Name: Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-29T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Keşfedin, ilaca bağlı otoimmün hepatit patogenezinde cinsiyet farklılıklarını incelemek için BALB/c farelerinde tekrarlanabilir bir immünizasyon modeli. Bu yöntem karaciğer hastalıkları araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Njoku, bu modelin formülasyonuyla sonuçlanan rehberliği ve anlayışlı tartışmaları için Dr. Noel R. Rose, MD PhD'ye teşekkür etmek istiyor.

Tüm prosedürler hayvan bakım ve kullanım komitesi tarafından onaylandı.
1. Hepatik S-100 sitozolik proteinlerinin veya bir CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu
NOT: İlk olarak, trifloroasetillenmiş S100 (TFA-S100) ve trifloroasetillenmiş CYP2E1 epitopunu (TFA-JHDN5) hazırlayın. Çünkü bağışıklamalar için sinjenik S100 proteinlerine ihtiyaç vardır ve immünojeni üretmek için BALB / c fareleri gereklidir. Preparat büyük miktarda immünojen verir; Bu nedenle, bu bölümü yılda yaklaşık dört kez gerçekleştirmeyi bekleyin. TFA-JHDN5'i yapmak için aynı yöntem kullanılacaktır. CYP2E1 epitopu (JHDN5), GII / FNN / GPT / WKD / IRR / FSL / TTL, sıralanabilir veya satın alınabilir.
<ol><li>Karaciğerin S100 fraksiyonunun izolasyonu.
	<ol>
<li>4 - 6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile 5-10 BALB / c farenin sedasyonunu takiben, kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın.</li>
		<li>Mikrocerrahi makas kullanarak, orta hat kesisi kullanarak karın içi içeriği açığa çıkarın ve kanı çıkarmak için inferior vena kavada küçük bir kesim yapın.</li>
		<li>Portal ven içine 24 gauge anjiyokateter yerleştirin ve karaciğeri 4 ° C'de bir su banyosunda 40 mL fosfat tamponlu salin (PBS) pH 7.4 ile 10 mL / dak perfüze edin. Biriken karaciğerleri çıkarın ve tartın ve küçük parçalara (10 – 15 mm) kesin. NOT: Ötenazi, intraperitoneal ilave ketamin / ksilazin (80 mg / kg: 8 mg / kg) enjeksiyonu, ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.</li>
		<li>Üreticilerin tavsiyelerine göre Komple Proteaz inhibitörü Kokteyl tabletleri ile desteklenmiş sakkaroz (250 mM) -TRIS (10 mM)- EDTA (1 mM) homojenizasyon tamponunun (pH 7.4) ağırlığının 4 katı ekleyin (bkz. 15 mL'lik bir polipropilen tüpte, genel bir laboratuvar doku homojenizatörü kullanarak, pürüzsüz olana kadar buz üzerinde orta hızda homojenize edin. Homojenizasyon sırasında dokunun ısınmasını önlemek için buz üzerinde homojenize edin.</li>
		<li>Karaciğeri 10 dakika boyunca 1500 x g'de homojenize eden santrifüj yapın ve ardından süpernatanı dökün. Süpernatantı 100.000 x g'de 1 saat boyunca santrifüj edin. Süpernatantı çıtçıtlayın ve -80 ° C'de saklayın. Süpernatant sitozolik S-100'dür.</li>
	</ol></li>
	<li>S100 ve JHDN5'in trifloroasetilasyonu NOT: S-100'ün lizin kalıntılarının ε-amino gruplarının trifloroasetilasyonu, Satoh18 prosedürüne göre gerçekleştirilecektir. Bu deneyin diyalizin son günleri hariç tüm bölümleri duman davlumbazında gerçekleştirilir.<ol>
<li>Bisinkoninik asit tahlili (BCA testi)7 kullanarak sitozolik S-100'ün toplam protein konsantrasyonunu belirleyin. 20 mg BALB/c fare S100 veya JHDN5 ila 10 mL'yi 50 mL'lik bir Erlenmeyer şişesinde dH2O ile seyreltin. 1N KOH ile pH'ı 10'a ayarlayın.</li>
		<li>Çözeltiye 4.7 mmol S-etiltriflorotiyoasetat (S-ETFA) ekleyin. KOH'u damlacık şeklinde yaklaşık 1 saat uygulayarak pH'ı 1N KOH ile 9.9 – 10.0 arasında tutun. Her reaksiyon için toplam KOH hacmini kaydedin.</li>
		<li>Çözeltileri ayrı diyaliz kasetlerine aktarın (Aşırı doldurmayın). Kasetleri günde üç değişiklikle 4 L dH 2 O'ya karşı72saat boyunca diyalize edin. Diyalizden sonra, TFA-S100 veya TFA-JHDN5'in son hacmini kaydedin ve ardından etiketli tüplere aliquot yapın. Dondurun ve –80 °C'de saklayın.</li>
		<li>Tahmini konsantrasyon, S100 veya JHDN5'in (mg cinsinden) başlangıç miktarının diyaliz sonrası son hacme (mL) bölünmesiyle belirlenir. Doğal protein19'un yüzde modifikasyonunu belirlemek için, her bir doğal ve TFA ile değiştirilmiş proteinin 1.0 mg'ını (son konsantrasyon 1.0 mg'dan büyükse) ayrı mermi tüplerinde dH 2 O ile 1.0 mL'yeseyreltin ve 1.0 mL dH2O kullanarak bir boşluk hazırlayın. TFA ile değiştirilmiş proteinin konsantrasyonu 1.0 mg'dan azsa, seyreltmeyin.<ol>
<li>96 kuyucuklu bir plakanın kuyularını ayırmak için, boş, doğal ve değiştirilmiş proteinlerden 50 μL ekleyin. Her bir oyuğa 50 μL% 4 NaHCO3 ve ardından 50 μL% 0.1 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit ekleyin.</li>
			<li>Plakayı 2 saat boyunca 40 ° C'de inkübe edin. Kuluçkayı takiben, her bir kuyucuğa 50 μL% 10 SDS ekleyin ve ardından 25 μL 1N HCl ekleyin.</li>
			<li>334 nm'lik OD'de okuyun ve daha sonra 334 nm'de absorbanstaki karakteristik düşüşü doğrulamak için her bir bileşiğin 200 – 600 nm arasındaki absorbansını kaydedin. Aşağıdaki formülü kullanarak lizin kalıntılarının TFA tarafından yüzde modifikasyonunu hesaplayın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59174/59174eq1.jpg">
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. Hepatiti indüklemek için farelerin bağışıklanması
NOT: DIH, BALB / c farelerinde, triflorasetil klorür (TFA), bir model ilaç-metabolit, TFA-S1006 veya TFA9, hepatit, otoreaktif T hücreleri ve CYP2E1 otoantikorlarını indükleyen TFA-JHDN5 tarafından kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu tarafından kovalent olarak değiştirilmiş karaciğer sitozolik proteinleri ile yapılan bağışıklamalarla modellenmiştir. Fareler, ilk immünizasyondan 2 hafta sonra dalak aktivasyon fazı ve granülositik inflamasyon ile karakterize 3 hafta boyunca hepatik bir faz sergiler. Dişi BALB / c fareleri bu modelde hepatite karşı erkeklerden daha hassastır.
<ol><li>0. günde, 6-8 haftalık BALB / c farelerini, boynun tabanında, eşit hacimlerde tam Freund adjuvanı (CFA) olarak emülsifiye edilmiş 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile deri altından bağışıklayın. 0. günde, fareleri arka ayaklardan birinde kas içinden 50 ng boğmaca toksini ile bağışıklayın. 7. günde, her farenin aynı immünojenin iki enjeksiyonunu almasını sağlamak için fareleri kuyruğun tabanında deri altından 200 μg TFA-S100 veya 100 μg TFA-JHDN5 ile eşit hacimlerde emülsifiye edilmiş TFA-JHDN5 ile bağışıklayın. NOT: Fareler, aşılamayı takip eden ilk 6 saat boyunca saatlik olarak ve daha sonra bir hafta boyunca günde en az iki kez izlenir. Fareler kambur duruş veya karıştırılmış kürk gibi ağrı veya sıkıntı belirtileri gösteriyorsa, lokal ACUC'ye uygun olarak analjezikler uygulanmalıdır. Önemli ağrı veya sıkıntı kaydedilirse, ötanazi gerekli olup olmadığını belirlemek için fareler bir veteriner tarafından değerlendirilmelidir.</li>
	<li>Akış sitometrisi kullanılarak tüm öz-proteinlere, öz-proteinlerin epitoplarına veya TFA haptenine CD4 + T hücresi immün yanıtlarının belirlenmesi
	<ol>
<li>Farelerin intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sedasyonunu takiben, adım 1.1.1'de tarif edildiği gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın ve ardından mikrocerrahi makas kullanarak karın içi boşluğu açığa çıkardıktan sonra dalağı tanımlayın. Dalağı pedikülde kesin ve PBS / % 2 fetal buzağı serumu (FCS) içeren bir Petri kabına yerleştirin. NOT: Ötenazi, farelerde intraperitoneal ek ketamin / ksilazin enjeksiyonu (80 mg / kg: 8 mg / kg), ardından servikal çıkık ve akciğerleri çökertmek için göğüs boşluğunun açılmasıyla indüklenecektir. Bu yöntem hayvanlara en az ağrı ve rahatsızlık verir. Bu yöntem, Amerikan Veteriner Hekimleri Birliği'nin Ötenazi Paneli'nin önerileri ile tutarlıdır.</li>
		<li>Buzlu cam slaytlar kullanarak hücreleri serbest bırakın ve 50 mL'lik konik polipropilen tüpe aktarın. PBS/%2 FCS ile hacmi 50 mL'ye çıkararak ve tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak 335 x g'de santrifüj yaparak yıkayın. Süpernatantı dökün ve bu adımı tekrarlayın.</li>
		<li>1 dakika boyunca 1 mL ACK Lysing arabelleği kullanarak kırmızı hücreleri çıkarın ve PBS/%2 FCS ile 50 mL'ye kadar ses getirin. 335 x g'de santrifüj yapın ve süpernatanı dökün.</li>
		<li>Hücreleri sayın. Hücreleri üreticinin talimatlarına göre karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca CFSE ile etiketleyin. Tek hücreli süspansiyonları, PBS / % 2 FCS'de kuyu başına 3x10 6 hücre / mL'lik6 kuyucuk plakasına askıya alın.</li>
		<li>Etiketli hücreleri CYP2E1, JHDN5 veya TFA-OVA (10 μg / mL) ile 37 ° C'de 72 saat boyunca% 5 CO2,% 95 havada (nemlendirilmiş) uyarın. Kuluçkadan sonra, hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-APC (1:100) ile boyayın ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analiz edin.</li>
		<li>CD4 + CFSE + hücrelerini tanımlamak için aşağıdaki geçit stratejisini kullanın: CD4 + CFSE + hücreleri, kapılı canlı hücrelerden tanımlanacak ve çoğalan hücrelerin histogramları olarak görüntülenecektir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bağışıklık sistemi hücrelerine sızan bağışıklık hücrelerinin immünize farelerden izolasyonu. 
	<ol>
<li>14. günde veya 21. günde karaciğerlere sızan bağışıklık hücrelerini izole etmek için, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile intraperitoneal enjeksiyonla anestezi yapın ve adım 1.1.1'de açıklandığı gibi uygun anestezi derinliğini onaylayın. 1.1.2'de tarif edildiği gibi mikro cerrahi makasla yapılan bir orta hat insizyonu kullanılarak laparotomi yapıldıktan sonra, portal veni 25 gauge iğne ile kanüle edin ve daha sonra böbrek damarlarının altındaki inferior vena kavayı kesin.</li>
		<li>Her karaciğeri 37 °C'lik bir su banyosunda 40 mL PBS ile 10 mL / dak akış hızında perfüze edin. Perfüzyondan sonra, mikro cerrahi makas kullanarak, karaciğeri hepatik pedikülde kesin, safra kesesini çıkarın ve ardından karaciğeri hilumda kesin.</li>
		<li>20 mL steril şırınga havanesi ve soğuk PBS kullanarak karaciğeri bir ağ paslanmaz çelik elek üzerinde bozun. Elde edilen hücre süspansiyonunu, 300 mesh elek kullanarak 50 mL önceden sterilize edilmiş santrifüj tüplerine filtreleyin. Soğuk PBS kullanarak her süspansiyonu 50 mL'ye getirin ve ardından süspansiyonu 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın.</li>
		<li>Süpernatantı atın ve daha sonra her peleti tedavi yoluyla yeni 50 mL tüplere havuzlayın (fare başına bir tüp önerilir; ancak, numuneler bir araya getirilirse, 2-4 pelet / tüp önerilir). Havuzlanmış peletleri 45 mL Percoll% 35 (PBS'de) ve 100 IU / mL heparin içinde askıya alın.</li>
		<li>Her tüpü 20 ° C'de 10 dakika boyunca 500 x g'de döndürün. Süpernatantı atın ve peleti 5 mL PBS'de askıya alın ve daha sonra buz üzerinde 10 dakika boyunca her pelete 1 mL ACK lizing tamponu ekleyin.</li>
		<li>Her tüpü PBS ile 50 mL'ye getirin ve 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Süpernatantı atın ve daha sonra hücreleri PBS / 2% FCS ile 370 x g'de 10 dakika boyunca santrifüjleme ile yıkayın. Hücreleri sayın.</li>
		<li>
Akış sitometrisi kullanılarak hücre tipinin analizi NOT: İşte indüklenmiş Foxp3+Treg'lerin nasıl algılanabileceğine dair bir örnek.<ol>
<li>1x106 hücreyi FcR bloke edici reaktif ile inkübe edin ve buz üzerinde 30 dakika boyunca CD4-FITC, CD25-PE ve CD45-PerCP'nin 1:100 seyreltilmesiyle lekeleyin. Daha sonra, hücreleri hücre içi olarak FoxP3-APC ile lekeleyin.</li>
			<li>Hücreleri 250 μL fiksasyon tamponu ile sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 3 gün içinde akış sitometrisi ile analize kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
			<li>Akış sitometrisi kullanarak karaciğer, dalak veya lenf düğümlerinden tek hücreli süspansiyonlarda indüklenen Foxp3 + Treg'leri tespit etmek için aşağıdaki geçit stratejisi önerilir: Canlı / Ölü Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre leke kitini kullanarak canlı hücreleri tanımlayın. Daha sonra, CD45 + (PerCP, klon RA3-6B2) olan karaciğer hücrelerine kapı ve CD45 + kapısından kapı CD4 + hücreleri (FITC, klonGK1.5). CD4 + hücrelerinden, CD25 + (PE, klon 7D4) ve FoxP3 + (APC, klon 3G3) hücrelerinin yüzdelerini tanımlayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Hepatit için karaciğer dokularının histolojik analizi
	<ol>
<li>21. günde, karaciğer bölümlerini (5 μm kalınlığında) % 10 nötr tamponlu formalin içinde sabitleyin ve Hematoksilin ve Eosin ile lekeleyin.</li>
		<li>Histoloji puanlarını önce düşük güçte (40X) ortalama 2 görüntülemede belirleyin ve 64X'te onaylayın. Doku bölümlerini aşağıdaki gibi puanlayın: Derece 0 = iltihap veya nekroz yok; Derece 1 = nekroz olmadan minör lobüler inflamasyon; Derece 2= kesitin %&lt;50'sini tutan lobüler inflamasyon; Derece 3 = kesitin ≥% 50'sini içeren lobüler inflamasyon; ve Grade 4 = nekroz ile iltihaplanma.</li>
	</ol></li>
	<li>Dalak ve karaciğerlerde doku sitokin düzeylerinin belirlenmesi. 
	<ol>
<li>14. gün veya 21. günde, her fareden alınan karaciğer veya dalak örneklerini (1 g) 1 mL RPMI/%2 FCS içinde, orta ayarda genel bir laboratuvar homojenizatörü kullanılarak pürüzsüz hale getirilene kadar homojenize edin. Numuneyi buz üzerinde soğuk tutun.</li>
		<li>Soğutulmuş bir masaüstü santrifüj kullanarak homojenatı 4 °C'de 1455 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj yapın. Süpernatantı çırpın ve kullanıma hazır olana kadar -80 °C'de saklayın. Sitokin ve kemokin seviyeleri, kit talimatlarına göre ticari ELISA kitleri ile ölçülebilir. Seviyeleri (mL veya μL cinsinden) dokunun pg / g'sine dönüştürerek sitokin seviyelerini standartlaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>CYP2E1, CYP2E1 epitopu JHDN5 ve TFA ilaç metabolitine karşı serum antikorlarının saptanması.
	<ol>
<li>14 veya 21. günlerde, fareleri 4-6 mg / kg ksilazin ile karıştırılmış 40-60 mg / kg ketamin ile sakinleştirin. Kas tonusunda bir azalma gözlemleyerek ve sağ reflekslerin kaybına ve palpebral reflekslerin kaybına ek olarak, ayak parmağı sıkışması (geri çekilme refleksi) gibi ağrılı uyaranlara yanıt vermeyerek uygun anestezi derinliğini onaylayın. Bir tüberkülin şırıngasına bağlı 25 G'lik bir iğne kullanın ve iğneyi yavaşça kaburgaların altındaki göğüs boşluğuna ve hemen ksifoid sürece yanal olarak ilerlederek kalbe yaklaşın. İntrakardiyak ponksiyon kullanarak kan toplayın.</li>
		<li>Kan toplandıktan sonra, oda sıcaklığında pıhtılaşmasına izin verin. Kan örneklerini oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 295 x g'de santrifüj yapın. Serumları dikkatlice çıkarın, serumları aliquot edin ve -20 ° C'de dondurun.</li>
		<li>100 μL CYP2E1, JHDN5 veya TFA-ovalbümin (OVA) test antijenlerini (PBS'de 5 μg / mL) 96 kuyucuk plakasına gece boyunca 4 ° C'de en az 18 saat boyunca uygulayın. Ertesi gün, plakaları yıkama tamponu (PBS / % 2 FCS), 2 döngü (her biri 4 yıkama) ile yıkayın.</li>
		<li>PBS/%2 FCS'de 100 μL fare serumu (1:100) uygulayın ve plakalara üçlü olarak uygulayın ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe edin. 2 saat sonra, plakaları adım 2.6.2'de açıklandığı gibi yıkama tamponu ile yıkayın.</li>
		<li>2 saat boyunca 100 μL Alkalen fosfataz (AKP)-keçi anti-fare IgG, AKP-sıçan anti-fare IgG1 veya AKP-sıçan anti-fare IgG2a sekonder antikorları (1:1000) ekleyin, ardından yıkama tamponu ile 1 döngü ve PBS ile 1 döngü yıkama adımı. Bir AKP substrat kiti kullanarak antikorları tespit edin ve bir spektrofotometre ile her 15 dakikada bir OD 405 nm'de ölçüm yapın. TFA genellikle 15 dakika içinde tamamen gelişirken, CYP2E1 ve CYP2E1 epitopu 30 ila 60 dakika7 arasında gelişebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>JHDN5 IgG ile indüklenen oksidatif stresin in vitro gelişimi üzerine çalışmalar.
	<ol>
<li>12 kuyucuk plakası kullanarak, CYP2E1 aktivitesini en üst düzeye çıkarmak için önerildiği gibi, 37 ° C'de, 37 ° C'de,% 5 CO2,% 95 nemde glutamin ve genel takviye ile desteklenmiş 1000 μL Williams E ortamındaki fibronektin kaplı kapak kaymalarında kuyu başına 106 terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreyi inkübe edin.</li>
		<li>Kuyuları ayırmak ve 37 °C, %5 CO2, %95 nemde 2 saat kuluçkaya yatırmak için JHDN5 IgG (1:40) veya fare IgG (1:1000) ekleyin. Hibridoma serumları çok seyreltikti. Tüm kuyucuklara 30 dakika daha koyu kırmızı floresan antikor dedektörü ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Kuyucukları karanlıkta 1 mL PBS ile 3 kat yıkayın. Hücreleri 10 dakika boyunca% 3.7 formaldehit içinde sabitleyin. 24 saat içinde konfokal mikroskopi ile inceleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>JHDN5 IgG'nin in vitro mitokondri gibi hücre içi organellerle birlikte lokalizasyon çalışmaları. 
	<ol>
<li>JHDN5 IgG'nin mitokondri ile birlikte lokalizasyonunu göstermek için, seyrek kültür (~% 30 birleşim), fibronektin kaplı kapak üzerindeki terminal olarak farklılaşmış hepatik hücreler, adım 2.7'de açıklandığı gibi boyasız Williams'ın media E'sinde 7 gün boyunca kaymaktadır.</li>
		<li>Doğru absorpsiyon dalga boylarını belirledikten sonra, 2 saat (37 °C), %5 CO2</li><li></ol></li></ol><ol><li><li><li></ol>

<ol><li>Castiella, A., Zapata, E., Lucena, M. I., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune+liver+disease%3A+A+diagnostic+dilemma+of+an+increasingly+reported+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune liver disease: A diagnostic dilemma of an increasingly reported disease.</a> World J. Hepatology. 6 (4), 160-168 (2014).</li>
<li>Bjornsson, E. S., Bergmann, O. M., Bjornsson, H. K., Kvaran, R. B., Olafsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence%2C+presentation%2C+and+outcomes+in+patients+with+drug-induced+liver+injury+in+the+general+population+of+Iceland%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Incidence, presentation, and outcomes in patients with drug-induced liver injury in the general population of Iceland.</a> Gastroenterology. 144 (7), 1419-1425 (2013).</li>
<li>Castiella, A., Lucena, M. I., Zapata, E. M., Otazua, P., Andrade, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%3A+a+diagnostic+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis: a diagnostic challenge.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (8), 2501-2502 (2011).</li>
<li>Czaja, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+autoimmune-like+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Drug-induced autoimmune-like hepatitis.</a> Digestive Diseases and Sciences. 56 (4), 958-976 (2011).</li>
<li>Pohl, L. R., Thomassen, D., Pumford, N. R., Butler, L. E., Satoh, H., Ferrans, V. J., Perrone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hapten+carrier+conjugates+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Hapten carrier conjugates associated with halothane hepatitis.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 283, 111-120 (1991).</li>
<li>Njoku, D. B., Talor, M. V., Fairweather, D., Frisancho-Kiss, S., Odumade, O. A., Rose, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+model+of+drug+hapten-induced+hepatitis+with+increased+mast+cells+in+the+BALB%2Fc+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Pathology%22%5BJournal%5D)">A novel model of drug hapten-induced hepatitis with increased mast cells in the BALB/c mouse.</a> Experimental and Molecular Pathology. 78 (2), 87-100 (2005).</li>
<li>Cottagiri, M., Nyandjo, M., Stephens, M., Mantilla, J., Saito, H., Mackay, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+drug-induced%2C+immune-mediated+hepatitis%2C+interleukin-33+reduces+hepatitis+and+improves+survival+independently+and+as+a+consequence+of+FoxP3%2B+T-cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">In drug-induced, immune-mediated hepatitis, interleukin-33 reduces hepatitis and improves survival independently and as a consequence of FoxP3+ T-cell activity.</a> Cellular and Molecular Immunology. , (2018).</li>
<li>Lohse, A. W., Manns, M., Dienes, H. P., Meyer zum Buschenfelde, K. H., Cohen, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+autoimmune+hepatitis%3A+disease+induction%2C+time+course+and+T-cell+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Experimental autoimmune hepatitis: disease induction, time course and T-cell reactivity.</a> Hepatology. 11 (1), 24-30 (1991).</li>
<li>McCarthy, E. K., Vakos, A., Cottagiri, M., Mantilla, J. J., Santhanam, L., Thomas, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+Shared+Cytochrome+p4502E1+Epitope+Found+in+Anesthetic+Drug-Induced+and+Viral+Hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Identification of a Shared Cytochrome p4502E1 Epitope Found in Anesthetic Drug-Induced and Viral Hepatitis.</a> mSphere. 3 (5), (2018).</li>
<li>Cho, J., Kim, L., Li, Z., Rose, N. R., Talor, M. V., Njoku, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+bias+in+experimental+immune-mediated%2C+drug-induced+liver+injury+in+BALB%2Fc+mice%3A+suggested+roles+for+Tregs%2C+estrogen%2C+and+IL-6%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+One%22%5BJournal%5D)">Sex bias in experimental immune-mediated, drug-induced liver injury in BALB/c mice: suggested roles for Tregs, estrogen, and IL-6.</a> PLoS. One. 8 (4), 61186(2013).</li>
<li>Satoh, H., Gillette, J. R., Takemura, T., Ferrans, V. J., Jelenich, S. E., Kenna, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+immunological+basis+of+halothane-induced+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigation of the immunological basis of halothane-induced hepatotoxicity.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 197, 657-673 (1986).</li>
<li>Eliasson, E., Kenna, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+P450+2E1+is+a+cell+surface+autoantigen+in+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cytochrome P450 2E1 is a cell surface autoantigen in halothane hepatitis.</a> Molecular Pharmacology. 50 (3), 573-582 (1996).</li>
<li>Bourdi, M., Chen, W., Peter, R. M., Martin, J. L., Buters, J. T., Nelson, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytochrome+P450+2E1+is+a+major+autoantigen+associated+with+halothane+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Human cytochrome P450 2E1 is a major autoantigen associated with halothane hepatitis.</a> Chemical Research in Toxicology. 9 (7), 1159-1166 (1996).</li>
<li>Njoku, D. B., Li, Z., Washington, N. D., Mellerson, J. L., Talor, M. V., Sharma, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppressive+and+pro-inflammatory+roles+for+IL-4+in+the+pathogenesis+of+experimental+drug-induced+liver+injury%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Suppressive and pro-inflammatory roles for IL-4 in the pathogenesis of experimental drug-induced liver injury.</a> European Journal of Immunology. 39 (6), 1652-1663 (2009).</li>
<li>Aithal, G. P., Ramsay, L., Daly, A. K., Sonchit, N., Leathart, J. B., Alexander, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+adducts%2C+circulating+antibodies%2C+and+cytokine+polymorphisms+in+patients+with+diclofenac+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatic adducts, circulating antibodies, and cytokine polymorphisms in patients with diclofenac hepatotoxicity.</a> Hepatology. 39 (5), 1430-1440 (2004).</li>
<li>Higuchi, S., Kobayashi, M., Yoshikawa, Y., Tsuneyama, K., Fukami, T., Nakajima, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-4+mediates+dicloxacillin-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">IL-4 mediates dicloxacillin-induced liver injury in mice.</a> Toxicology Letters. 200 (3), 139-145 (2011).</li>
<li>Rubtsova, K., Marrack, P., Rubtsov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexual+dimorphism+in+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Sexual dimorphism in autoimmunity.</a> Journal of Clinical Investigation. 125 (6), 2187-2193 (2015).</li>
<li>Satoh, H., Fukuda, Y., Anderson, D. K., Ferrans, V. J., Gillette, J. R., Pohl, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+studies+on+the+mechanism+of+halothane-induced+hepatotoxicity%3A+immunohistochemical+evidence+of+trifluoroacetylated+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Immunological studies on the mechanism of halothane-induced hepatotoxicity: immunohistochemical evidence of trifluoroacetylated hepatocytes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 233 (3), 857-862 (1985).</li>
<li>Habeeb, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+free+amino+groups+in+proteins+by+trinitrobenzenesulfonic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of free amino groups in proteins by trinitrobenzenesulfonic acid.</a> Analytical Biochemistry. 14 (3), 328-336 (1966).</li>
<li>Christen, U., Burgin, M., Gut, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Halothane+metabolism%3A+immunochemical+evidence+for+molecular+mimicry+of+trifluoroacetylated+liver+protein+adducts+by+constitutive+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Halothane metabolism: immunochemical evidence for molecular mimicry of trifluoroacetylated liver protein adducts by constitutive polypeptides.</a> Molecular Pharmacology. 40 (3), 390-400 (1991).</li>
<li>Christen, U., Quinn, J., Yeaman, S. J., Kenna, J. G., Clarke, J. B., Gandolfi, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+dihydrolipoamide+acetyltransferase+subunit+of+the+human+pyruvate+dehydrogenase+complex+as+an+autoantigen+in+halothane+hepatitis.+Molecular+mimicry+of+trifluoroacetyl-lysine+by+lipoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of the dihydrolipoamide acetyltransferase subunit of the human pyruvate dehydrogenase complex as an autoantigen in halothane hepatitis. Molecular mimicry of trifluoroacetyl-lysine by lipoic acid.</a> European Journal of Biochemistry. 223 (3), 1035-1047 (1994).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu protokolün gücü, tekrarlanabilirliğine dayanır; Bu nedenle, önerilen adımlara uymak çok önemlidir. İmmünojenin formülasyonu bazıları için bir bariyer olabilir; Bununla birlikte, belgemizde açıklanan epitopu kullanarak modelimizi yeniden ürettik, bu da karaciğerin S100 fraksiyonunu izole etme ihtiyacını ortadan kaldırıyor. Ek epitopların veya proteinlerin modifiye edilmesi ve bağışıklamaları takiben hepatiti indüklemesi muhtemeldir; ancak, kullandığımız proteinleri güvenilir sonuçlarla tanımlıyoruz. Halojenli anestezik...

Bu yöntemin amacı, in vivo gelişen ilaca bağlı otoimmün hepatitin fare modelini tanımlamak ve bu hastalığın moleküler, immünolojik ve genetik temelini araştırmak için nasıl kullanılabileceğini göstermektir. Çalışmalarımızın uzun vadeli amacı, duyarlı hastalarda DİH'yi inceleyerek kronik karaciğer inflamasyonu ve hasarının gelişiminden sorumlu mekanizmaları ortaya çıkarmaktır. Karaciğer hastalığı ve siroz, 25-64 yaş arası erişkinlerde altıncı en sık ölüm nedenidir. Bazen ilaca bağlı otoimmün hepatit (DIH) olarak adlandırılan idiosyncratic DILI, Amerika Birleşik Devletleri'nde akut karaciğer yetmezliğinin üçüncü en yaygın nedenidir. DIH, otoimmün hepatit1'li hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en yaygın hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadın 2,3,4'tür. İzofluran, sevofluran, desfluran veya halotan gibi halojenli uçucu anesteziklerin uygulanmasını takiben duyarlı bireylerde bir tür DIH gelişir. Bu anestezikler, metabolizmalarının reaktif ürünleri ile karaciğer proteinlerine kovalent olarak bağlanır, böylece alerjik veya otoimmün yanıtları ortaya çıkarabilen yeni otoantijenler oluşturur5.
Anestezik ve herhangi bir DIH formunun gelişiminde rol oynayan patojenik mekanizmaların incelenmesi, daha önce insan hastalığının indüksiyonunu yakından taklit eden bir hayvan modelinin eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Hastalarda immün aracılı DILI'ye benzeyen özelliklere sahip deneysel bir DIH murin modeli geliştirdik. Hepatit, sitokrom P450 2E1 (CYP2E1)5 enzimi tarafından anestezinin oksidatif metabolizmasını takiben oluşan trifloroasetil klorür (TFA) metaboliti tarafından kovalent olarak modifiye edilmiş iki otoantijenden biri ile immünizasyon ile indüklenir. Bir otoantijen, birkaç proteinin karışımı olan hepatik sitozolik S100 karaciğer fraksiyonudur6 ve ikinci otoantijen, anestezik immün aracılı DILI7'li hastalardan serumlar tarafından tanınan bir CYP2E1 epitopudur. Deneysel otoimmün hepatite nispeten dirençli olan BALB / c farelerini kullanarak, modelimizi C57Bl / 6J farelerde otoimmün hepatitin S100 kaynaklı immünizasyon modelinden ayırıyoruz8.
Çeşitli klinik prezentasyonları nedeniyle, DIH'nin hastalarda incelenmesi zordur. Translasyonel deneysel modeller, hastalığın patogenezini in vivo ve in vitro olarak değerlendirme olanağı sunmaktadır. Şu anda, DİH'yi indüklemek için, hayvan kullanmadan in vivo veya in vitro adaptif veya doğuştan gelen bağışıklık tepkilerini tam olarak inceleyen başka alternatif yöntemler yoktur. Dahası, S-100 veya CYP2E1 epitopunun trifloroasetilasyonu tahriş edici bir immünojen üretmediğinden ve TFA ile değiştirilmiş proteinlerle bağışıklama yoluyla DIH'yi indüklediğimizden, bu hayvanlara bağışıklama veya diğer prosedürlerden önce eter, herhangi bir halojenli anestezik, barbitürat veya alkol almayacaktır. Buna rağmen, keşfedilen CYP2E1 epitopu9'un bağlanma tercihlerini doğrulamak için bilgisayar simülasyonunu kullanarak fare kullanımımızı azalttık ve dişi BALB / c farelerinin daha şiddetli bir DIH10 geliştirdiğini göstererek kadın cinsiyetini içeren insan DIH'sini yansıttık.
Hastalarda DİH'nin çeşitli sunumlarına ve klinik hastalık çalışmalarındaki zorluklara rağmen, reaktif ilaç metabolitleri tarafından doğal proteinlerin post-translasyonel modifikasyonu, halojenli anestezikleri takip eden patogenez DİH'de kabul edilen anahtar bir mekanizmadır11. Araştırmacılar ayrıca CYP2E1'in bu süreçte12,13 majör bir otoantijen olduğunu kabul etmektedir. Translasyonel olarak modifiye edilmiş bir CYP2E1 ve diğer karaciğer proteinlerini tanıyan interlökin (IL)-4-yukarı regüle CD4 + T hücrelerinin rolü, nötrofilleri, eozinofilleri ve mast hücrelerini karaciğer14'e çekerek anestezik DIH'nin kabul edilen bir başlatıcısıdır ve bu mekanizma DIH 15,16'nın birçok formunda doğrulanmıştır. İndüklenen FoxP3 eksprese eden CD4 + CD25 + T hücreleri (Tregs) DIH'nin şiddetini azaltır ve bu hücrelerin dalaktaki göreceli eksiklikleri DIH 10,7'yi kötüleştirir. Bu nedenle, DIH'yi anlamadaki ilerlemelerin çoğu, DIH'nin genetik, metabolik ve immünolojik mekanizmalarını hem in vivo hem de in vitro olarak değerlendirmek için in vivo fare modellerinin kullanılmasıyla mümkün olmuştur.
Biz ve diğer araştırmacılar, farklı fare modelleri kullanarak DIH'nin başlatılmasında IL-4, nötrofiller ve eozinofiller için rolleri ortaya çıkardığımız için, bu gözlemin, kullanılan DIH modelinden bağımsız olarak, hepatit ve yaralanmanın IL-4 tarafından indüklendiği iddiamızı desteklediğine inanıyoruz. Protokolümüzün gücü, hem erkek hem de dişi fareler olmak üzere in vivo metodolojinin kullanılmasında ve histolojinin, CD4 + T hücre proliferasyon tahlillerinin ve sitokinlerin tekrarlanmasında yatmaktadır. İn vitro çalışmaları kullanmamızın gücü, DIH'yi yönlendiren hücresel etkileşimleri izole etmek için metodoloji sağlarken ihtiyaç duyulan fare sayısını azaltmalarıdır. Erkek ve dişi farelerin kullanılmasını öneriyoruz, çünkü bu, sonuçların yorumlanmasında bilinçsiz önyargı olasılığını azaltır ve DIH insidansı, prevalansı ve şiddeti kadınlarda daha yüksek olduğu için çalışmalarımızın çeviri potansiyelini güçlendirir17. Farelerin tek bir satıcıdan elde edilmesini öneririz; Bununla birlikte, bu mümkün değilse, genetiği değiştirilmiş farelerle aynı satıcıdan çöp eşi kontrolleri veya vahşi tip fareler edinin.

<table><tbody><tr><td>%0,1 2,4,6-trinitrobenzen sülfonik asit (TNBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>28997</td><td></td></tr><tr><td>AKP Substrat Kiti</td><td>BioRad</td><td>172-1063</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c fareler</td><td>Jackson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellTrace &amptrade; CFSE Hücre Proliferasyon Kiti</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CFA H37Ra</td><td>Becton Dickinson (Difco Bacto)</td><td>231131</td><td></td></tr><tr><td>FcR Bloke edici reaktif</td><td>Milteyi</td><td>130-092-575</td><td></td></tr><tr><td>Genel ek</td><td>ThermoFisher</td><td>HPRG770</td><td></td></tr><tr><td>HepaRG ve ticaret; hücreler dondurularak saklanmış</td><td>ThermoFisher</td><td>HPR GC10</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü Sabitlenebilir Aqua Dead Cell leke kiti&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>L34965</td><td></td></tr><tr><td>NaHC03</td><td>Kırlangıç Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Percoll&reg;</td><td>Millipore Sigma</td><td>P1644-1L</td><td></td></tr><tr><td>Boğmaca Toksin Listesi</td><td>Biyolojikler</td><td>180</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su pH 7.4</td><td>Çeşitli</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce & Trade; Proteaz İnhibitörü Mini Tabletler, EDTA İçermeyen</td><td>ThermoFisher</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Hidroksit</td><td>JT Baker</td><td>3140-01</td><td></td></tr><tr><td>S-etiltriflorotiyoasetat (S-ETFA)</td> <td>Millipore Sigma</td><td>177474</td><td></td></tr><tr><td>Slide-a-lyzer diyaliz kasetleri (10 K, 12 ml)</td> <td>ThermoFisher</td><td>66810</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure ve ticaret; SDS Solüsyonu, %10</td> <td>ThermoFisher</td><td>24730020</td><td></td></tr><tr><td>Williams Media E, fenol kırmızısı içermeyen</td><td>ThermoFisher</td><td>A1217601</td><td></td></tr></tbody></table>

patojenik mekanizmalarının İncelenmesi için balb/c farelerde İlaca bağlı, otoimmün hepatitin İndüklenmesi

Induction of Drug-Induced, Autoimmune Hepatitis in BALB/c Mice for the Study of Its Pathogenic Mechanisms

İlaca bağlı otoimmün hepatit (DIH), otoimmün hepatitli hastaların yaklaşık %9-12'sinde gözlenen en sık görülen hepatik ilaca bağlı aşırı duyarlılık sürecidir. DİH'li hastaların ezici çoğunluğu kadındır. Prevalansındaki bu cinsiyet farklılıklarının altında yatan mekanizmalar, insan hastalığını taklit eden hayvan modellerinin azlığı nedeniyle belirsizdir. Buna rağmen, altta yatan mekanizmaların insan lökosit antijen haplotipleri ve cinsiyet hormonları ile ilişkili olduğuna inanılmaktadır. Buna karşılık, bir DIH fare modeli kullanarak, IL-4'ün bir sitokrom P450 2E1 epitopuna karşı yönlendirilmiş CD4 + T hücrelerini başlattığını, nötrofillerin, makrofajların ve mast hücrelerinin dişi BALB / c farelerinin karaciğerlerine akışını indüklediğini ortaya çıkardık. Bu modeli kullanarak, IL-33 ile indüklenen FoxP3 + düzenleyici T hücrelerinin dişi ve erkek farelerde DIH'ye karşı koruma sağladığını da gösterdik. Bu DIH modeli, farelerin DIH ile ilişkili bir ilaç metaboliti ile kovalent olarak değiştirilmiş bir CYP2E1 epitopu ile aşılanması ile indüklenir. Bu epitop DIH'li hastalar tarafından tanınır. Yöntemimiz, DIH'nin patogenezini incelemek için kullanılabilecek sağlam ve tekrarlanabilir hepatit ve otoantikorları indüklemektedir. İn vivo çalışmalar, yanlış yapıldığında farelerde aşırı ağrı ve sıkıntıya neden olabilirken, in vivo bir modelin avantajı, çok sayıda farede hastalığın patogenezini değerlendirme yeteneğidir. Ek olarak, değiştirilmiş karaciğer proteinlerinin biyolojik etkileri, invaziv prosedürler kullanılarak incelenebilir. Deneysel tasarıma in vitro çalışmaların eklenmesi, hücresel düzeyde hızlı tekrarlama ve mekanik analize izin verir. Bu nedenle, model protokolümüzü ve DIH'nin in vivo ve in vitro mekanizmalarını incelemek için nasıl kullanılabileceğini göstereceğiz.

Şekil 1'de gösterilen DIH'yi indüklemek için kullanılan bağışıklama programı, boynun tabanında (gün 0) ve kuyruğun tabanında (gün 7) gerekli olan iki bağışıklamayı temsil eder. Şekil 2, CYP2E1, JHDN5, CYP2E1 epitopu ve anesteziklerin trifloroasetil (TFA) metabolitine yanıt olarak CFSE kullanılarak 14. günde elde edilen temsili proliferasyon verilerini göstermektedir. Şekil 3, 14. günde elde edilen indüklenmiş CD4 + CD25 + FoxP3 + Tr...

Bu çalışmada, BALB/c farelerde, bu hastalıkta görülen cinsiyet farklılıkları da dahil olmak üzere ilaca bağlı otoimmün hepatitin patogenezini incelemek için kullanılabilecek bir in vivo immünizasyon, translasyonel hepatit modeli tanımlanmıştır. Bu modelin in vivo ve in vitro deneysel teknikler kullanarak tekrarlanabilir analizleri nasıl gösterdiğini açıklayacağız.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Drug-induced autoimmune hepatitis (DIH) is the most common hepatic drug-induced hypersensitization process observed in approximately 9 to 12% of patients ...

Karaciğer hastalığı ve siroz, 25 ila 64 yaş arasındaki yetişkinlerde altıncı en sık ölüm nedenidir. Bazen ilaca bağlı, otoimmün veya immün aracılı hepatit olarak adlandırılan idiyosenkratik DILI, Amerika Birleşik Devletleri'nde akut karaciğer yetmezliğinin en sık üçüncü nedenidir ve en yaygın hepatik ilaca bağlı hiposensitizasyon sürecidir. Bu süreç, otoimmün hepatitli hastaların yaklaşık% 9 ila 12'sinde görülür ve bu hepatit formu, bir ilacın ticari pazardan çıkarılmasının en yaygın nedenidir.İlaca bağlı hepatitli hastaların ezici çoğunluğu kadındır. Bu protokol, hepatit, oto-antikorlar ve cinsiyet farklılıkları gibi hastalarda görülen kritik özellikleri tanımlar. Bu tekniğin temel avantajı, bilim adamlarına hastalığın gelişimini ve sekelini izleme şansı veren in vivo bir fare modelinde tekrarlanabilirliğidir.Bu protokolü kullanarak, anestezik hepatitli hastalarda baskın bir epitop olan ve viral hepatitli hastalarda fibrozis ile önemli ölçüde ilişkili olan anestezik ve viral hepatitte ortak bir epitop keşfettik. Bu bilgilerin, ilaca bağlı veya viral hepatit veya ilişkili fibroz için spesifik tanı testleri geliştirmek için kullanılabileceğine inanıyoruz ve bu da bu hastalığı veya sekellerini geliştirme riski taşıyan bireyleri tahmin edebileceğini umuyoruz. Yazılı teknikler bunaltıcı olabilir, çünkü sonuçlarımızın tekrarlanabilirliğini sağlamak için her zaman birkaç kontrol ve denge kullanırız.Deneyi ilk kez yaptığınızda, kendinize yeterince zaman tanıyın. İlk kez geçtikten sonra, oldukça hızlı bir şekilde gider. BALB/c faresinin ötenazisinden sonra, mikrocerrahi makasla karın içi içeriği ortaya çıkarmak için orta hat insizyonu kullanın ve kanı çıkarmak için inferior vena kavada küçük bir kesi yapın.Ardından portal ven içine 24 gauge anjiyokateter yerleştirin. PBS'yi dört santigrat derecede bir su banyosunda tutun ve karaciğeri dakikada 10 mililitre hızında 40 mililitre PBS ile doldurmak için peristaltik bir pompa kullanın. Mikromakasla, karaciğeri karından dikkatlice serbest bırakın ve karaciğeri darası alınmış bir tartı teknesinde tartın.Karaciğeri 10 ila 15 milimetrelik küçük parçalar halinde kesin. Karaciğer örneklerini ve bir fare karaciğerinin ağırlığının dört katı olan homojenizasyon tamponunu 15 mililitrelik bir polipropilen tüpe ekleyin ve el yazmasına göre tam proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri ile destekleyin. Numuneleri pürüzsüz olana kadar buz üzerinde homojenize etmek için orta hızda genel bir laboratuvar doku homojenizatörü kullanın.Karaciğer homojenatlarını 10 dakika boyunca 1.500 kez G'de santrifüjleyin ve ardından süpernatan sitozolik S100'ü dökün 100.000 kez G'de tekrar santrifüjlemeden sonra, süpernatan sitozolik S100'ü kuru buzda dondurun ve tüpü eksi 80 santigrat derecede dondurun. Trifloroasetilasyona başlamak için S100'ü oda sıcaklığında çözdürün. Daha sonra, bir Erlenmeyer şişesinde, 20 miligram fare S100'ü deiyonize su ile 10 mililitre ila seyreltin.pH metre ile 1-normal potasyum hidroksit ile pH'ı 10'a ayarlayın. Bir davlumbazda, çözeltiye 4.7 milimol S-ETFA ekleyin. 1-normal potasyum hidroksiti damlacık şeklinde yaklaşık bir saat uygulayarak pH'ı 9.9 ila 10.0 arasında tutun.Her reaksiyon için toplam potasyum hidroksit hacmini kaydedin. Solüsyonları ayrı diyaliz kasetlerine aktarın. Kasetleri günde üç değişiklikle 72 saat diyalize etmek için dört litre deiyonize suya koyun.Diyalizden sonra, trifloroasetillenmiş S100'ün son hacmini kaydedin ve ardından etiketli tüplere alikot yapın. Tüpleri kuru buzda dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. El yazmasına göre belirlenen protein konsantrasyonu ile, mililitrede bir miligramdan büyükse, ayrı mermi tüplerinde bir mililitre deiyonize suya her doğal ve TFA ile değiştirilmiş proteinden bir miligram ekleyin.Bir mililitre deiyonize su kullanarak mermi tüpünde bir boşluk hazırlayın. 96 oyuklu bir plakada, her biri iki kopya halinde 50 mikrolitre boş, doğal ve değiştirilmiş protein ekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 50 mikrolitre %4 sodyum bikarbonat çözeltisi ve ardından 50 mikrolitre %0.12, 4, 6-trinitrobenzen sülfonik asit ekleyin.Plakayı iki saat boyunca 40 santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyonun ardından, her bir oyuğa 50 mikrolitre% 10 SDS ekleyin, ardından 25 mikrolitre 1-normal hidroklorik asit ekleyin. Farenin aşılanması ve uyuşturulmasından sonra, karın içi boşluğu ortaya çıkarmak için mikrocerrahi makas kullanın.Dalağı tanımlayın. Dalağı pedikülden kesin ve %2 fetal baldır serumu içeren PBS'li bir Petri kabına yerleştirin. Hücreleri serbest bırakmak için, dalağı iki buzlu cam slayt arasına sıkıştırın ve birbirine sürtün.Hücreleri 50 mililitrelik konik polipropilen tüpe aktarmak için elektronik bir pipet kullanın. Yıkamak için, 50 mililitre hacme ulaşmak için tüpe %2 FCS içeren PBS ekleyin ve tezgah üstü soğutmalı santrifüj kullanarak 335 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve yıkama adımını tekrarlayın.Kırmızı hücreleri çıkarmak için bir dakika boyunca yıkamak için tüpe bir mililitre ACK lizasyon tamponu ekleyin. Ardından FCS takviyeli PBS yıkama adımını tekrarlayın. Hücreleri 30 dakika boyunca CFSE ile etiketledikten sonra, inkübatörde 37 santigrat derecede 72 saat boyunca etiketli hücreleri uyarmak için mililitre başına 10 mikrogram sitokrom-P450 2E1, JHDN5 veya trifloroasetillenmiş ovalbümin ekleyin.İnkübasyondan sonra, hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca 1:100 oranında allofikosiyanin ile etiketlenmiş CD4 ile boyayın. El yazmasında anlatıldığı gibi aşılanmış farenin laparotomisinden sonra, portal veni 25 gauge bir iğne ile kanül edin ve ardından renal venlerin altındaki inferior vena kava'yı kesin. 37 santigrat derecelik bir su banyosunda, her karaciğeri dakikada 10 mililitre akış hızında 40 mililitre PBS ile perfüze edin.Perfüzyondan sonra, mikrocerrahi makas kullanarak, karaciğeri hepatik pedikülden kesin, safra kesesini çıkarın ve ardından karaciğeri hilusta kesin. 300 gözenekli paslanmaz çelik elekte, karaciğeri bozmak için 20 mililitrelik steril bir şırınga havaneli ve soğuk PBS kullanın. Elek ile elde edilen hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik önceden sterilize edilmiş santrifüj tüplerine süzün.Soğuk PBS kullanarak her bir süspansiyonu 50 mililitreye getirin ve ardından süspansiyonu 370 kez G'de 10 dakika santrifüjleme ile yıkayın, süpernatanı atın ve ardından peletleri yeni 50 mililitrelik tüplere işlemden geçirerek birleştirin. Kombine peletleri PBS'de 45 mililitre% 35 Percoll ve mililitre heparin başına 100 uluslararası birimde askıya alın. Ardından, her bir tüpü 20 santigrat derecede 10 dakika boyunca 500 kez G'de döndürün.Süpernatanı atın ve peleti beş mililitre PBS'de askıya alın ve ardından her pelete bir mililitre ACK parçalama tamponu ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde saklayın. 370 kez G'de santrifüjleme ile PBS ile tekrar yıkadıktan sonra, süpernatanı atın ve daha sonra hücreleri FCS takviyeli PBS ile 370 kez G'de 10 dakika santrifüjleme ile yıkayın. Bu deneyde, CD4+T hücresi immün yanıtları akım sitometrisi kullanılarak belirlendi.Temsili proliferasyon verileri, trifloroasetil metaboliti, sitokrom-P450 2E1, sitokrom-P450 2E1 epitopu, JHDN5'e yanıt olarak CFSE kullanılarak 14. günde elde edildi. Antijen içermeyen kuyular kontrol olarak kullanıldı. Kontrol ile karşılaştırıldığında, BALB / c fareleri trifloroasetillenmiş ovalbümin ve sitokrom-P450 2E1'e yanıt olarak proliferasyon geliştirdi, ancak JHDN5'e değil.TFA'nın tam Freund'un adjuvan bağışıklamasında emülsifiye edilmesinden üç hafta sonra, dişi BALB / c fareleri, erkek BALB / c farelerine kıyasla daha fazla ilaca bağlı otoimmün hepatit geliştirdi. Karaciğer dokularının histolojik analizi ayrıca dişi farelerde erkek farelere göre daha şiddetli hepatit iltihabı gösterir. Hepatik CD4+CD8+NK+ ve NKT+hücre sayıları kadınlarda erkeklere göre anlamlı olarak daha yüksekti.Bu fareler arasında B hücrelerinde herhangi bir fark görülmezken, uzun bir gün olmasına rağmen, bu formülasyonun uzun süre dayanacağını unutmayın. Bu prosedür aynı zamanda epitopu trifloroasetilat etmek için de yapılabilir. Bu prosedür, araştırmacıların karaciğer hastalığı gelişiminin zaman seyrini incelemesine ve yeni protein ve yolak keşifleri için potansiyeli artırmasına izin verdi.S-etiltriflorotioasetat toksiktir ve çeker ocakta kullanılmalıdır. Ek olarak, iyi laboratuvar uygulamaları ve teknikleri şiddetle tavsiye edilir.

induction-drug-induced-autoimmune-hepatitis-balbc-mice-for-study-its

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video otoimmün hipofizitis SJL fareler ve histopatoloji ile şiddetini değerlendirmek için nasıl ikna etmek için nasıl gösterir.

SJL Farelerde Deneysel Otoimmün hipofizitis İndüksiyon

Adenovirüs ile temel insan otoantijen ifade farelerin Enfeksiyon, CYP2D6 geniş hepatit, fibrozis ve kuşak tarafından karakterize otoimmün aracılı karaciğer hastalığı kalıcı bir form Tip 2 otoimmün hepatit sonuçları muzdarip hastaların sera tarafından tanınan P450 2D6 (hCYP2D6) sitokrom -belirli bir bağışıklık yanıtı.

CYP2D6 Hayvan Modeli:, Fare Otoimmün Hepatit indükleyin nasıl

Video, miyelin oligodendrosit glikoproteinleri ve inaktive edilmiş Mycobacterium tuberculosis'in bir kombinasyonunu enjekte ederek bir fare modelinde deneysel otoimmün ensefalomiyelit indüksiyonunu göstermektedir. Model, araştırmacıların hastalık mekanizmalarını incelemelerine ve terapötik müdahaleleri test etmelerine olanak tanır.

Bir Fare Modelinde Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit İndüksiyonu

Bu videoda, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) kullanılarak multipl sklerozun bir fare modeli oluşturulmuştur. Fareye, otoreaktif T hücrelerini aktive eden bir bağışıklık tepkisini tetikleyen bir nöronal peptit ve bir adjuvan içeren bir emülsiyon enjekte edilir. Bunu, otoreaktif T hücrelerinin beyne sızmasına izin vererek kan-beyin bariyeri geçirgenliğini artırmak için bir boğmaca toksini (PTX) enjeksiyonu takip eder. Bu infiltrasyon, multipl sklerozun demiyelinizan durumunu taklit ederek...

Burada, sinjeneik CD4 + CD45RByüksek T hücrelerinin T ve B hücresi eksikliği olan alıcılara evlat edinici transferi yoluyla farelerde kolon iltihabını indüklemek için bir protokol sunuyoruz. Klinik ve histopatolojik özellikleri insan inflamatuar barsak hastalıklarını taklit eder. Bu yöntem, kolon iltihabının başlaması ve hastalığın ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Yüksek</sup&gt; Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

BM12 lenfositlerinin bir C57BL/6 alıcısına transferi, sistemik lupus eritematozusun yerleşik bir modelidir. Burada, bu modeli kullanarak hastalığın nasıl başlatılacağını ve T foliküler yardımcı hücrelerin, germinal merkez B hücrelerinin ve plazma hücrelerinin akış sitometrisi ile nasıl karakterize edileceğini açıklıyoruz.

C57BL / 6 FARELERDE SLE bm12 İndüklenebilir Modeli (SLE)

Bu makale, deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) modelinin indüksiyon ve skorlama yöntemlerini, çeşitli hastalık evrelerinde sırasıyla akış sitometrisi ve kantitatif PCR kullanılarak lenf düğümleri, dalak, kan ve omurilikteki immün hücre dağılımı ve mRNA sitokin seviyelerinin değerlendirilmesi ile birlikte açıklamaktadır.

Çeşitli Dokularda Bağışıklık Hücreleri Hastalık bağımlı Dağıtım Fareler ve Değerlendirilmesi Deneysel Otoimmün Ensefalomyelitli indüksiyon

Burada, yetişkin farelerin birincil hepatositler izole etmek için bir enzimatik yaklaşım göstermek ve biz ELISA ve gerçek zamanlı PCR kullanarak bir inflamatuvar yanıt ölçümü açıklar.

Fare Primer Hepatosit Kültürler bir inflamatuar yanıtın indüksiyon

Burada sunulan kök hücre kaynaklı viral antijen (Ag) özgü T lenfositlerin benimseyen hücre transferi (ACT) kullanarak farelerde hepatit B virüsü (HBV) replikasyonu nun etkin bastırılması için bir protokoldür. Bu işlem HBV enfeksiyonunun act tabanlı potansiyel immünoterapisi için uyarlanabilir.

Kök Hücre Kaynaklı Viral Ag-Spesifik T Lenfositler Farelerde HBV Replikasyonlarını Baskılar

Bu protokolde bağırsak mikrobiyota antijenine özgü T hücreli benimseyen transfer kolit modeli tanımlanmıştır. CD4+ T hücreleri CBir1 TCR transgenik farelerden izole edilmiştir. Bunlar, alıcı Rag1/- farelere aktarılan ve bağırsak iltihabına yol açan immünodominant bağırsak mikrobiyota antijeni CBir1 flagellin için özeldir.

CBir1 TCR Transgenik CD4+ T Hücrelerinin İmmün Yetmezlikçi Farelere Benimsenen Transferi ile Bağırsak İltihabının İndüksiyonu

Deneysel otoimmün ensefalomiyelit, multipl sklerozun en yaygın kullanılan murin modellerinden biridir. Mevcut protokolde, her iki cinsiyetten C57BL / 6J fareleri, miyelin oligodendrosit glikoprotein peptidi ile aşılanır ve bu da esas olarak kuyruk ve uzuvların artan parezi ile sonuçlanır. Burada EAE indüksiyonu ve değerlendirme protokolünü tartışıyoruz.

İki Cinsiyette Multipl Sklerozun Modellenmesi: MOG35-55 ile İndüklenen Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit

Keşfedin, ilaca bağlı otoimmün hepatit patogenezinde cinsiyet farklılıklarını incelemek için BALB/c farelerinde tekrarlanabilir bir immünizasyon modeli. Bu yöntem karaciğer hastalıkları araştırmalarına katkı sağlar.

Patojenik Mekanizmalarının İncelenmesi için BALB/c Farelerde İlaca Bağlı, Otoimmün Hepatitin İndüklenmesi

Daha fazla video keşfet