kullanım filtre uygulamak için bir aflatoksin ekstraksiyon kiti metanol çözüm sağlanan sütun ile arındırmak. Toplam Aflatoksin düzeyleri ile bir yer, üreticinin yönergelerine göre analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ismaiel, A., Papenbrock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycotoxins%3A+Producing+fungi+and+mechanisms+of+phytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity.</a> Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).</li>
<li>Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+economic+losses+to+the+USA+corn+industry+from+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination.</a> Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).</li>
<li>Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins+and+food+pathogens%3A+Impact+of+biologically+active+aflatoxins+and+their+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).</li>
<li>Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+aflatoxin-resistant+maize+lines+using+recent+advances+in+technologies+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants+-+Part+A+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review.</a> Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).</li>
<li>Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+of+aflatoxin+contamination+in+U.S.+crops+and+the+use+of+bioplastic+formulations+of+Aspergillus+flavus+biocontrol+strains+to+optimize+application+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).</li>
<li>Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+technologies+to+manage+aflatoxins+in+foods+and+feeds+and+the+profitability+of+application+%E2%80%93+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review.</a> Food Control. 76, 127-138 (2017).</li>
<li>Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+and+invertase+activity+as+influenced+by+Pythium+pleroticum+causing+rhizome+rot+of+ginger%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger.</a> Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).</li>
<li>Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectinolytic%2C+cellulolytic%2C+amylase+and+protease+production+by+three+isolates+of+Fusarium+solani+variable+in+their+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Mycology+and+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence.</a> Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amy1%2C+the+%CE%B1-amylase+gene+of+Aspergillus+flavus%3A+Involvement+in+aflatoxin+biosynthesis+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels.</a> Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).</li>
<li>Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylopectin+induces+Fumonisin+B1+production+by+Fusarium+verticillioides+during+colonization+of+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-based+silencing+of+the+a-amylase+%28amy1%29+gene+in+Aspergillus+flavus+decreases+fungal+growth+and+aflatoxin+production+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels.</a> Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).</li>
<li>Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+corn+trypsin+inhibitor+with+antifungal+activity+inhibits+Aspergillus+flavus+%CE%B1-amylase%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase.</a> Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+of+Aspergillus+flavus+and+fungal+%CE%B1-amylases+by+a+lectin-like+protein+from+Lablab+purpureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).</li>
<li>Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+among+proteins+in+the+phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase+inhibitor+family+of+the+common+bean+and+its+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives.</a> Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).</li>
<li>Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+the+gene+encoding+an+inhibitor+against+Aspergillus+flavus+a-amylase%2C+a+novel+seed+lectin+from+Lablab+purpureus+%28Dolichos+lablab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab).</a> Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).</li>
<li>Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrame%2C+B+%22Plant+Embryo+Culture%22">Plant Embryo Culture</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+resistance+to+aflatoxin+contamination+in+kernels+of+maize+genotypes+using+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain.</a> World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aspergillus+flavus+growth+and+aflatoxin+production+in+transgenic+maize+kernels+expressing+a+tachyplesin-derived+synthetic+peptide%2C+AGM182%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182.</a> Plant Science. , 150-156 (2018).</li>
<li>Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+gene+expression+in+maize+seeds+during+colonization+by+Aspergillus+flavus+and+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides.</a> Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).</li>
<li>Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+losses+due+to+diseases+and+their+implications+for+global+food+production+losses+and+food+security%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security.</a> Food Security. 4, 519-537 (2012).</li>
<li>Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+exposure%2C+safety+issues%2C+and+risk+assessment+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).</li>
<li>Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins%3A+Characterisitcs+and+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Post%C4%99py+Higieny+i+Medycyny+Do%C5%9Bwiadczalnej+%28Online%29%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health.</a> Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).</li>
<li>Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain+to+study+fungal+invasion%2C+colonization%2C+and+resistance+in+cottonseed%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed.</a> Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).</li>
<li>Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+elements+in+the+promoter+region+of+the+Aspergillus+nidulans+gpdA+gene+encoding+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> Gene. 93 (1), 101-109 (1990).</li>
<li>Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+aflatoxin+biosynthetic+enzymes+Nor-1%2C+Ver-1%2C+and+OmtA+in+time-dependent+fractionated+colonies+of+Aspergillus+parasiticus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus.</a> Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).</li>
<li>Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+genetics+of+regulation+of+aflatoxin+production+and+Aspergillus+flavus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development.</a> Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).</li>
<li>Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+developing+maize+germplasm+with+resistance+to+accumulation+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins.</a> World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).</li>
<li>Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chitin-binding+lectin+from+stinging+nettle+rhizomes+with+antifungal+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties.</a> Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).</li>
<li>Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hevein-an+antifungal+protein+from+rubber-tree+%28Hevea+brasiliensis%29+latex%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex.</a> Planta. 183, 258-264 (1991).</li>
<li>Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+properties+of+lectin+and+new+chitinases+from+potato+tubers%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Academie+des+Sciences+-+Series+III%22%5BJournal%5D)">Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers.</a> Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).</li>
<li>Wisessing, A., Choowongkomon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+inhibitors+in+plants%3A+Structures%2C+Functions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications.</a> Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).</li>
<li>Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-amylase+inhibitor%3A+A+compelling+plant+defense+mechanism+against+insect%2Fpests%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+%26+Ecology%22%5BJournal%5D)">a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests.</a> Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).</li>
<li>Powers, J. R., Culbertson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+bean+amylase+inhibitor+on+insect+amylases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases.</a> Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).</li>
<li>Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a-amylase+inhibitors+on+insect+storage+pests%3A+Inhibition+of+a-amylase+in+vitro+and+effects+on+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).</li>
<li>Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+characterization+of+the+12-kDa+protease+a-amylase+inhibitor+present+in+maize+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds.</a> Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).</li>
<li>Abdollahi, A., Buchanan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aflatoxin+biosynthesis%3A+Induction+of+aflatoxin+production+by+various+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates.</a> Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).</li>
<li>Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nutrients+in+substrates+of+different+grains+on+aflatoxin+B1+production+by+Aspergillus+flavus%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus.</a> BioMed Research International. 2016, (2016).</li>
<li>Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-harvest+aflatoxin+contamination+and+soluble+sugars+of+peanut%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Science%22%5BJournal%5D)">Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut.</a> Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması var.

Verim kayıp patojenler ve zararlıları nedeniyle tarımsal ürün içinde küresel bir sorun20olduğunu. Şu anda, uygulama sentetik mantar ilaçları ve böcek ilaçları kontrol bitki patojenleri ve zararlıları için baskın anlamına gelir, ama bu biochemicals gıda ve yem içinde kalan toksisitesi insan ve hayvan sağlık21için ciddi bir tehdit oluşturabilir. Gıda ve yem kırpma olarak Mısır ekonomik önemi göz önüne alındığında, azalma veya aflatoksin kirlenme ortadan kaldırılması son derec...

Mikotoksin kirlenme mantar Azomonas, Aspergillus Fusarium, Penicilliumve Alternaria tarafından gıda büyük bir sorundur ve yem bitkileri yetiştirilen dünya çapında1,2,3. Bu pitopatojenik mantarlar arasında Aspergillus kırpma değeri ve insan ve hayvan sağlığı en fazla olumsuz etkiye sahiptir. Aspergillus flavus (A. flavus) Mısır, pamuk ve fıstık gibi petrol zengin bitkileri bozar ve güçlü kanserojen, aflatoksin yanı sıra çok sayıda toksik ikincil metabolit (SMs) üreten bir fırsatçı bitki patojeni var. Mısır önemli bir besindir ve dünya çapında yetiştirilen bitki besleme ve kirlenme A. flavustarafından son derece duyarlı olduğunu. Aflatoksin kirlenme üzerinde ekonomik etkisini kaybeder ve Mısır düşük değeri olarak 686.6 milyon dolar/yıl ABD2 öngörülen değişiklikler ile küresel iklim olabilir, aflatoksin etkisi Mısır ile daha büyük ekonomik kayıplara neden olabilir tahmini olarak 1.68 Milyar dolar/çevre gelecek2yılda yüksek. İnsan ve hayvan aflatoksin olumsuz ekonomik ve sağlık etkileri göz önüne alındığında, Mısır denetiminde öncesi hasat aflatoksin gıda aflatoksin kirlenmesini önlemek ve yem ürünleri için en etkili yolu olabilir.
Saat4önemli miktarda gerektiren öncelikle üreme yoluyla, yoğun son birkaç on yıl içinde kullanılan Mısır aflatoksin direniş için büyük öncesi hasat denetim yaklaşımdır. Son zamanlarda, biyolojik büyük ölçekli alan uygulamaları5,6' aflatoksin azaltma içinde bazı başarı elde etti. Biyolojik yanı sıra, uygulama 'Ana bilgisayar indüklenen Gene susturmak' RNAi aracılığıyla (HIGS) gibi son teknoloji moleküler araçlarından ve direnç ilişkili proteinlerin transgenik ifade A. flavus büyüme ve aflatoksin azaltılması bazı başarı olmuştur üretim ise küçük ölçekli laboratuvar ve alan çalışmaları. Bu yaklaşımların Şu anda gelecekteki manipülasyon için yeni potansiyel A. flavus gen hedefler belirlenmesi ek olarak optimize edilmiş.
Doğrudan transgenik kontrol stratejilerinin potansiyel hedefleri olarak mikotoksin üretimi söz konusu genlerin yanı sıra mantar amylases erken aşamalarında başarılı patogenez ve mikotoksin üretimi korumak kritik bir rol oynamaktadır gösterilmiştir Ana bilgisayar bitki enfeksiyonu. Pythium pleroticum (zencefil köksap rot nedensel Ajan), birkaç örnekler nerede patojenitesi ve α-amilaz ifade ve aktivite arasında pozitif korelasyon gözlendi Fusarium solani (karnabahar solgunluk nedensel Ajan), 7,8. α-amilaz etkinliği gen nakavt veya devirme yaklaşımlar ile inhibisyonu mantar büyüme ve toksin üretimi olumsuz yönde etkiler. Bir α-amilaz nakavt mutant A. flavus ve nişasta substrat veya degermed mısır çekirdekleri9tarihinde yetiştirilen aflatoksin üretmek bulamadı. Benzer şekilde, Fusarium verticillioides içinde bir α-amilaz nakavt zorlanma fumonisin B1 (mikotoksin) Mısır çekirdekleri10enfeksiyon sırasında üretmek başarısız oldu. Daha yeni bir çalışmada, Gilbert ve ark. (2018) bir RNAi tabanlı yıkmak A. flavus α-amilaz ifade HIGS aracılığıyla A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim sırasında Mısır çekirdek enfeksiyon11 azaltılacağını gösterdi .
α-amilaz faaliyet belirli inhibitörleri de aşağı-Yönetmeliğin α-amilaz ifade elde gibi benzer sonuçlar doğurmuştur. 14-kDa tripsin-α-amilaz inhibitörü Mısır satırlarından A. flavus12' ye dayanıklı malzemelerin yalıtım ve mantar direnç bir α-amilaz inhibitörü olan rolüne ilk rapor geldi. Daha fazla Fakhoury ve Woloshuk bir 36-kDa α-amilaz inhibitörü benzeri protein (AILP) tanımlaması liderliğindeki tarafından bitki türlerinin birkaç yüz sümbül fasulye, Lablab purpureus L.13taneleri tarama. Lektin-arcelin-α-amilaz inhibitörü ailesine ait AILP andıran lektinlerinin peptit dizisi ortak fasulye14,15bildirdi. Saf AILP memeli tripsin ve daha fazla tüp bebek karakterizasyonu A. flavus büyüme ve conidial çimlenme13önemli inhibisyonu gösterdi doğru inhibitör herhangi bir faaliyet göstermez. Sunulan raporları burada açıkça gösterir α-amilaz hedef patojenler veya nişasta seferberlik (α-amilaz faaliyetleri ile) bağlı çözünür şekerler edinimi sırasında bir enerji kaynağı olarak zararlıları sınırlamak için denetim yaklaşımlar olarak hizmet edebilir onların Ana tesisleri ile patojenik etkileşim.
Alfa-amilaz A. flavus patojenitesi9,10,11ve olarak güçlü bir anti-A. flavus Ajan (α-amilaz inhibisyon/antigrowth)13AILP önemini göz önüne alındığında kritik olduğu bilinmektedir, transgenik mısır bitkileri Lablab AILP ifade oluşturulan gen bünye CaMV 35S organizatörü altında. Mısır bu α-amilaz inhibitörü Contegra ifade A. flavus patogenez ve aflatoksin üretim Mısır çekirdek enfeksiyon sırasında karşı etkili olup olmadığını araştırmak için hedefi oldu. Bizim sonuçlar önemli ölçüde AILP ifade transgenik mısır çekirdekleri A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim çekirdek enfeksiyon sırasında azaltılmış gösterilmektedir.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Caisson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnanılmaz Marine Goop</td><td>Eklektik Ürünler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch CFX96 Gerçek Zamanlı Sistem</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Falcon Doku Kültürü Kapları, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 5424 Mikrosantrifüj</td><td>Fisher Scientific Erlenmeyer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tıpalı şişe, 50 mL</td><td>Ace Glass</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoroQuant Afla</td><td>Romer Labs</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>Yivli Kalitatif Filtre Kağıdı Daireler, 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>Kuvvet Hava Fırını</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Öğütücü 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>Geliştirilmiş PolyVinylAlcohol Organik Solvente Dayanıklı Eldivenler</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Innova 44 İnkübatör Çalkalayıcı</td><td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Sentez Kiti</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>sıvı Azot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Düşük Formlu Griffin Beherler, 100 mL</td><td>DKW Yaşam Bilimleri</td><td>14000-100</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metilen Klorür</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nexttec Bitkiler için 1 adımlı DNA İzolasyon Kiti</td><td>Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse E600 mikroskop, Nikon DS-Qi1 kameralı</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ25 stereomikroskop, C-HGFI Episkopik Aydınlatıcı ve Andor Zyla 4.2 sCMOS kamera</td><td>ile Nikon</td> Nunc Kare Biyotahlil Kapları ThermoFisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Phire Plant Direct PCR Kiti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F130WH</td><td></td></tr><tr><td>Polikarbonat Şişeler, 15 ml</td><td>OPS Teşhis</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>Patates Dekstroz Suyu Çıtçıtlı Kapak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, 22 mm</td><td>DKW Yaşam Bilimleri</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat dibazik heptahidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektrum Tesisi Toplam RNA Kiti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50</td><td></td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik Taşlama Bilyaları, 3/8''</td><td>OPS Teşhisi</td><td>GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>Karıştırma Plakası</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sinerjisi 4 Florometre</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Termal Döngüleyici</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 suyu</td><td>Campbell's</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Kalitatif Sınıf Düz Levhalar, Sınıf 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>Bilekten Hareketli Çalkalayıcı</td><td>Burrell Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

aspergillus flavus büyüme ve transgenik mısır ifade α-amilaz inhibitörü lablab purpureus l. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Aflatoksin kontaminasyonu gıda ve yem bitkileri dünya çapında büyük bir sorun olduğunu. Mısır ve diğer petrol zengin bitkileri yanı sıra insan ve hayvan sağlığı için ciddi tehdit poz fıstık gibi kırpma değeri önemli ölçüde azaltmak güçlü kanserojen aflatoksin, mantar Aspergillus flavus (A. flavus) tarafından üretilen vardır. Geleneksel ıslah, direnç ilişkili protein ve RNA müdahale (RNAi) transgenik ifadesi de dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar-ana bilgisayar kaynaklı gene kritik A. flavus susturmak dayalı gen hedefleri, değerlendirilir artırmak için aflatoksin direnç duyarlı bitkileri. Son çalışmalar α-amilaz A. flavus patogenez ve aflatoksin üretim, bu gen/enzim düşündüren önemli bir rol A. flavus büyüme ve aflatoksin üretim azaltmak için potansiyel bir hedeftir göstermiştir. Bu bağlamda çalışmada Mısır A. flavuskarşı bir Lablab purpureus L. α-amilaz inhibitörü benzeri protein (AILP) kapaklı ifade (altında bünye CaMV 35S organizatörü kontrolünü) değerlendirmek için yapılmıştır. AILP hangi A. flavus α-amilaz enziminin bir rekabetçi inhibitörü ve lektin-arcelin-α-amilaz inhibitörü protein ailesine ortak fasulye ait bir 36-kDa proteindir. İn vitro çalışmalar mevcut iş önce AILP rolünde inhibisyon A. flavus α-amilaz aktivitesi ve mantar büyüme gösterdi. Mantar büyüme ve olgun çekirdekleri aflatoksin üretim A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak gerçek zamanlı olarak takip. Bu çekirdek tahlil (KSA) eleme kurmak basit ve güvenilir ve tekrarlanabilir veri enfeksiyon ve sayısal yaymak ölçüde Pangenez ve transgenik hatları değerlendirme için sağlar. Floresans GFP zorlanma mantar için yakından ilişkili büyüme ve uzatma tarafından aflatoksin değerleri için iyi ilişkili.  Bu ön bilgi aflatoksin direncini artırmak için Mısır gibi ticari açıdan önemli bir ürün uygulamak için mevcut iş amacı oldu. Bizim sonuçları hangi, sırayla, aflatoksin düzeyleri %62-%88 azalma tercüme AILP ifade transgenik mısır çekirdekleri A. flavus büyüme % 35-%72 azalma gösterir.

Mısır dönüştürme ve Transgenik bitkilerin moleküler tarama
Mısır Hi-II satırlarının olgunlaşmamış embriyo Lablab purpureus AILP gen CaMV 35S kontrol altında ifade son bitki hedef vektör içeren Agrobacterium tumefaciens EHA101 zorlanma kullanılarak dönüştürülen organizatörü. Beş bağımsız olarak dönüştürülmüş Mısır satır T6 nesil sonraki çalışmaları için gelişmiş. Transgenik Mıs...

Aspergillus flavus büyüme ve aflatoksin üretim mısır çekirdekleri antifungal bir protein ifade içinde analiz etmek için bir iletişim kuralı mevcut burada.  A. flavus GFP ifade etmek zor kullanarak biz izlenen enfeksiyon ve gerçek zamanlı olarak olgun çekirdekleri içinde mantar yayılmasını. Tahlil hızlı, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Burada aspergillus flavus büyümesini ve mısır çekirdeklerinde antifungal proteini ifade eden aflatoksin üretimini analiz etmek için basit bir çekirdek tarama analizi salıyoruz. Aspergillus flavus suşunu ifade eden yeşil floresan protein kullanarak mantarın enfeksiyonuve olgun çekirdeklerde yayılmasını gerçek zamanlı olarak izliyoruz. Bu basit tsay, mısır çekirdeğinin Aspergillus flavus enfeksiyonuna ve Aflatoksin üretimine karşı dayanıklılığını değerlendirmek için güvenilir bir araç sağlar.Olgun çekirdekler üzerinde kontrollü koşullar altında yapılan bu laboratuvar tahlil sonuçları iyi alan koşulları altında enfeksiyon sonuçları ile ilişkilidir. Prosedürü gösteren Dr.Rajtilak Majumdar, bizim laboratuvar bir postdoc, Christine Sickler ve David Ambrosio ile birlikte, biyolojik bilim teknisyenleri de bizim laboratuvardan olacaktır. Başlamak için, ksa kapaklar oluşturmak için bir Petri kabında tutkal 20 iki mm snap kapaklar.Tutkal kapaklar kullanmadan önce 48 saat kurumasını bekleyin. Biyolojik bir güvenlik kabininde suda %70 etanol içeren kare bir biyoassay tepsisi püskürtülür. Tepsinin havası kurusun.Kuru tepsiye steril kromatografi kağıdı ekleyin. %70 etanol ile KSA kapaklarının dokuzunu püskürtün ve havanın kurumasını bekleyin. Sonra bioassay tepsiye kapaklar yerleştirin.Test edilen her transgenik mısır hattı için 20 adet hasarsız çekirdek seçin ve bunları 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Bir masa üstü stereo mikroskop kullanarak sadece zarar görmemiş çekirdekleri titreşme için seçin. Hasarlı çekirdekler Aspergillus saldırısına daha yatkındır ve daha fazla Aflatoksin üretir, bu nedenle sonuçları çarpıtarak ve çeşitliliğin gerçek antifungal veya antimikrobiyal özelliklerini temsil etmez.Her tüpe %70 etanol ekleyin. Ara sıra yavaşça sallayarak çekirdekleri dört dakika sterilize edelim. Bu yavaşça etanol dökün ve yavaşça steril deiyonize su çekirdekleri durulayın sonra üç kez.V8 ortamda yetiştirilen GFP ifade Eden 70 Adet Aspergillus flavus lekesi altı günlük bir kültür elde edin. Deiyonize suya 20 ml steril %0.02 Triton X-100 ekleyin. Ve sporları kazımak için steril bir döngü kullanın.İnokül kapalı Pipet ve 300 ml steril bir kabına aktarın. %0.02 Triton X-100 ile beş kat seyreltme hazırlayın ve spor sayımı yapmak için hemositometre kullanın. Ml başına dört milyon spor konsantrasyonu ile 100 ml elde etmek için gerekirse tekrar seyreltin.Boş bir kabın içine inoculum dökün. Steril bir 300 ml kabıiçine çekirdekleri yerleştirin bir karıştırma çubuğu ile ve üç dakika karıştırın. Forceps kullanarak bioassay çanak çekirdekleri transfer, her kap içine sadece bir çekirdek yerleştirmek için emin olun.Her bioassay tepsisinin altına 30 ml deiyonize su ekleyin. Ve 7 gün boyunca 31 derecede kuluçkaya yattı. A.flavus ile aşı yedi gün sonra, mikroskobik analiz ve fotoğraf için belirlenmiş dört çekirdekleri fotoğraf çekmek.Sonra çekirdeklerin dış temizlemek için yumuşak bir doku ve deiyonize su kullanın. Çekirdeklerin uzunlamasına bölümlerini gerçekleştirin ve hemen floresan mikroskop altında fotoğraf çekin. Çekirdekleri analize hazırlamak için kalan çekirdeklerin dışını yumuşak bir doku ve deiyonize su ile temizleyin.Bir rep oluşturan dört çekirdekleri, iki paslanmaz çelik topları içeren 15 ml vidalı kapak polikarbonat şişe içine yerleştirin. Hemen sıvı azot şişeleri dondurmak ve daha fazla işleme ve analiz ile devam etmeye hazır olana kadar 80 santigrat derece saklayın. Hazır olduğunuzda, çekirdekleri dondurucudan çıkarın ve 1500 rpm'de üç dakika boyunca öğütmek için bir homogenizer kullanın.Tüm değerlerin numuneleri temsil edilebilmeleri için GFP analizi, Aflatoksin tayini ve moleküler analiz için aynı zemin malzemelerini kullanın. En az üç çoğaltma önerilirken, kaliteli çekirdeklerin kullanılabilirliğine bağlı olarak daha fazlası her zaman daha iyidir. Bu çalışmada maize HI-II hatlarının olgunlaşmamış embriyoları, karnabahar mozaik virüsünden 35S organizatörü kontrolü altında Lablab purpureus AILP genini ifade eden son bitki hedef vektörü içeren Agrobacterium tumefaciens EHA101 suşu kullanılarak dönüştürülür.Hedef AILP geninin PCR amplifikasyonunda sadece transgenik mısır hatlarında gözlenen 548 bp amplikon bulundu. AILP geni transgenik hatlarda ekspresyon gösterirken kontrol tesislerinde AILP ekspresyonu gözlenmedi. Erken evre çimlenme sporları 20 saat boyunca genç transgenik mısır bitkilerinden ham yaprak ekstrelerine maruz kalır.Transgenik yaprak ekstrelerine maruz kalan sporlardan kaynaklanan yüksek tam uzunluk, negatif kontrole göre %58-80 oranında azalma göstermektedir. Kullanılan A.flavus suşu, mantar büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini ve ölçülmesini sağlayan bir GFP muhabiri içerir. Transgenik AILP çekirdeklerinde izojenik negatif kontrole göre GFP floresansında anlamlı azalma gözlenmektedir.AILP hatları için mantar büyümesinde sırasıyla %4 ve 5, %69 ve %72'de önemli bir azalma görülmektedir. Diğer satırlar kontrol çekirdeklerine kıyasla %35 ila %60 oranında azalma gösterir. AILP çekirdeklerinde kontrole göre Aflatoksin içeriğinde %62-88'lik bir azalma gözlendi.Dördüncü satırda g başına 486 ng ile en düşük Aflatoksin içeriğine sahip olduğu görülürken, onu çekirdeklerde g başına 640 ile 1498 ng arasında değişen diğer satırlar takip eder. Bu prosedürü takiben, GFP'yi ölçmek için florometre kullanmak ve mantar büyümesi gibi ek yöntemler gerçekleştirilebilir. Aflatoksin kantitasyonunu gerçekleştirmek için immün tabanlı ticari kitler veya HPLC veya EPLC kullanılabilir.KSA'nın kullanılabilirliği, aflatoksin kontaminasyonuna karşı direnci belirlemede hızlı ve basit bir araç sağlar. Farklı mısır ıslah hatları bu teknik kullanılarak hızlı bir şekilde değerlendirilebilir. Çekirdek tarama töztehlikeli olmasa da, operatör kendini Aspergillus flavus sporlarına maruz kalmaktan korumalı, uygun koruyucu ekipman kullanmalıdır.

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Tohum bulaşmasını mantarlar tarafından tahılların yıkım daha iyi bitki-patojen etkileşimleri anlamak için sayısız araştırma çabaları açtı. Bir laboratuvar ortamında tohum-mantar etkileşimleri çalışmak için, mantar üretimi, biyokütle, ve çekirdek biyoanalizlerin kullanarak mikotoksin kontaminasyonu ölçümü için sağlam bir yöntem geliştirdi.

Çekirdek biyoanalizlerin kullanarak Fungal Kolonizasyon, Sporogenesis ve Mikotoksin Üretimi Kantitasyonu

Biyotrofik patojen Ustilago maydis ile mısır ve teozinte bitkileri aşılamak için iğne enjeksiyon yönteminin kullanımı açıklanmıştır.  İğne enjeksiyonu aşılama yöntemi, mantar patojeninin, patojenin eksrezi oluşumu yoluyla bitkiye girdiği bitki yaprakları arasında kontrollü bir şekilde teslimini kolaylaştırır. Bu yöntem son derece verimlidir, U. maydisile tekrarlanabilir aşılar sağlar.

Ustilago maydis'in Mısır ve Teosinte Hatlarında Patojenitesini Değerlendirmek İçin Hızlı ve Verimli Bir Yöntem

Bu fungus, Aspergillus flavus aflatoksin sentezi genleri sessizleşme RNA-parazit sinyalleri içeren yerfıstığı tohumlarda aflatoksin ve transgen ekspresyonunun analizi için bir yöntem ortaya koymaktadır. Bitkilerde mikotoksin RNAi aracılı kontrolü önceden bildirilmemiştir.

Yerfıstığı aflatoksin RNAi aracılı Kontrol: Yöntem Yerfıstığı Mikotoksin Üretim ve Transgen Anlatım Analiz /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem

Genetik Ustilago Maydis'in karalamak mantar işlemek için Biz sağlam bir gen değiştirme stratejisini açıklar. Bu protokol enfeksiyon fenotipleri araştırmak için silme mutantlarını üretmek açıklar. Bir floresan protein etiketi kodlayan bir sekansı ilave olarak, örneğin, arzu edilen herhangi bir şekilde, genleri değiştirme uzatılabilir.

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Bu eser için üç farklı Mısır dokuların içine salgılanan Mısır proteinlerin teslim yerinde bir Ustilago maydis Truva atı zor klonlama açıklar.

Ustilago maydis bir Truva atı olarak In Situ teslim, Mısır proteinler için kullanma.

Bitki morfojenik genler inatçı genotiplerin genetik dönüşümlerini iyileştirmek için kullanılabilir. Burada açıklanan bir Agrobacteriumaracılı genetik dönüşüm (QuickCorn) üç önemli kamu mısır inbred hatları için protokoldür.

Agrobacterium-Rekalsitrant Mısır Inbred Hatları Morfojenik Genler Kullanarak Aracılı Olgunlaşmamış Embriyo Dönüşümü

Tilki kuyruğu mozaik virüsünün ve şeker kamışı mozaik virüslerinin mısır fidelerine aşılanması için Agrobacterium bazlı enjeksiyon (agroinjection) protokolü sunulmaktadır. Bu şekilde aşılama viral enfeksiyona, belirteç genlerinin virüs kaynaklı gen susturmalarına ve GFP'nin viral aşırı ekspresyonuna yol açar.

Rekombinant Foxtail Mozaik Virüs ve Şeker Kamışı Mozaik Virüs Bulaşıcı Klonlar ile Enjeksiyon ile Mısır Fidelerinin Doğrudan Agroinokokülasyonu

Bu makale, mantar bitki patojenleri ile mısır etkileşimlerinin tekrarlanabilir sitolojik, fizyolojik ve moleküler çalışmaları için ayrılmış mısır yaprağı kılıflarını kullanan optimize edilmiş bir aşılama protokolünü detaylandırmaktadır. Yaprak kılıfları, sabitlenmemiş dokularda canlı bitki ve mantar arasındaki hücresel etkileşimlerin gerçek zamanlı gözlemini kolaylaştırır.

Mantar yaprakları mısır patojenlerinin neden olduğu enfeksiyonun canlı hücre görüntülemesi için müstakil mısır kılıfları

RIDL® (Baskın Ölümcül Taşıyan Böceklerin Salınımı) sistemini kullanarak Aedes aegypti'nin popülasyon baskısını elde etmek için çok sayıda erkek sivrisinek salınmalıdır. Bu, maksimum sayıda yüksek kaliteli erkek sivrisinek elde etmek için güvenilir sistemler sağlamak için kitlesel yetiştirme tekniklerinin ve teknolojisinin kullanılmasını gerektirir.

Brezilya'da Saha Sürümleri için Genetiği Değiştirilmiş Aedes aegypti'nin Seri Üretimi

Mikroplaka dayalı işlemler hücre dışı enzim aktivitesi, kolorimetrik veya florometrik analizi için tarif edilmiştir. Bu işlemler yönetilebilir bir süre içinde çevre örneklerin çok sayıda bu tür aktivitenin hızlı analizi için izin verir.

Yüksek Verimli Mikroplate Tahliller kullanarak Waters, Topraklar ve tortulları Mikrobiyal Ekstrasellüler Enzim Aktivitesi Belirlenmesi

Keşfedin, transgenik mısır çekirdeklerinde Aspergillus flavus büyümesini ve aflatoksin üretimini analiz etmek için basit bir çekirdek tarama testi. Bu yöntem, antifungal proteinlerin etkinliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

Aspergillus flavus büyüme ve transgenik Mısır ifade α-amilaz inhibitörü Lablab purpureus L. gelen aflatoksin üretim inhibisyonu

Daha fazla video keşfet