Name: İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Öğrenin, geliştirilmiş Maya bir melez ekran yöntemiyle insan DNA dizilerine bağlanan transkripsiyon faktörlerini tek deneyde 1000'den fazla TF tarayarak belirlemeyi. Fonksiyonel genomik araştırmaları için güçlü bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri [J.I.F.B. için R35-GM128625] tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlıkları
<ol><li>
SC −U −H levha (150 mm Petri yemekler) Not: Bu tabakları DNA-yem maya suşları büyüyen için kullanılacaktır.<ol>
<li>Bırakma mix, Maya azot Bankası (YNB), adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 5 M NaOH (yaklaşık medya litre başına 1 mL; kompozisyon için bkz: Tablo 2 ) ile geçiyoruz. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.</li>
		<li>Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).</li>
		<li>Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.</li>
		<li>Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de heyecan tabağa ve serin bir su banyosu içinde 55 ° c.</li>
		<li>Lösin ve triptofan ortamına Ekle. De heyecan tabağa mix ve 150 mm Steril Petri yemekler (çanak başına ~ 80 mL) içine dökün. 3-5 gün oda sıcaklığında, Kuru şal plastik torbalarda ve 6 aya kadar oda sıcaklığında saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
YAPD dikdörtgen tabak Not: Bu tabakları DNA-yem zorlanma ve TF dizi koleksiyonu ile çiftleşme için çim büyüyen için kullanılacaktır.<ol>
<li>(Bkz Tablo 3 . kompozisyon için) tozlar, agar dışında 950 mL su 2 lt şişeye içinde dağıtılması ve heyecan çubuğu ekleme.</li>
		<li>Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).</li>
		<li>Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.</li>
		<li>Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün.</li>
		<li>Glikoz ekle mix de bir heyecan plaka ve serin ile 55 ° c Medya dikdörtgen kalıplara dökmek ( Tablo malzemelerigörmek; ~ 70 mL plaka başına) peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve depolamak için 6 aya kadar soğuk odasında. Not: Önerilen ortam birimi plaka başına 70 mL olsa da, 50-80 mL plaka başına kullanılabilir. Otelde 1 dökme tabaklara dikkate alınacak üç kritik konular) agar medya plaka boyunca aynı kalınlıkta olması onlar seviyelendirilir (plaka dökme için düzeltilmiş tablo veya yüzey kullanma ve yediden fazla tabak yığınlarda dökmek değil) 2) agar kabarcıkları yokluğu sağlamak için medya (balonlar attı bir steril iğne kullanarak) ve 3) tabakları sadece bir gün için kurutma ambalajlama ve tabakları Maya sabitleme içinde hatalarını önlemek için plastik torbalarda.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −Trp ve Sc −U −Trp dikdörtgen tabak Not: Bu tabakları TF dizi koleksiyon (Sc −Trp) büyüyen ve diploit Maya (Sc −U −Trp) çiftleşmeden sonra erkeğini seçmek için kullanılır.<ol>
<li>Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 920 ml su ve pH ile 5,9 NaOH 5 M (yaklaşık medya litre başına 1 mL) ile dağıtılması (bkz. kompozisyon için Tablo 4 ). Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.</li>
		<li>Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 950 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).</li>
		<li>Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.</li>
		<li>Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin karıştırın de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye</li>
		<li>(Sc −U −Trp plakalar urasil'ı atın) lösin, histidin ve urasil ekleyin.</li>
		<li>Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. Oda sıcaklığında 1 günde kuru, tabakları plastik torbalarda kaydırmak ve Soğuk Oda 3 aya kadar saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp + 3AT + X-gal dikdörtgen levha Not: bu plaka okuma plakaları eY1H deneyleri için kullanılacaktır.<ol>
<li>Bırakma mix, YNB, adenin hemisulfate ve amonyum sülfat 850 mL su içinde erimesi (bkz. kompozisyon için Tablo 5 ). Değil pH yapmak. Bir 2 L şişe dökün ve bir heyecan çubuğu ekleyin.</li>
		<li>Bir ikinci 2 lt şişeye, agar 850 mL su ekleyin (Otoklav içinde kaynamaya agar neden olur gibi bir heyecan bar eklemeyin).</li>
		<li>Otoklav 40 dk 15 psi bir sıvı döngüsü üzerinde az için.</li>
		<li>10 BU tuzları (1 L) x 900 mL su, Na2HPO4∙7H2O 70 g ve 34,5 g NaH2PO4∙H2O. tozlar dağıtılması ve 7.0 kullanarak 5 M NaOH pH ayarlamak için bir heyecan çubuğunu kullanarak Mix birleştirerek hazırlayın. 1 L ve basınçlı kap getirmek için su ekleyin.</li>
		<li>X-gal çözüm bir 50 mL plastik tüp dimetil formamide 42,5 mL içeren 3.5 g X-gal tozu ekleyerek hazırlayın. X-gal toz daha kolay çözülmeye dimetil formamide ekleyin (Bu 30 dakika sürer). Hisse senedi çözüm (kullanım opak 50 ml tüp veya kapak folyo) anlatmamanı. -20 ° C'de mağaza</li>
		<li>Hemen heyecan bar şişe içeren agar dahil ilk şişeye içeriğini dökün. Glikoz ekleyin ve 10 x (bkz. Tablo 5 kompozisyon için) BU tuzları, mix de bir heyecan plaka üzerinde ve serin 55 ° C'ye</li>
		<li>(Bkz. Tablo 5 kompozisyon için) lösin, 3AT ve X-gal ekleyin.</li>
		<li>Mix de bir heyecan plaka üzerinde ve dikdörtgen tabaklar (plaka başına ~ 70 mL) içine dökün peristaltik pompa (5 mL/sn) ve 6 mm boru kullanma. 1 günde, oda sıcaklığında, Kuru sarın plastik torbalarda ve alüminyum folyo kaplı soğuk odada depolamak (3AT ve X-gal ışığa duyarlı olan) en fazla 1 ay.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. bir TF dizi lekelenme
<ol><li>
TF-av dizi çözdürme
	<ol>
<li>TF-av dizi buz ile Maya gliserol hisse senedi plakalar çözülme. Not: Daha önce yayımlanmış10,12,13,18TF-av diziler oluşturulabilir.</li>
		<li>Bir sonraki adım önce 1-3 dakika içinde 12 kanallı pipet kullanarak Maya resuspend.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maya Sc −Trp dikdörtgen tabaklar lekelenme.
	<ol>
<li>HDA robot (bakınız Tablo malzemeler), select çok iyi 96 plakaları kaynak, hedef ve 96 uzun PIN altlığı olarak 96 ağar kaplamalar olarak. Not: PIN pad yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.</li>
		<li>96-şey plaka başına iki kopya yapmak için Çoğaltmak birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanmayın veya dondurulmuş stoklarının arka kirlenmesini önlemek için seçenekleri tekrar.</li>
		<li>Yukarı ve aşağı Maya karışımı kaynağında girdap seçeneğini belirleyin.</li>
		<li>Benekli dizi çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2 – 3 gün kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
384 koloni diziler Sc −Trp dikdörtgen levha üretme
	<ol>
<li>Robotun içine 96 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa PIN altlığı seçin.</li>
		<li>1:4 dizi programı seçin. Bu şekilde, dört 96 koloni tabak (her bir farklı TF içeren) bir 384 koloni plaka konsolide edilecek. Geri dönüşüm kullanmayın veya seçenekleri farklı plakalar arasında kirlenmesini önlemek için tekrar.</li>
		<li>Tabakları çanta ve benekli 384-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C de 2 gün kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp dikdörtgen levha 1.536 koloni diziler oluşturma Not: Bu dört kolonileri her TF avlarına içeren diziler sonuçlanır.<ol>
<li>Robotun içine 384 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 384 kısa PIN altlığı seçin.</li>
		<li>1:4 tahlil tek kaynak programı seçin. Her koloni quadruplicates elde etmek için dört kolonileri kopyalamak için hedeftir. Geri dönüşüm kullanın ve işin içinde dört kez her koloni kopyalama seçenekleri tekrar.</li>
		<li>Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı 30 ° C'de 3 gün kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sc −Trp dikdörtgen tabaklar 1.536 koloni dizide yükseltecek
	<ol>
<li>Robotun içine 1.536 ağar kaplamalar kaynak, hedef olarak 1.536 ağar kaplamalar ve 1.536 kısa PIN altlığı seçin.</li>
		<li>3-4 kopya çoğaltmak için Çoğaltma birçok programı seçin. Geri dönüşüm kullanın ve seçeneği tekrar ama çapraz bulaşma kaçınmak için dizi farklı bir tabak için geçiş yaparken panelindeki atmak.</li>
		<li>Tabakları çanta ve benekli 1536-koloni dizi agar tarafı yukarı adımları (aşağıya bakın) çiftleşme için kullanmak 3 gün 30 ° C'de kuluçkaya. Bundan sonra tabakları oda sıcaklığında ve kopya tarama yeni bir turu için 7 gün sonra tekrar tutmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H ekran
<ol><li>
DNA-yem zorlanma çimenler çiftleşme için hazırlanıyor
	<ol>
<li>Maya DNA-yem suşları Sc −U −H plaka üzerinde spot ve 30 ° C'de 3 gündür büyümek</li>
		<li>Böylece her plaka 12-16 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün kuluçkaya</li>
		<li>Böylece her plaka 4 farklı suşları uygun Maya 15 cm steril bir kürdan kullanarak Sc −U −H plaka çizgi. 30 ° C'de bir gün için kuluçkaya</li>
		<li>Değil herhangi bir agar raspa ve 500 µL steril su ile 1,5 bir tüp içine eklemek emin steril bir kürdan kullanarak Maya kazı.</li>
		<li>10-15 steril cam boncuk YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya süspansiyon plaka üzerine ekleyin ve Maya kalenin yayılır emin olmak 1 dk her yöne iyice çalkalanır.</li>
		<li>Kalenin hemen ters çevir ve böylece boncuk kapak için dokunun. Kaldırmak ve boncuk geri dönüşüm.</li>
		<li>Tabakları çanta ve agar tarafı aşağı 30 ° C'de 1-2 gün kuluçkaya Daha sonra çiftleşme adıma geçin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Maya DNA-yem ve TF dizi suşları çiftleşme
	<ol>
<li>TF dizi YAPD dikdörtgen plaka robot ile aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Her TF dizi plaka 3-4 YAPD tabak (bağlı olarak dizi levha sayısı) aktarmak için kullanılabilir. Çiftleşme için kullanılan TF dizi tabak 2 – 3 gün eski olması gerekir ama çiftleşme olarak daha verimsiz olabilir.</li>
		<li>Bahçede büyük bir DNA-yem yük zaten içeren TF dizi robot YAPD plakaları aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak birçok programı seçin. Maya aynı noktadan almaktan kaçının için kaynak ~0.6 mm yarıçaplı rasgele sapmalarla kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak hedefte karıştırın. Kaynak ve hedef olarak 3.2.1. adımda benekli TF dizi içeren YAPD plakaları olarak DNA-yem suşları (Bölüm 3.1) içeren çim kullanın.</li>
		<li>Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 1 gün için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diploit Maya yelpazesi
	<ol>
<li>Şeklindeki Maya YAPD plakaları ile robot Sc −U −Trp tabakaları bana aktarın. Kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad 1.536 agar kalıbı seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin. Kaynak ve hedef karıştırın.</li>
		<li>Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C'de 2-3 gün (uzun kuluçka yüksek arka plan muhabir etkinliği için olur) için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Okuma plakaları için transfer
	<ol>
<li>Diploit Maya Sc −U −Trp plakalar aktarım okuma dikdörtgen tabaklar Sc −U −H −Trp + 5 mM 3AT + 0.4 mM X-gal robot kullanarak. 1.536 ağar kaplamalar kaynak ve hedef ve 1.536 kısa PIN pad seçin. Çoğaltmak istediğiniz programı seçin.</li>
		<li>Tabakları çanta ve agar tarafı yukarı 30 ° C de 7 gün için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Okuma plakaların görüntüleme
	<ol>
<li>Yüksek arka plan muhabir etkinliği ile DNA-yem suşları için gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, 4 ve 7 gün fotoğraf çekmek. Olumlu etkileşimler mantar kolonileri büyüme ve mavi renk tarafından tanımlanır ve el ile belirlenebilir veya görüntü analiz yazılımı kullanarak belirlenebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+transcription+factors%3A+function%2C+expression+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li>
<li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Human+Transcription+Factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li>
<li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-centered+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li>
<li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li>
<li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li>
<li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li>
<li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+ORC6%2C+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li>
<li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884(2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li>
<li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li>
<li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li>
<li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li>
<li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li>
<li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50(2012).</li>
<li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li>
<li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li>
<li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682(2013).</li>
<li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459(2011).</li>
<li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li>
<li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Robot eY1H çiftleşme tarama yaklaşımı büyük ölçüde burada açıklanan faiz önceki Kütüphane tarama için karşılaştırıldığında, ya da dönüşüm üzerinde göre dizilmiş tarama yaklaşımlar bir DNA bölgesine bağlamak TFs kümesini tanımlamak için daha fazla işlem hacmi artar. Ayrıca, tüm dört kolonileri için olumlu TF test edilmiş ve etkileşimleri yüzde 90'ını aynı Maya DNA-yem zorlanma10 bağımsız bir ekranda tekrar test etkileşimleri % 90'ı tespit deneyleri son derece tekrarlanabilir şunlardır eY1H tarafınd...

Biyomedikal alanında merkezi bir sorun hangi tarafından her insan gen düzenlenmiştir mekanizmaları belirliyor. Transkripsiyon gen ifade düzeyleri kontrol ilk adım, ve bu her gen özgüdür transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tarafından düzenlenir. Verilen bu insan için kodlamak > her gen ifadesi kontrol TFs eksiksiz kümesi tanımlayan 1.500 TFs1,2, kalır açık bir meydan okuma.
İki tür yöntemi TF-DNA etkileşimleri eşlemek için kullanılan: TF merkezli ve DNA merkezli yöntemleri3 (resim 1A). TF merkezli yöntemlerinde, bağlama genomik DNA bölgeleri veya onun DNA bağlama özgüllük belirlemek için bir TF ilgi probed. Bu yöntemler yüksek üretilen iş sıralama, protein bağlayıcı microarrays ve SELEX4,5,6takip kromatin immunoprecipitation (ChIP) içerir. DNA merkezli yöntemlerinde, DNA dizisi bağlamak TFs kümesini belirlemek için bir DNA dizisi ilgi probed. Bu yöntemlerden en yaygın olarak uygulanan Maya bir hibrid (Y1H) deneyleri, TFs ve DNA arasında hangi etkileşimleri bölgeleri reporter genler7,8,9kullanarak Maya çekirdeği ortamda test edilir var.
Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (örneğin, organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek9,10 için (Şekil 1B) ekranlı av,'. DNA-yem akıntıya karşı klonlanmış iki muhabir gen (LacZ ve HIS3) ve her iki DNA-bait::reporter yapıları chromatinized 'DNA-yem suşları.' oluşturmak için Maya genom entegre edilmiştir TF-av, harekete geçirmek etki alanına Gal4 TF, Maya (AD) erimiş bir TF ifade eder bir plazmid kodlanmış TF-DNA etkileşimleri için balık için DNA-yem gerilim girmiştir. TF-av DNA-yem sırasına bağlanır, TF-av içinde mevcut reklam her iki gazeteci genleri harekete geçirmek yol açacaktır. Sonuç olarak, olumlu etkileşim içeren hücreler büyüme histidin eksik yanı sıra bir rekabetçi inhibitörü, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT), üstesinden plakaları için seçilen ve X-gal huzurunda mavi koloniler olarak görüntülenir. Çünkü güçlü Maya Gal4 AD kullanıldığında, Y1H deneyleri ilgili transkripsiyon aktivatörleri yanı sıra repressors etkileşimleri algılayabilir. Ayrıca, verilen bu TF-dualarının güçlü Maya organizatörü (ADH1) ifade edilir, etkileşimleri için bile çip11,12' algılamak için zorlu düşük endojen ifade seviyesine sahip TFs algılanabilir.
Y1H deneyleri gerçekleştirmek için en yayımlanmış protokolleri seçimi, koloni tespit ve etkileşen TF tanımlamak için sıralama veya havuza alınmış TF-av kitaplıkları dönüştürerek Maya DNA-yem suşları TF-dualarının tanıtımı üzerinde temel alan bireysel dönüşüm8,9klonlar. Bunlar araştırmacı test edilebilir DNA dizileri sayısını sınırlama zaman alıcı kurallarıdır. Y1H deneyleri, adı verilen bir son gelişme Y1H Gelişmiş (eY1H), önemli ölçüde artmıştır tarama işlem hacmi Maya DNA-yem suşları maya suşları topluluğu ile her bir farklı ifade dostum için bir yüksek yoğunluklu dizi (HDA) robot platformu kullanarak TF-av10,13 (Şekil 1 c). Bu ekranlar bir 1.536 koloni biçimine izin en insan TFs sadece üç tabak kullanarak quadruplicate test etmek için istihdam. TF-DNA etkileşimleri ikili bir şekilde test edilir göz önüne alındığında, daha fazla, bu yaklaşım etkileşimler DNA-yemler (örneğin iki kodlamayan tek nükleotid çeşitleri) arasında farklı TFs arasında karşılaştırmak için olanak tanır veya TF türevleri11,12 ,14.
EY1H deneyleri kullanarak, biz en büyük insan ve Caenorhabditis elegans DNA merkezli TF-DNA etkileşimleri ağlar-Tarih belirlendi. Özellikle, 246 insan gelişimsel arttırıcılar ve 283 TFs122,230 Hofstede belirledik. Ayrıca, biz eY1H deneyleri 109 tek nükleotid kodlamayan değişik gelişimsel malformasyonu, kanser ve nörolojik bozukluklar gibi genetik hastalıklar ile ilişkili değişmiş TF bağlama ortaya çıkarmak için istihdam. Daha yakın zamanlarda, eY1H 21,714 etkileşimleri 2,576 C. elegans gen rehberleri ile 366 TFs11arasında oluşan bir ağ betimlemek için kullanılır. Bu ağ, C. elegans TFs onlarca işlevsel rolü ortaya çıkarmak için bir vesile oldu.
Protokol DNA-yem lekeleri oluşturmak ve arka plan muhabir etkinliği düzeylerini değerlendirmek için başka bir yerde15,16,17bildirdi. Burada, herhangi bir insan genomik DNA bölge 1,086 insan TFs bir dizi karşı ekran için kullanılan bir eY1H boru hattı açıklayın. Bir kez bir Maya DNA-yem zorlanma oluşturulur ve bir TF-av dizi karşılık gelen tabak fark edilir, tüm protokol iki haftada (Tablo 1) gerçekleştirilebilir. Daha da önemlisi, böylece tek bir araştırmacı 60 DNA-yem dizileri aynı anda ekran protokol parallelized. Protokol göstermek için iki sitokin gen CCL15 ve IL17F ve ekranlı. Buna ek olarak, eY1H deneyleri ve onları giderme işlemi sırasında ortaya çıkabilecek sorunları türlerini göstermek için başarısız ekranlar sonuç göster.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (3AT) ~% 95 TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td> HIS3 geni Adenin sülfat (hemisülfat), dihidrat US Biologicals A0865 <td>ürünleri için rekabetçi inhibitör</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Uygun maya büyümesi için gereklidir</td></tr><tr><td>Agar Yüksek Jel Mukavemeti - Bakteriyolojik sınıf</td><td>Amerikan Uluslararası Kimyasal</td><td>AGHGUP</td><td>Maya büyümesi için besleyici ortam</td></tr><tr><td>Amonyum Sülfat</td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Sentetik maya ortamında nitrojen kaynağı</td></tr><tr><td>D + Susuz</td><td>Glikoz US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Maya büyümesi için gerekli</td></tr><tr><td>Bırakma Karışımı eksi His, Leu, Tryp ve Urasil, maya azot bazlı adenin açısından zengin</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Maya büyüme kenarı için gerekli sentetik komple ortam</td></tr><tr><td>Çok Parametreli pH Metre</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Seçici ortamın pH'ını ölçmek için</td></tr><tr><td>Düz Kürdan 750 ct</td><td>Elmas</td><td></td><td>Bezelyeleri petritlerin üzerine sürmek için</td></tr><tr><td>Cam Boncuklar</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Çim yaparken mayayı püskürtmek için</td></tr><tr><td>Gliserol & %99</td> <td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Dondurulmuş maya stokları yapmak için gereklidir</td></tr><tr><td>L-Histidin</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Seçici ortamda maya büyüme seçimi için</td></tr><tr><td>L-Lösin</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Seçici ortamda maya büyüme seçimi için</td></tr><tr><td>L-Triptofan</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>Seçici ortamda maya büyüme seçimi için</td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamid</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>X-gal çözeltisi yapmak için</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Singer plakalarına doğru hacimlerde ortam dağıtmak için</td></tr><tr><td>Peptone, Bakteriyolojik</td><td>Amerikan Uluslararası Kimyasal</td><td>PEBAUP</td><td>Maya büyümesi için gerekli protein kaynağı</td></tr><tr><td>Petri Kabı, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Maya yemleri yetiştirmek için tarama</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td> Singer Robot Hassas Düşük Sıcaklık BOİ Soğutmalı İnkübatör ThermoFisher Scientific PR205745R ile <td>kullanmak üzere dikdörtgen agar plakaları yapmak</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>için Maya plakalarını sabit sıcaklıkta inkübe etmek için</td></tr><tr><td>RePads 1.536 kısa</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>TF-av dizisini aktarmak için, mayayı eşleştirin ve mayayı diploid seçim ve okuma plakalarına aktarın</td></tr><tr><td>RePads 384 kısa</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>TF-av dizisini 384'ten 1.536'ya aktarmak için koloni formatı</td></tr><tr><td>RePads 96 uzun</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>TF-prey dizisini gliserol stoğundan agar plakasına aktarmak için</td></tr><tr><td>RePads 96 kısa</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>TF-av dizisini 96'dan 384 koloni formatına aktarmak için</td></tr><tr><td>Singer HDA RoToR robotu</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Mayayı yüksek verimli bir şekilde aktarmak için</td></tr><tr><td>Sodyum Hidroksit (Peletler/Sertifikalı ACS)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Seçici ortamın pH'ını ayarlamak için</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat dibazik heptahidrat</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-203402C</td><td>X-gal&nbsp'de LacZ muhabir etkinliği için gereklidir;</td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat monobazik monohidrat</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-202342B</td>, <td>X-gal&nbsp'de LacZ muhabir etkinliği için gereklidir;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Seçici ortamda maya büyüme seçimi için</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-kloro-3-indoksil-beta-Dgalaktopiranosid)</td> <td>Altın Biyoteknoloji</td><td>X4281C100</td><td>&beta;-galaktosidaz, protein-DNA etkileşimini tespit etmek için renksiz X-gal mavisine döner</td></tr><tr><td>Maya Özü</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Mayanın</td></tr> <tr><td>büyümesi ve yayılması için besleyici ortamMaya Azot Baz (toz) AA, karbonhidrat ve AS&nbsp olmadan;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Güçlü maya büyümesi için gereklidir</td></tr></tbody></table>

İnsan dna dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş maya bir melez ekranlar

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Her insan gen düzenleyen transkripsiyon faktörleri (TFs) kümesi tanımlayan çok sayıda deneysel ve hesaplamalı yaklaşımlar entegre gerektiren bir iştir. Böyle bir yöntem hangi Hofstede TFs ve DNA bölgeleri reporter genler kullanarak Maya çekirdeği ortamda sınanır Maya bir hibrid (Y1H) tahlil olduğunu. Y1H deneyleri iki bileşeni içerir: bir 'DNA-yem' (e.g., organizatör, arttırıcılar, susturucu, vb) ve bir 'TF-hangi muhabir gen harekete geçirmek için ekranlı av,'. Y1H ekranlar yerine getirmek için kullanılan en yayımlanmış protokolleri TF-av kitaplıkları veya dizileri DNA-yem maya suşları dönüşüm üzerinde temel alır. Burada, biz bir ardışık düzen tanımlamak, gelişmiş Y1H denilen (eY1H) deneyleri, nerede TF-DNA etkileşimleri DNA-yem suşları dizilmiş bir koleksiyonundan bir yüksek yoğunluklu kullanarak TF-av suşlarının çiftleşme tarafından sorguya bir 1,536 tarama sağlar (HDA) robot platformu Koloni biçimi. Bu işlem hacmi dramatik bir artış sağlar (karşı 60 DNA-yem dizileri > 1000 TFs araştırmacı başına iki hafta alır) ve tekrarlanabilirlik. Biz insan organizatörü dizileri 1,086 insan TFs yanı sıra ekranlar ve onları giderme sırasında ortaya çıkabilecek sorunları örnekleri bir dizi karşı test ederek beklenen sonuçları farklı türleri gösterilmektedir.

Üç ana faktör ne zaman analiz eY1H deneyleri sonuçları düşünülmelidir: arka plan muhabir etkinliği DNA-yem baskı, TF-DNA etkileşimleri ve olumlu kolonileri sayısına karşılık gelen muhabir etkinlik gücünü. DNA-yem zorlanma arka plan muhabir etkinliği (örneğin, autoactivity) genel büyüme ve okuma plaka bir TF-av yokluğunda bile Maya kolonilerde rengini gösterir. İdeal olarak, bir arka plan beyaz veya açık kahverengi renk, Sigara autoactive suşları göstermek colonies olumlu etkileşimler için daha büyük ve mavi olmak. Autoac...

Burada, bir Gelişmiş Maya bir melez Protokolü faiz bir insan DNA bölgesine bağlayabilirsiniz transkripsiyon faktörleri (TFs) tanımlamak için eleme mevcut. Bu yöntem bağlama sorguya çekebiliriz yüksek üretilen iş tarama ardışık düzen kullanan > 1000 TFs tek denemede.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

Geliştirilmiş maya tek melez tahlillerin amacı, bir DNA ilgi dizisine bağlanan transkripsiyon faktörleri kümesini tanımlamaktır. Bu tekniğin avantajı, gelişmiş maya tek melez tahliller tek bir deneyde 1000'den fazla transkripsiyon faktörleri değerlendirebilirsiniz. Tersine, kromatin immünopresidivarı aynı anda sadece bir transkripsiyon faktörünü değerlendirir.Bu yöntem, gen yükselticilerine ve arttırıcılarına bağlanan transkripsiyon faktörlerinin repertuarını belirlemek ve kodlamayan varyantlara bağlanan değiştirilmiş transkripsiyon faktörünü belirlemek için fonksiyonel genomikler için önemli bir araçtır. Prosedürü gösteren Dr.Xing Liu benim laboratuvarımdan bir doktora sonrası olacak. Buz üzerinde TF av dizisi ile maya gliserol stok plakaları çözültün.12 kanallı pipet kullanarak mayayı yeniden askıya alın ve 1 ila 3 dakika içinde bir sonraki adıma geçin. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar içine maya nokta için, kaynak olarak multiwell 96 plakaları seçmek için yüksek yoğunluklu bir dizi robot kullanın, hedef olarak 96 agar plakaları, ve 96 uzun pin pedleri. Pin pedleri yeniden kullanılabilir değildir ve atılmalıdır.96 kuyu plakası başına iki kopya yapmak için Spot Birçok programını seçin. Dondurulmuş stokların geri kontaminasyonunu önlemek için geri dönüşüm veya yeniden kullanım seçeneklerini kullanmayın. Ayrıca, maya karıştırmak için kaynak yukarı ve aşağı girdap seçeneği seçin.Plakaları nereye ve ne zaman yerleştirebileceğinize yönelik talimatları uygulayın ve robotun mayayı Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalara yerleştirmesine izin verin. Çanta benekli dizi ve 2 ila 3 gün boyunca 30 derece santigrat kadar agar tarafı kuluçka. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalarda 384 koloni dizisi oluşturmak için kaynak olarak 96 agar plaka, hedef olarak 384 agar plaka ve 96 kısa iğne pedi seçin.Ardından 1:4 dizi tek kaynak programını seçin. Bu şekilde, dört adet 96 koloni plakası bir 384 koloni plakasında birleştirilir. Farklı plakalar arasındaki kirlenmeyi önlemek için geri dönüşüm veya yeniden kullanım seçeneklerini kullanmayın.Plakaları poşetle ve benekli 384 koloni dizisini 2 gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar 1536 koloni dizileri oluşturmak için, kaynak olarak 384 agar plakaları seçin, hedef olarak 1536 agar plakaları, ve 384 kısa pin pedleri. Ardından 1:4 tek kaynak programını seçin.Amaç, dört katına çıkarmak için her koloniyi dört koloniye kopyalamaktır. Her koloninin 4 kez kopyalanması yla ilgili olarak geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneklerini kullanın. Robotun talimatlarına uyun ve robotun 3 gün boyunca 30 santigrat derecede benekli 1536 koloni dizisini paketlemeden ve kuluçkaya yatırmadan önce mayayı plakalara göre tespit etmesine izin verin.Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar 1536 koloni dizi yükseltmek için, kaynak olarak 1536 agar plakaları seçin, hedef olarak 1536 agar plakaları, ve 1536 kısa pin pedleri. 3 ila 4 kopyayı çoğaltmak için Çoğaltma Çok programını seçin. Geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneğini kullanın, ancak çapraz kontaminasyonu önlemek için dizinin farklı bir plakasına geçerken pedi atın.Robotun Sc eksi triptofan dikdörtgen plakalar içinde 1536 koloni dizisini yükseltmek için izin verin. Son olarak, plakaları torba ve 30 derece santigrat kadar 3gün boyunca miyon adımlar için kullanmak için benekli 1536 koloni dizisi agar tarafı kuluçka. Dna yem zorlanma çimleri mite için hazırlamak için, bir Sc eksi urasil ve histidine plaka üzerinde DNA maya yem suşları nokta ve 3gün boyunca 30 santigrat derece büyümek.Her plaka 12-16 farklı suşları sığacak şekilde steril bir kürdan kullanarak 15 santimetre Sc eksi urasil ve histidin plaka içine maya Streak. Tabağı bir gün 30 derecede kuluçkaya yatırın. Ertesi gün, her plaka 4 farklı suşları sığar, böylece steril bir kürdan kullanarak 15 santimetre Sc eksi urasil ve histidin plaka içine maya çizgi.Tabağı bir gün boyunca 30 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, steril bir kürdan kullanarak maya kazıyın, herhangi bir agar kazımak için emin olun. 500 mikrolitre steril su ile 1,5 mililitrelik bir tüp içine maya ekleyin.Şimdi 10 ila 15 steril cam boncuk ve maya süspansiyon bir YAPD dikdörtgen plaka üzerine ekleyin. Maya plaka boyunca yayılır sağlamak için bir dakika boyunca her yöne iyice çalkalayın. Plakayı hemen ters çevirin ve boncukların kapağına gitmesi için dokunun.Boncukları çıkarın ve geri dönüştürün. Tabakları poşetleyin ve 30 santigrat derecede 1 ila 2 gün boyunca agar tarafını kuluçkaya yatırın. Daha sonra, miyon adıma geçin.Maya DNA yemi ve TF dizi suşlarını çiftleştirmek için TF dizisini robotla birlikte YAPD dikdörtgen plakaya aktarın. Kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma Çok programı seçin.4 kaynak plakası ve geri dönüşüm ve yeniden ziyaret seçeneklerini seçin. Her TF dizi plakası 3-4 YAPD plaka transferi için kullanılabilir. Miteleme için kullanılan TF dizi plakaları 2 ila 3 günlük olmalıdır, ancak daha fazla değil, miyelik verimsiz olabilir.DNA yem sürüncünün çimlerini Zaten TF dizisini içeren YAPD plakalarına aktarmak için kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma Çok programı seçin. Aynı noktadan maya alarak önlemek için yaklaşık 0,6 milimetre yarıçapı ile kaynak rasgele bir ofset kullanın ve maya suşları arasında temas kolaylaştırmak için Hedef Mix seçin.Kaynak olarak DNA yem suşlarını içeren çimleri ve plakaları poşetleri poşetleyip bir gün boyunca 30 derecede agar tarafını kuluçkaya yatırmadan önce benekli TF dizisini içeren YAPD plakalarını hedef olarak kullanın. Diploid maya seçimi için kaynak ve hedef olarak 1536 agar plakasını seçin ve 1536 kısa pin pedini seçin. Çoğaltma programını seçin.Kaynakta ve Hedef'te Mix'i seçin. Robotun, plakaları poşetleyip 30 derecede 30 derecede 2-3 gün kuluçkaya yatırmadan önce, yapd plakalarından mated mayayı Sc eksi urasil ve triptofan plakalarına aktarmasını bekleyin. Şimdi, kaynak ve hedef ve 1536 kısa pin pad olarak 1536 agar plakaları seçin.Çoğaltma programını seçin. Diploid mayayı Sc eksi urasil ve triptofan plakalarından robotu kullanarak plakaiçeren okuma dikdörtgen 3-AT ve X-gal'a aktarın. Plakaları poşetleyin ve 7 güne kadar 30 santigrat derecede agar tarafını kuluçkaya yatırın.Yüksek arka plan muhabiri aktivitesi ile DNA yem suşları için, gün 2, 3 ve 4 fotoğraf çekmek. Aksi takdirde, gün 4 ve 7 fotoğraf çekmek. TF dizi plakalarını oda sıcaklığında tutun ve yeni bir tarama turu için 7 gün sonra tekrar kopyalayın.Gelişmiş maya tek melez tahliller kullanılarak elde edilebilir sonuçların türünü göstermek için, CCL15 ve IL17F genlerin organizatör bölgeleri 1086 insan TFs bir dizi karşı taranmış edildi. CCL15 organizatörü, etkileşimlerin, hatta zayıf olanların bile kolayca tespit edilebildiği, otoaktif olmayan DNA yemi örneğidir. IL17F organizatörü bazı etkileşimler tespit edilebilir düzensiz arka plan muhabiri etkinliği ile bir otoaktif DNA yem bir örnektir, birkaç TFs için ise, muhabir etkinliği arka plan daha yüksek olup olmadığı belirsizdir.Gelişmiş maya tek melez tahliller yaparken oluşabilir çeşitli sorunlar vardır. Bu durumda, koloniler çok küçük ve aktarmak için başarısız oldu. Tipik olarak, TF av kolonilerinin yaklaşık %95'i normal büyüme gösterir.Bu örnekte, plakanın bir kısmında maya büyümesi yoktur. 1536 pin pad DNA yem süzme çim maya ile temas yapmak için başarısız olursa bu sorun genellikle meting adımda bir başarısızlık ile ilgilidir, TF dizi, ya da miyelik plaka. Bu iki örnekte, hiçbir etkileşim algılanır.Bu sorun genellikle muhabir genlerde istenmeyen inaktive mutasyonlar ile ilgilidir, özellikle LacZ, ya da çok yüksek otoaktivite maske etkileşimleri. Bu durumda, plaka genellikle bakteriyel kontaminasyon ile ilgili rasgele mavi lekeler sunar. Göz önünde bulundurulması gereken en önemli şey uygun plaka hazırlama.Sonraki tüm adımlar buna bağlı olduğundan, tüm bileşenlerin eklenmediğinden ve agar yüksekliğinin tek düze olduğundan emin olun. Çoğu reaktif tehlikeli olmasa da, numune lerin ve plakaların kirlenmesini önlemek için her zaman eldiven takmak önemlidir. Herhangi bir DNA bağlayıcı testinde olduğu gibi, muhabir tahlilleri, transkripsiyon faktörü nakavt veya nakavt gibi fonksiyonel tahliller kullanılarak tanımlanan etkileşimleri doğrulamak ve ardından hedef genin ekspresyonunu ölçmek önemlidir.Bu yöntem, belirli biyolojik süreçlerde yer alan genleri düzenleyen transkripsiyon faktörlerinin ve kodlamayan hastalıkla ilişkili varyantlara alternatif bağlanma ile transkripsiyon faktörlerinin tanımlanmasına olanak sağlamıştır.

enhanced-yeast-one-hybrid-screens-to-identify-transcription-factor

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Burada bir plazmid aşırı ekspresyonu ekran...

Yüksek verim Maya Plazmid overekspresyonu Ekran

Biz geleneksel maya iki-hibrit taraması, protein etkileşimleri tanımlayan genetik etkili bir aracı olarak var. Bu değişiklik, sürecin belirgin kısaltır, iş yükünü azaltır ve en önemlisi, yanlış pozitiflerin sayısını azaltır. Buna ek olarak, bu yaklaşım, güvenilir ve tekrarlanabilir.

Büyüme Faktörü Progranulin ile etkileşimde Proteinler tanımlamak Modifiye Maya-İki Hybrid Sistemi

Bu videoda, hedef DNA ile etkileşime giren birden fazla proteini tespit eden modifiye maya tek hibrit testini gösteriyoruz. Dönüştürülmüş maya hücreleri, raportör genin yukarı akışındaki hedef DNA dizisini içerir. Ek olarak, transkripsiyon faktörü proteinlerini eksprese ederler. Proteinler kompleksler oluşturduğunda ve hedef DNA'ya bağlandığında, raportör gen eksprese edilir ve enzimatik olarak tespit edilebilir.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşimlerini Tespit Etmek için Modifiye Maya-Bir Hibrit Testi

Bu protokol soydaş GFP gazetecilere ve flow sitometri aracılığı GFP ifade uyarmak için atfs yeteneği ölçümü ile yapay transkripsiyon faktörleri (atfs) hızlı inşası için deneysel bir prosedür açıklanmaktadır.

Hızlı Sentezi ve GFP-tabanlı Muhabirleri ile Kimyasal Aktif Transkripsiyon Faktörleri Taraması

Bakteriyel efektör proteinleri başarılı enfeksiyonları kurulması için önemlidir. Bu protokol, doğal bitki konukçuda bir bakteriyel efektör proteininin proteinli bağlanma partnerleri ile deneysel tanımlanmasını açıklar. Maya iki hibrit ekranlarından yoluyla bu efektör etkileşimleri belirlenmesi moleküler patojenite stratejilerinin çözülüyor önemli bir araç haline gelmiştir.

Bir Maya İki hibrid Ekran kullanarak Olmayan ekilebilir Bitki Patojen bir Bakteriyel Efektör Fonksiyonu aydınlatmak

Saccharomyces cerevisiae'deki endojen konumlarında histon genlerinde mutasyon oluşturmak için bir strateji sunulmuştur.

Hedeflenen<em&gt; In situ</emBudding Maya&gt; Mutajenezis Histon ve Genler

Mikrokokal nükleaz (MNase) füzyon proteinleri ile genom çapında protein bağlama bölgelerinin haritalanması için bir kromatin immünopresipitasyon (ChIP) -orthogonal yöntem olan yüksek verimli sekanslama (ChEC-seq) ile birleşince, kromatin endojen bölünmeyi tarif ederiz.

ChEC-seq ile Protein-DNA Etkileşimlerinin Genom Boyunca Haritalandırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Burada açıklanan tadil edilmiş maya tek hibrid tahlil, herhangi bir işlevsel genomik çalışma için heterolog bir sistemde heteromerik protein kompleksi-DNA etkileşimini incelemek ve doğrulamak için klasik maya tek hibrid (Y1H) analizinin bir uzantısıdır.

Heteromerik Protein Kompleksi-DNA Etkileşim Çalışmaları İçin Modifiye Maya-Bir Hibrid Sistem

Toplu işleme Maya 2-hibrid ekranlarının birden fazla yem protein etkileşim profilleri av füzyon protein son derece karmaşık bir dizi doğrudan karşılaştırma sağlar. Burada, rafine yöntemleri, yeni reaktifler ve bunların kullanımı böyle ekranlar için nasıl açıklar.

Bir Maya 2-melez ekran Protein etkileşimleri karşılaştırmak için bir toplu iş

Pozitif Maya 2-hibrid etkileşimleri için potansiyel olarak seçilen Maya nüfusun derin sıralama etkileşen ortak proteinler hakkında bilgi hazinesi verir. Burada, biz böyle ekranlar sıra verileri çözümlemek için özelleştirilmiş güncelleştirmek bilgisayar yazılımı ve belirli Biyoinformatik araçlarını işlemini açıklar.

Sıralı veri--dan toplu Maya 2-hibrid perde Bilişim Analizi

Burada sunulan dört protokolleri oluşturmak ve mayalı Saccharomyces cerevisiae muhabiri suşları insan p53 Transaktivasyon potansiyeli, çeşitli kanserle ilişkili mutasyonlar etkileri, ortak ifade etkileşim proteinleri çalışma ve istismar spesifik küçük moleküllerin etkileri.

Insan p53 çalışma fonksiyonel Assays geliştirmek için bir şasi olarak Maya

Öğrenin, geliştirilmiş Maya bir melez ekran yöntemiyle insan DNA dizilerine bağlanan transkripsiyon faktörlerini tek deneyde 1000'den fazla TF tarayarak belirlemeyi. Fonksiyonel genomik araştırmaları için güçlü bir araçtır.

İnsan DNA dizileri için bağlama transkripsiyon faktörü belirlemek için gelişmiş Maya bir melez ekranlar

Daha fazla video keşfet