Name: İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Keşfedin, lck:eGFP transgenik zebra balığı kullanarak malign ve non-malignant B hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem, akut lenfoblastik lösemi ve adaptif bağışıklık sistemi araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Megan Malone-Perez Zebra balığı Bakımı ve OUHSC Akış Sitometresi çekirdek teşekkür etmek istiyorum. Bu eser Hyundai umut gezici, Oklahoma Merkezi bilim ilerleme ve Teknoloji (HRP-067), bir NIH/NIGMS INBRE pilot proje Ödülü (P20 GM103447) gelen hibe tarafından desteklenmiştir. JKF E.L. & Thelma Gaylord donatılmış sandalye pediatrik hematoloji-Onkoloji, Çocuk Hastanesi Vakfı'nın tutar.

Zebra balığı içeren tüm yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından kabul edildi.
1. Non-Malign B ve T lenfositleri transgenik lck:eGFP balık izole
<ol><li>%0,02 tricaine (MS-222) Balık sistem su kullanarak balık anestezi.</li>
	<li>Zebra balığı ve diğer teleosts14bransiyal boşluğuna dorsomedial yönü de bulunan 2-6 ay eski balık floresan thymi için inceleyin. Bir epifluorescence mikroskobu (470/40 uyarma dalga boyu ve 525/50 emisyon filtre) GFP algılamak için kullanın.</li>
	<li>Önceden filtre sterilize 1 Roswell Park Memorial Enstitüsü orta (RPMI) içeren % 1 fetal sığır serum ve % 1 penisilin-streptomisin (sıralama medya) x 50 mL hazırlamak. Kullanılmayan sıralama medya 4 ° C'de 2 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Balık % 0,2 içeren bir kabı yerleştirerek ötenazi için yaklaşık 5 dk, Tricaine buz banyosu daldırma tarafından takip. Ölüm opercular (solungaç) hareket durdurulması tarafından onaylayın.</li>
	<li>Euthanized balık bir Petri kabına yerleştirin ve lenfoid organlar GFP+ thymi14ve böbrek kemik iliği ve dalak15incelemek için parlak alan mikroskobu ayarlarını incelemek için floresan mikroskop kullanarak ilgi incelemek. Sonuçları burada sunulan 3 aylık balık kullanarak elde edilmiştir. Lenfosit oranlarını ve kesin rakamlar yaş ve genotip (daha fazla ayrıntı için bkz) göre değişir.</li>
	<li>Her disseke organ medya sıralama soğuk 500 µL içeren bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
	<li>Buzda bir havaneli ile mikro-tüp homogenizer kullanarak doku lunaparkçı.</li>
	<li>Homojenize doku bir tek hücre süspansiyon oluşturmak için 35 µm gözenekli filtre geçmek. Hücreler buz üzerinde analiz kadar tutmak.</li>
</ol>2. çift-transgenik rag2:hMYC; lck:eGFP Zebra balığı üzerinden Malign lenfositler yalıtma
<ol><li>
2-4 aylıkken başlayarak, mikroskobik rag2:hMYCekran; LCK:eGFP balık anormal GFP desenler için. Not: B hücreleri vardır GFPlo lck:eGFP arka planda, B-tüm tanımak; pratik gerektirir T hücreleri GFPMerhabaçünkü T-ALL açıktır. Sonuç olarak, rag2:hMYC, lck:eGFP çift-transgenik satır iki fenotipleri vardır: parlak floresan T-genellikle timus ortaya ve vücut ve loş floresan B-tüm içine genişletmek tüm,.<ol>
<li>Bir floresan mikroskop kullanarak ekran "düşük pozlama" ayarlarla (200 ms, 2.4 x kazanç) parlak T-ALL (şekil 1A) ve "yüksek pozlama" tanımlamak için balık (1,5 s, 3,4 x kazanç) loş B-ALL (şekil 1A) tanımlamak için. WT denetimleri ve önceden lösemik balık sadece timus (şekil 1B) Lokalize GFP var.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Anestezi ve 1.1-1.2 adımlarda açıklandığı gibi balık inceleyin.</li>
	<li>GFP Floresan, basit bir üç kategori sistemi kullanarak kapsam üzerinde dayalı balık sınıflandırmak: Not: Düzey 1: Floresan timik tümörle sadece sınırlı yerel yayılmış olarak görünür. Düzey 2: Floresan timus, maddelerle ilgili görünür < vücudun % 50. Düzey 3: Floresan vücut % 50'si uzanır.</li>
	<li>Tüm bu kanser olmadan balık ayırın. Önceden lösemik balık (yani, Balık GFP+ tümör olmadan) bir kez aylık yeni ALL gelişimi için izleyin. Tarafından ~ 9 ay, tüm rag2:hMYC, lck:eGFP balık geliştirmek T-ALL, B-tüm veya her ikisini de.</li>
	<li>T veya B tüm yalıtım hücre, düzey 3 balık seçin (tüm içeren > vücudun % 50), tüm hücreleri ve genellikle çok daha fazla 2 x 10'dan fazla6 verim.</li>
	<li>Balık olduğu gibi adım 1.4 ötenazi. Not: TÜM hücreleri elde etmek için iki yöntem vardır: bütün vücut homojenizasyon ve Periton yıkama tekniği16. Hücreleri sıralamak için toplanan mutlak sayısında yöntemleri farklılık gösterir ve böylece, FACS miktarda gerekli ve maliyet zaman (daha fazla ayrıntı için bkz).</li>
	<li>Her iki yöntem için ilk euthanized balık bir Petri kabına yerleştirin ve jilet kullanarak, timik bölgesi dahil olmak üzere baş kaldırma. Bu ayrı olarak, istenen veya histolojik boyama için kullanılan işlenebilir.</li>
	<li>
Periton yıkama yöntemi
	<ol>
<li>P1000 pipet kullanarak, Balık Periton boşluğuna 500 µL soğuk ortam, hücre ve 5 mL tüp medyada toplama sıralama ile yıkayın.</li>
		<li>Taze pipet ucu kullanarak, bir ek 200 – 300 µL soğuk sıralama medya vücut boşluğuna enjekte et. Daha sonra pipet ucu kullanarak, hafif basınç balık vücut hücreleri vücut boşluğu dışında Yükselt için geçerli. Bu medya toplamak ve 5 mL tüp ekleyin.</li>
		<li>2.8.2 2-3 kez tekrarlayın. Kendine hakim hücre buz medyada sıralama tutun.</li>
		<li>35 µm mesh Akış Sitometresi/FACS önce filtre ve hücreler buz üzerinde analiz kadar tutmak rağmen hücre süspansiyon filtre.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tüm vücut homojenizasyon
	<ol>
<li>Balık kafası kaldırdıktan sonra vücut medya sıralama 200 µL içeren bir 1,5 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
		<li>Bir havaneli ile mikro-tüp homogenizer kullanarak vücudun homojenize.</li>
		<li>Soğuk ortam sıralama ek bir 300 µL ekleyin. Hücre süspansiyon rağmen 35 µm gözenekli filtre filtre. Sıralama medya kadar sadece doku enkaz üzerinde filtre kalır tüm hücreleri filtreden yıkamak için gerektiği gibi ekleyin. Hücreler buz üzerinde analiz kadar tutmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. sitometrik analizinde Normal veya malign B lenfositler
<ol><li>Akış sitometrik çözümlemesi ve/veya Üretici kılavuzuna göre FACS parametreleri ayarlayın.</li>
	<li>
Başlangıçta karakterize örnek olayların istediğiniz sayıyı elde etmek. 1 x 104 5 x 104 olaylara sonraki sıralama adımları için belirli ağ geçitlerini belirlemek için sıralama önce analiz.
	<ol>
<li>Gates belirlemek: ileri dağılım (FSC) ve hücresel enkaz (şekil 2A-C)17hariç yan dağılım (SSC) parametreleri kullanarak lenfosit ve progenitör hücre kapıları tanımlayın. FSC ve SSC hücre boyutu/çapı ve taneciklik, sırasıyla karşılık gelir. Not: GFP-, GFPlove GFPMerhaba hücreleri 10-için-100-kat onların GFP floresan yoğunluğu açısından bu nüfus basit (Şekil 2-5) ayrılması yapma farklı. Canlı ölü ayrımcılık bu noktada propidium iyot (PI) veya 7-aminoactinomycin D (7-AAAD) Boyama canlılık kullanarak tespit edilebilir. PI ile önceki deneyler genellikle göstermek > % 95 canlılığı GFP+ hücre FACS sonra.</li>
		<li>Hücre birini kullanılan FACS makine parametrelere göre hariç.</li>
		<li>Lenfoid ve/veya öncül gates içinde sayısını ve GFP+ hücreleri yüzdesini belirleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Phycoerythrin (PE) ve GFP yoğunluklarda kullanın, GFPlo GFPMerhaba hücreleri vs vs GFP için- geçidi tanımlamak. Not: B hücreleri loş GFP Floresans sergi ve T hücreleri parlak GFP lck:eGFP satırları gösterir. Birçok lenfoid organlar ya da tümör örnekleri her iki GFP+ örneğin alınma olasılığını içerir. B-lineage hücreler/B-tüm GFPlo ve T-lineage hücreler/T-ALL vardır GFPMerhaba. GFP-, GFPlo, GFPMerhaba hücreleri arasında ayrım yapmalarını geçitlerini tanımlamak ve bu nüfus ayrı ayrı toplamak (şekil 2A-C, şekil 3A-C, şekil 4A ve şekil 5A).</li>
	<li>Her hücre nüfus medya sıralama 2 mL içeren farklı 15 mL polipropilen borular veya doğrudan farklı 1,5 mL tüpler (örneğin, RNA, DNA veya protein ayıklama, allo-nakli, vb) daha fazla analizleri için uygun bir arabellek içeren sıralamak.</li>
	<li>Arıtılmış hücreler buz daha fazla analizleri önce tutmak.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir çatışma bildirin.

Biz gelişmiş ve bu B-lineage etiketleri3,4ile diğer D. rerio modeller ekleme lck:eGFP transgenik Zebra balığı, B hücreleri izole etmek için bir protokol sağlar. Biraz şaşırtıcı, GFPlo B hücreleri bu satırdaki tanımlaması açıklamasını 2004 yılında beri gözden kaçmış gitmiş. Genel olarak, lck T hücre özgü6olarak kabul edilir, ama beklenmedik lck ifade doğal öldürücü ve myeloid de<sup class="xref...

Zebra balığı genetik yaklaşımlar kullanarak eğitim omurgalı geliştirme kolaylaştırmak güçlü öznitelikleri genetik manipulability, yüksek verimlilik, optik kalınlığı ve hızlı bir gelişme gibi sunuyoruz. Teleost ve memeli hematopoiesis, paylaşılan özellikleri ile birlikte bu avantajları D. rerio larva yetişkinlik boyunca erken kendi görünümünü gelen lymphopoiesis ve lenfosit fonksiyon içinde vivo analizleri için ideal kılar. Zebra balığı kan geliştirme memeliler ile paylaşılan iyi korunmuş genetik işlemleri üzerine dayanır ve bunlar edinilmiş bağışıklık sistemi genişletmek. Ayrıca, moleküler mekanizmaları lenfoid geliştirme yöneten Zebra balığı ve memeliler1arasında son derece korunmuş.
Son 2 yılda bu etiket belirli kan soy transgenik D. rerio hatları ve mutant satırları bu soy eksik2,3,4,5oluşturulmuştur. Bunlardan lck:eGFP transgenik hattı, Zebra balığı lenfosit protein tirozin kinaz (lck) organizatörü GFP ifade6sürücü için kullanır. Çok T-lineage öncüleri ve Olgun T lenfositler tarafından ifade edilir, bu gen içinde vivo timik T hücre gelişimi ve ex vivo arıtma T-lineage hücre FACS7tarafından izleme sağlar. Daha önce biz bu hat bir ileri genetik trk mutagenesis ekran germline mutantlar T-ALL için eğilimli tanımlamak ve genetik olaylar somatically satın T hücre oncogenesis8,9' a bağlı çalışma için kullanılır.
Son zamanlarda, bizim laboratuvar lck:eGFP Zebra balığı yardımcı programı daha da genişletilmiş. Çift-transgenik rag2:hMYC içinde (insan MYC), T-ALL 10, geliştirmek için bilinen lck:eGFP ö rerio keşfettiğimiz B lineage tüm da11oluşur. B-tüm loş floresan T-ALL parlak yüksek GFP ifade nedeniyle belli, bu modelde aksine düşük GFP düzeyleri nedeniyle balık fena halde üzerinden bu T-ALL ile floresan mikroskopi tarafından ayırt edici olması için B-ALL ile izin. Bu fark GFP ifade de GFPlo B-tüm hücreleri ayrılması GFPMerhaba --dan T-tüm hücreleri FACS11kullanarak verir. Ayrıca, düşük lck ifade insan B-tüm Ayrıca hızlı düşük seviyelerde LCK11,12B-ALL, Zebra balığı benzersiz değildir. Aynı şekilde, normal B lineage hücreleri D. rerio, fareler ve insanlar da lckseviyesinin düşük hızlı /Lck/LCK, olgunlaşmamış B hücreleri ile sahip en yüksek ifade11,13. Hücre başına bazında, B-lineage hücreleri lckeGFP Zebra balığı veya türev satırı % 1-10 kadar GFP T lenfositler ifade. Bu GFPlo hızlı karakteristik B hücre mRNA'ların pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzve diğerleri gibi hücreleri ve kemik iliği, timus, dalak veya periferik saf kan11. Bu nedenle, her iki B - ve T-hücreler olabilir soy lckeGFP Zebra balığı ve rag2hMYC, lckeGFP hayvanlar, B ve T tüm hücreleri de söz konusu olduğunda11izole.
Burada, bizim iletişim kuralı lck:eGFP Zebra balığı ve rag2hMYC-kötü huylu veya kötü huylu B hücrelerinin verimli bir şekilde FACS arındırmak Malign B hücreleri için mevcut; lck:eGFP balık, çeşitli kaynak dokuları kullanarak. Bu hücreler aynı şekilde Akış Sitometresi FACS yalıtım, olmadan tarafından istenirse sayısal. Düşük lck ifade keşfi- ve sonuç olarak, GFP ifade düşük-B tarafından hücreleri açar yeni kapılar için lckeGFP Zebra balığı, deneysel olanaklar içinde vivo B hücre gelişim çalışmaları gibi. Böylece, transgenik bu içini kaplamak, 2004'te, ilk rapor kullanmak o Zebra balığı edinilmiş bağışıklığın ile ilgili taze anlayışlar seçip ayırmak için aramak gibi yeni bir hayat var.

<table><tbody><tr><td>35 ve mikro; m mesh</td><td>Sefar Filtre teknolojisi</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polistiren yuvarlak-Hücre süzgeç kapaklı alt tüp</td><td>Falcon Corning Marka</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>VWR uluslararası</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 Floresan mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etil 3-aminobenzoat metansülfonat; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır Serumu</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lck:eGFP</td><td></td><td></td><td>Bkz. Langeneu ve diğerleri, 2004</td></tr><tr><td>NIS Elements yazılımı</td><td>Nikon</td><td>Sürüm 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Havaneli mikro tüp homojenizatörler</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>Plastik Transfer pippetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rag2:hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>Bkz. Gutierrez ve diğerleri, 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

İzoleli malignant ve sigara-malignant b hücreleri lck:egfp zebra balığı

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebra balığı (Danio rerio) lenfosit geliştirme eğitim için güçlü bir model vardır. Memeliler gibi D. rerio B ve T lenfositleri içeren bir adaptif bağışıklık sisteminin sahip. D. rerio hücre yüzey işaretleyicileri tanıma antikorlar genellikle yalıtım ve karakterizasyonu B lineage dahil olmak üzere farklı lenfosit nüfusun karmaşık hale getiren, olmaması nedeniyle Zebra balığı lymphopoiesis çalışmaları zor hücreleri. Transgenik satırları lineage özgü fluorophore ifade ile sık sık bu zorluğu aşmak için kullanılır. Transgenik lck:eGFP satırı D. rerio T hücre gelişimini incelemek için kullanılan ve aynı zamanda modeli T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) kullanıldığında vardır. LCK:eGFP balık yaygın olarak T-lineage çözümlemek için kullanılan olsa da, bunlar B hücreleri çalışmaya kullanılmıştır değil. Son zamanlarda, birçok Zebra balığı B hücreleri de lck, hızlı da olsa daha alt düzeylerde keşfettik. Sonuç olarak, lck:eGFP B hücreleri aynı şekilde GFP seviyesinin düşük hızlı. Bu bulgu üzerinde bağlı olarak, biz burada rapor lck:eGFP Zebra balığı B lineage hücrelerden arındırmak için bir protokol geliştirdik. Bizim yöntem lck:eGFP balık veya çift transgenik rag2:hMYCgibi ilgili satırları B hücreleri arındırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) kullanmak açıklar; LCK:eGFP balık. Bu satırları, B hücreleri, özellikle olgunlaşmamış B hücreleri, düşük ama algılanabilir seviyede hızlı GFP GFP son derece hızlı T hücrelerden ayırt edici olmalarını sağlar. B hücreleri kemik iliği, timus, dalak, kan veya diğer dokularda ayrılmış olabilir. Bu iletişim kuralı D. rerio B hücreleri, B hücre gelişimi ve B lenfosit maligniteler gibi konular üzerinde duruldu çalışmalar etkinleştirme arındırmak için yeni bir yöntem sağlar.

Biz analiz etmek için Akış Sitometresi ve FACS GFPlo ve GFPMerhaba hücrelerden timus, böbrek kemik iliği ve dalak lck:eGFP transgenik Zebra balığı, izole etmek için kullanılır. 3 aylık balık analizini timus çoğunlukla GFP+ lenfosit içerdiği ortaya koydu. GFP+ hücreler büyük ölçüde lenfoid kapıyı Traver vd.17tarafından daha önce açıklanan sınırlı. İki ayrı GFP+ nüfus, GFPlove GFPMerhaba<...

Transgenik lck:eGFP Zebra balığı GFP son derece T lenfosit hızlı ve T hücre gelişimi ve Akut lenfoblastik lösemi çalışmaya kullanılmıştır. Bu satırı lck daha alt düzeylerde hızlı çalışma B hücreleri için kullanılabilir. Bu iletişim kuralı arıtma lck:eGFP Zebra balığı kötü huylu ve kötü huylu olmayan B hücre açıklar.

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Yakın zamanda LCK GFP zebra balığı birçok B hücreleri GFP düşük düzeyde ifade bulundu. Bu, bu satırı T hücrelerinin yanı sıra B hücrelerini incelemek için yararlı bir araç haline getirir. Bu tekniğin en büyük avantajı, artık LCK GFP zebra balığından B ve T hücrelerini inceleyebilir veya kanserli balıklardan B-ALL ve T-ALL hücrelerini inceleyebiliriz.Bu yöntemler zebra balığında B hücre gelişimini ve B-ALL çalışmalarını mümkün kılmaktadır. Adaptif bağışıklık sistemini anlamak la ilgili olan ve pediatrik kanserde yaygın olan maligniteler. Eğer daha önce bu diseksiyonları hiç yapmadıysanız, iyi timus ve ilik örnekleri elde edinceye kadar tekniğinizi birkaç kez geliştirmek isteyebilirsiniz.Görsel gösteri, izleyicilerin balıklarda akıcı ve B-ALL'ı tanımalarına ve b ve t hücrelerini izole etmek için ayıracak doğru ayarları seçmelerine yardımcı olur. Balık sistemi suyunda %0.02 Tricaine ile anestezi yaptıktan sonra, dorsal kavitenin dorsal medial kısmında floresan timi için iki ila altı aylık zebra balıklarını incelemek için bir epifloresan mikroskobundaki GFP filtresini kullanın. Timus bir Petri kabında ötenazi balık yer ve GFP pozitif timi kaldırmak için floresan mikroskop kullanın yerini sonra.Ve brightfield mikroskobu böbrek iliği ve dalak hasat için ayarlar. Toplanan her organı 500 mikrolitre soğuk sıralama ortamı içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve buz üzerindeki dokuları homojenize etmek için bir havaneli mikrotüp homogenizer kullanın. Daha sonra, homojenize edilmiş dokuyu 35 mikrometrelik bir kafes filtresinden geçirerek tek bir hücre süspansiyonu oluşturup hücreleri buza yerleştirin.İki ila dört ay dan itibaren çift-transgenik rag2 ekran için bir floresan mikroskop kullanın:hMYC LCK EGFP balık parlak T hücreli akut lenfoblastik lösemi veya T-ALL ve dim B-ALL hayvanları tanımlamak için yüksek maruz kalma ayarlarını belirlemek için düşük pozlama ayarlarını kullanarak. Yabani tip kontrol ve pre-lösemik balıklar GFP sadece timus lokalize var. Basit bir üç kategori sistemi kullanarak GFP floresan derecesine göre balık kategorize.Birinci seviye balıklar, sadece sınırlı lokal yayılımı olan timik tümör olarak floresan sinyali gösterirler. Seviye iki balık timus ötesinde vücudun az% 50 içeren bir floresan sinyal göstermektedir. Ve üçüncü seviye balıklar vücudun %50'sinin ötesine uzanan floresan sinyali gösteriyor.Tüm ile balık ayırın kanser olmayan. Ve yeni ALL gelişimi için bir kez aylık GFP pozitif tümörler olmadan pre-lösemik balık izlemek. T veya B-ALL hücre izolasyonu için bir ötanazi seviyesi üç balık baş ve timik bölge kaldırmak ve bir petri kabına vücut yerleştirmek için bir jilet kullanın.Beş mililitrelik bir tüp içinde hücreleri ve orta toplama, soğuk sıralama orta 500 mikrolitre ile balık periton boşluğu yıkamak için bir P-1000 pipet kullanın. Taze bir pipet ucu kullanarak vücut boşluğuna soğuk sıralama ortamının 2 ila üç ila 300 mikrolitre hacimleri enjekte edin ve beş mililitrelik tüp içine vücut boşluğundan hücreleri dışarı çıkarmak için balık vücuduna nazik basınç uygulamak için pipet ucunu kullanın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 35 mikrolitrelik bir örgü filtresi ile süzün.Ve hücreleri akış sitometrisi ile analiz edene kadar buzun üzerine yerleştirin. Tüm vücut homojenizasyon için balık vücut homojenize ve tüp için soğuk sıralama orta ek 300 mikrolitre eklemek için bir havaneli mikrotüp homogenizer kullanın. Hücre süspansiyonuna 35 mikrometrelik bir örgü filtre den filtre uygulayın ve filtreyi yalnızca doku enkazı filtrede kalana kadar gerektiğinde ek sıralama ortamıyla yıka.Daha sonra, analizleri bitene kadar hücreleri buza yerleştirin. Yalıtılmış hücrelerin akış sitometrik analizi için akış sitometre parametrelerini üreticinin yönergelerine göre ayarlayın. Ve lenfosit ve ata hücre kapılarını tanımlamak için ileri dağılım ve yan dağılım parametrelerini ayarlamak ve hücresel enkaz dışlamak için 10, 000-50, 000 olay elde.Hücre doublets hariç ve gfp pozitif hücrelerin sayısını ve yüzdesini belirlemek için lenfoid ve / veya öncü kapıları kullanın. Phycoerythrin ve GFP yoğunlukları kullanarak GFP negatif karşı GFP düşük karşı GFP yüksek hücreleri için kapıları tanımlar. GFP düşük ve GFP yüksek hücreleri izole etmek için kapıları nerede yerleştirmek için öğrenme saf B ve T hücre popülasyonları elde etmek için önemlidir.İki farklı GFP pozitif popülasyon, GFP düşük B hücreleri ve GFP yüksek T hücreleri timus elde edilebilir. Üç aylık zebra balığının böbrek iliğinde bulunan B hücreleri düşük düzeyde GFP ifade eder. GFP yüksek hücreleri ancak nadirdir, T lenfositlerin sadece küçük bir yüzdesi üç aylıkken ilik mevcut olduğunu gösteren.Aynı şekilde, dalak örnekleri GFP yüksek hücrelere göre düşük GFP daha yüksek yüzdeleri göstermektedir. Henüz akut lenfoblastik lösemi gelişmemiş çift transgenik balıklarda timus, ilik ve dalaktaki GFP ekspresyonu tek transgenik LCK EGFP balıklarında görülene benzer. Ancak, organ başına lenfosit lerin sayısı artar.Muhtemelen, rag2 organizatörü aktif olduğu olgunlaşmamış B ve T hücre popülasyonlarının MYC tahrik genişleme nedeniyle. B ve T-ALL ile çift transgenik balık altı ay b-ALL çoğunlukla GFP düşük hücreleri içeren loş floresan kanserler geliştirdik. Buna karşılık, parlak floresan balık ya izole T-ALL veya GFP düşük B-ALL ve GFP yüksek T-ALL hücrelerinin karışık popülasyonları barındırabilir.Nitekim, kantitatif polimeraz zincir reaksiyon analizi GFP düşük hücreleri tarafından değerlendirildiği gibi B hücre transkript yüksek düzeyde ifade. Ve GFP yüksek hücreleri T hücre genleri, LCK ve GFP belirteci yüksek düzeyde ifade. Bu mikroskop ile B-ALL ile balık tanıma öğrenmek için önemlidir.Ve nasıl düzgün GFP düşük ve GFP yüksek nüfus ayırmak için akış sitometri kapıları tanımlamak için. Bu prosedürü takiben, DNA, RNA veya proteini GFP düşük ve GFP yüksek hücrelerinden PCR, sıralama, kanda veya in vivo transplantasyon deneylerinde ne varsa izole edebilirsiniz. LCK GFB balıklarının T hücrelerine ek olarak floresan B hücrelerine sahip olduğunu öğrendikten sonra b ve T-ALL'ı değerlendirmek için aynı hayvandan her iki hücre tipini de inceleyebiliriz.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Sınırlandırılması seyreltme hücre nakli deneyleri, tümör yayılan hücrelerinin sıklığını belirlemek için kullanılır. Bu protokol, floresan etiketli lösemi ve yetişkin zebrafish periton boşluğuna seyreltme sınırlayan bu lösemi hücreleri izole etmek ve nakli nasıl detayları gelişen singeneik Zebra balığı üretmek için bir yöntem açıklanır.

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Bu protokol, floresan olarak işaretlenmiş T hücreli akut lenfoblastik lösemi (T-ALL) tümör hücrelerini yetişkin bir zebra balığından izole etme ve bunları tripan mavisi boya kullanarak ölçme tekniğini açıklar.

Floresan Etiketli T-ALL Hücreleri İzolasyonu: Yetişkin Zebra Balıklarından T-ALL Hücrelerini İzole Etmek İçin Bir Yöntem

Burada, zebra balığı iskelet kası ve embriyonal rabdomiyosarkomun (ERMS) erişkin bağışıklık sistemi baskılanmış rag2E450fs homozigot mutant zebra balığına hücre nakli için bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, kas hücrelerinin rejenerasyonu ve malign dönüşümünün verimli bir şekilde analiz edilmesini sağlar.

Bağışıklık Aşılmasına Yetişkin Zebra balığı içine normal ve malign Kas Hücre Nakli

Bu protokol, zebra balığı embriyolarından tek hücreleri izole etmek, ilgilenilen hücreleri zenginleştirmek, mikroakışkan tabanlı tek hücreli multipleks sistemlerde zebra balığı hücrelerini yakalamak ve tek hücrelerden gen ekspresyonunu değerlendirmek için bir yöntemi tanımlar.

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

Burada, myc-uyarılan T-hücreli akut lenfoblastik lösemi zebrabalıkları modelinde (T-ALL) yan nüfus hücreleri izole etmek için bir teknik açıklanmaktadır. Bu yan popülasyon deney yüksek oranda hassastır ve zebra balığı, T-ALL için tarif edilen, ancak diğer kötü huylu ve kötü huylu olmayan zebra balığı hücre tiplerine uygulanabilir.

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

Burada, bir hücresel elektrik voltaj muhabir Zebra balığı çizgi embriyonik gelişim, hareket, görselleştirmek için oluşturma sürecini göstermek ve in vivobalık tümör hücreleri.

Zebra balığı erken embriyo ve tümör hücresel elektrik aktivitesinin görselleştirme

Bu makale, nöroblastom zebra balığı modelinde, özellikle kendiliğinden metastaz geliştiren MYCN ve LMO1'in aşırı ifade edilmesiyle transgenik zebra balığı hattında tümör metastazını gerçek zamanlı olarak geliştirme, karakterize etme ve izleme yöntemini tanıtır.

Nöroblastom Metastaz Zebra Balığı Modeli

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Zebra balığı T-akut lenfoblastik lösemi modelindeki hareketsiz hücreleri tanımlamak için hücre proliferasyon boyaması kullandık. Leke, bölünmeyen hücrelerde tutulur ve hücre proliferasyonu sırasında azaltılır, bu da daha fazla sorgulama için hareketsiz hücrelerin seçilmesini sağlar. Bu protokol, hücresel sessizlik bağlamında kendini yenilemeyi incelemek için işlevsel bir araç sağlar.

Zebra Balığı T Hücreli Akut Lenfoblastik Lösemi Modelinde Hareketsiz Hücrelerin Hücre Proliferasyonu Boyama Kullanılarak Tanımlanması 

Keşfedin, lck:eGFP transgenik zebra balığı kullanarak malign ve non-malignant B hücrelerinin izolasyonunu. Bu yöntem, akut lenfoblastik lösemi ve adaptif bağışıklık sistemi araştırmalarında değerli bilgiler sunar.

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

Daha fazla video keşfet