Tohum ve bir biyosentetik doku Mühendisliği trakeal greft bir fare modeli implantasyonu

Doku mühendisliğiyapılan trakeanın klinik uygulamaları greft darlığı ve gecikmiş epitelizasyon nedeniyle sınırlandırılmıştır. Ortotopik trakeal replasman bir fare modeli rejenerasyon sürüş hücresel mekanizmaların çalışma izin verir. Hava yolunun uzun segmentli defektleri mevcut tedavilerin tedavi edebildikleri nden daha fazla olabilir.

Doku mühendisliği trakea bu koşullar için bir yedek organ oluşturmak için potansiyel sunuyor. Bu model transgenik ve soy izleme özelliği olan hayvanlara uygulanabilir. Daha sonra greft rejenerasyonuna katkıda bulunan konak faktörleri modüle edebiliriz.

İskelelerin üretimindeki en önemli zorluklardan biri, elektrospinning parametrelerinin her seferinde aynı olduğunu ölçmek ve belirlemek olacaktır. Bu nedenle, her bir iskele ürettiğinizde, iskelelerin her seferinde aynı olduğundan emin olmak için kolektöre mesafeyi, nemi ve sıcaklığı ölçmeniz gerekir. Bu modelin başarısı için kritik mikrocerrahi tekniklerin iyileştirilmesi ve işlem boyunca spontan ventilasyon alabilmek için doğru anestezi düzleminin bakımıdır.

Ev sahibi trakea yaklaşık bir milimetre iç çapı olduğundan, greft ve yerli doku işleme ve dikiş yerleşimi önemli ve en iyi görsel gösterilmiştir. Sekiz ağırlık yüzde polietilen tereftalat eriterek başlayın, veya PET, heksafloroisopropanol ve 60 santigrat derece ye çıkan çözüm ısıtma. Çözelti ısıtılırken, PET çözeltisi soğuduktan sonra çözeltileri birleştirerek, hekzafloroisopropanol'de yüzde üç ağırlık poliüretan veya PU çözün.

Polimer karışımı ile 20-gauge künt ucu iğne ile donatılmış bir 60 mililitrelik şırınga yükleyin. Şırıngayı ve iğnede 14 kilovolt pozitif olacak şekilde ayarlanmış yüksek voltajlı DC güç kaynağını, eksi üç kilovolta ayarlanmış başka bir yüksek voltajlı DC güç kaynağını, saatte beş mililitrelik akış hızına ve polimeri dakikada 350 dönüşte 350 dönüşe dönen bir milimetre çapındaki paslanmaz çelik çubuk üzerine elektrospin lemek için 20 santimetrelik bir uç-substrat mesafesini kullanın. 300 mikrometrelik iskele duvar kalınlığı elde edilene kadar elektrospinning devam edin.

Sonra, çubuk kapalı iskele kaydırın, herhangi bir kalıntı çözücü kaldırmak için bir gecede vakum altında iskele yerleştirin, ve yaklaşık 15 dakika boyunca kare bir ultraviyole ışık dozajı ile iskele sterilize 350 milijoules santimetre santimetre. Steril koşullar altında, altı ila sekiz haftalık, kadın, C57-Siyah/6 fare ince makas ve mikro-Adson forceps ile arka bacaklardan deri kaldırmak ve fasya ve tendonlar kaldırmak için Dumont sayısı beş forceps ve Dumont sayısı 5/45 forceps kullanın. Kemikleri her iki uçtan da kesilebilmek için ayırın ve kemik iliğini 30 mililitre RPMI ortamı içeren bir Petri kabına atmak için 25 kalibrelik bir iğneyle donatılmış beş mililitrelik bir şırınga kullanın.

Tüm kemikler temizlendiğinde, kemik iliğini 70 mikrometrelik naylon hücresüzden 50 mililitrelik konik bir tüpe filtreleyin ve tüpü biyogüvenlik kabinine aktarın. Filtrelenmiş mononükleer hücre solüsyonu, beş mililitre lik polisukroz ve sodyum diatrizoat içeren 15 mililitrelik bir tüpün kenarına katmanları karıştırmadan ekleyin ve plazmayı yoğunluk gradyan ayrımı ile beyaz ve kırmızı kan hücrelerinden ayırın. Santrifüj sonunda, kemik iliği mononükleer hücrelerden oluşan orta açık tabakayı toplayın ve kemik iliği mononükleer hücrelerini pbs'de bire bir oranında santrifüj le yıkayın.

Peleti ikinci bir yıkama için beş mililitre PBS'de yeniden askıya alın, ardından saymak için 10 mililitre taze RPMI ortamında yeniden süspansiyon alın. Sonra, ek bir santrifüj ile hücreleri toplamak ve taze RPMI konsantrasyonu beş mikrolitre başına yedi hücre ye bir kez 10 hücreleri seyreltmek. İskeleyi tohumlamadan önce, polimeri gerektiği gibi beş milimetre uzunluğa kesin ve iskeleyi beş mikrolitre RPMI orta sıyla beş dakika boyunca ıslayın.

Kuluçka sonunda, fazla ortamı çıkarın ve iskele lümenini kemik iliği mononükleer hücre solüsyonunun beş mikrolitresi ile 10 dakika yükleyin. Daha sonra, iskelenin lümeninden 21 kalibrelik bir iğne yerleştirin ve grefti bir gecede 37 derecelik bir kantinde bir mililitre RPMI ortamına yerleştirin. Genel anestezi indüksiyon sonra, alıcı hayvan ayak sıkışma yanıt eksikliği onaylamak ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın.

Çeneden köprücük kemiğine kadar cerrahi alandaki tüyleri kırpın ve hayvanı sırt örme pozisyonunda cerrahi bir pedin üzerine yerleştirin. Aseptik tekniği kullanarak, ardışık povison-iyot, %70 etanol, povison-iyot silme serisi ile cerrahi bölgeyi dezenfekte edin ve fareyi saat 12'de kafayla diseksiyon mikroskobun altına hareket ettirin. Köprücük kemiğinden hyoid kemiğe orta hat kesisi yapmak için ince makas ve mikro-Adson forceps kullanın ve kesi içine kendi kendini koruyan Colibri retractor eklemeden önce fasya temizlemek için Dumont sayısı beş ve yedi numaralı ince forceps ve steril pamuklu bez kullanın.

Tiroid kıkırdak, krikoid kıkırdak ve trakea ortaya çıkarmak için kayış kasları açmak için forceps kullanın, ve açıkça doku her iki tarafında paralel çalışan tekrarlayan laringeal sinirler den trakea ayırmak, özofagus trakea çevresel ayrılması takip. 20-gauge iğne ve cerrahi marker kullanarak, trakea ön kısmını leke. Bir çift Vannas-Tubingen yay makası ve bir çift Dumont yedi numaralı ince keçekullanarak trakeanın üç halkalı bölümünü rezeksiyon etmek için üçüncü trakeal kıkırdak halkasının altında bir kesi yapın.

İnce kavisli çiller ile trakea tutarak, geçici bir trakeostomi oluşturmak için sternum için trakea distal ucunu güvenli steril 9-0 naylon dikiş kullanın, ve greft ön kısmını leke 20-gauge iğne ve cerrahi marker kullanın. Greftimplantiçin, 9-0 steril naylon sütür kullanın, Dumont sayısı yedi ince forceps, ve proksimal posterior eklemek için bir iğne tutucu, proksimal lateral, ve proksimal-ön dikiş, ve hayvan açmak 180 derece. Fare pozisyondayken, geçici trakeostomi serbest, ve distal anastomoz kolaylaştırmak için greft ön kısmından beş milimetre uzaklıkta lateral bir kesi yapmak.

Distal anastomoz tamamlamak için, proksimal anastomoz benzer bir şekilde dikiş yerleştirin, ve greft pozisyonu ve kayış kasları yeniden yaklaşık. Daha sonra, 9-0 steril naylon dikişleri ile kesi kapatın ve tam iyileşme kadar izleme ile bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilen bir kurtarma kafesi tek başına hayvan yerleştirin. İmplantasyondan iki hafta sonra, doku yapımı trakeal greft doku bölümlerinde bazal hücre likeratin beş ve 14 boyama ile birkaç bazal epitel hücre görülebilir.

Bazal hücreler de implantasyondan yedi gün sonra greftin luminal yüzeyinde tespit edilir. Eksplantasyon ve histolojik analizler sonucunda greft darlığı, solunum sıkıntısı ve stridor belirtileri gösteren greft implantlı farelerde ana etken olarak tanımlanmıştır. Greft ve yerli trakeanın teleskopik cerrahi tekniğin bir sonucu olarak sık rastlanan bir bulgu olduğunu unutmayın.

F4/80 için boyama bazal epitel hücrelerinvarlığı ile birlikte greft stenotik bölgede konak makrofajlar ortaya koymaktadır. Tekrarlayan laringeal sinirlerin manipülasyonundan kaçının ve anastomozda hava geçirmez bir mühür sağlamak için proksimal ve distal dikişlerin yerinde olduğundan emin olun. Bu protokol biyogüvenlik seviyesi tek ajan farelerden elde edilen kemik iliği mononükleer hücreleri ile ilgili olduğundan, kontaminasyonu önlemek için uygun kişisel koruyucu ekipman giymek önemlidir.