Name: Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Keşfedin insan enteroidlerinde nekrotizan enterokolit modellemesini. Bağırsak epitel hücrelerinden türetilen bu üç boyutlu organoidler, lipopolisakkarit ile inflamatuar yanıtları inceleyerek tedavi araştırmaları için etik bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüsü Enstitüsü diyabet ve sindirim ve böbrek hastalığı Grant (K08DK106450) ve C.J.H. için Amerikan Pediatrik cerrahi Derneği'nden Jay Grosfeld Ödülü tarafından desteklenmiştir

Kurumsal inceleme kurulu onayı (IRB #2013-15152) elde edilen bağırsak rezeksiyonu Ann ve Robert H. Lurie Çocuk Hastanesi, Chicago, Chicago, Il geçiren hastaların doku örnekleri topluluğu için. Tüm iletişim kuralları kurumsal ve ulusal kurallara ve düzenlemelere insan refahı için uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Yazılı bilinçli ebeveyn onayı gerekli ve örnek koleksiyon her durumda önce elde.
1. reaktif hazırlık
<ol><li>Bütün dokusu toplamalarında kültür medya hisse senedi çözüm hazırlamak: 1 L, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), 110 mL, Fetal sığır Serum (FBS), 11 mL penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1) ve 1.1 mL filtre sterilize insülin (son konsantrasyonu % 0.1.) Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>Chelating arabellek #1 hazırlamak: Kültür ortamının, (1. 1'de açıklandığı gibi) 30 mL 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) 600 µL (son konsantrasyonu 10 mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1) ve Amfoterisin b (son konsantrasyonu % 0,2) 60 µL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>Chelating arabellek #2 hazırlamak: Kültür ortamının, (1. 1'de açıklandığı gibi) 30 mL 0.5 M EDTA (son konsantrasyonu 5mM), 300 µL gentamisin (son konsantrasyonu % 1), 300 µL ve Amfoterisin b (son konsantrasyonu % 0,2) 60 µL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın</li>
	<li>İnsan Minigut ortam hazırlamak: 41.4 mL DMEM/F-12, 5 mL FBS (son %10), penisilin-streptomisin (son konsantrasyonu % 1), L-glutamine (son konsantrasyonu % 1), gentamisin (son konsantrasyonu % 1), amfoterisin b (final 100 µL 500 µL 500 µL 500 µL konsantrasyonu % 0,2), 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sülfonik asit (HEPES) 500 µL (son konsantrasyonu 10 mM), N-2 100 x 500 µL ek ve 50 x 1 mL B-27 ilave Vitamin A toplam hacmi 50 mL için. Hisse senedi çözüm-20 ° C'de depolayın</li>
	<li>İnsan Minigut medya tam hazırlayın: 10 mL insan Minigut medya (hazırlanan 1.4), 10 µL 100 µg/ml Wnt3a (son toplama 100 ng/mL), 100 µg/ml kafa (son toplama 100 ng/mL), 1 mg/ml R-Spondin 10 µL 10 µL (son konsantrasyonu 1 µg/mL) , 500 µg/ml Epidermal büyüme faktörü (EGF) (son konsantrasyonu 50 ng/mL), 1 10 µL 10 µL M N-Acetylcysteine (son konsantrasyonu 1 mM), 10 µL 10 mm Y-27632 (son konsantrasyonu 10 µM), 10 µL 500 µM A-83 (son konsantrasyonu 500 nM), 10 mm SB202190 (son 10 µL konsantrasyonu 10 µM), 1 M Nikotinamid 100 µL (son konsantrasyonu 10 mM) ve 100 µM [Leyi] 15-gastrin 1 (son konsantrasyonu 10 nM) 1 µL. Toplam hacmi 10 mL. Hisse senedi çözüm 4 ° C'de depolayın Not: Çözümler 48 saat içinde kullanılmalıdır.</li>
</ol>2. crypt yalıtım ve kaplama bütün dokusundan
<ol><li>
Operatif paketindeki toplanması sırasında insan küçük bağırsak doku örneği soğuk Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS içinde) yerleştirin. Örnek içinde soğuk DPBS kadar dışkı ve kan temiz yıkayın. Numune 4 ° C'de crypt yalıtım için hazır kadar RPMI 1640 ortamda depolayın. Not: Doku daha 24 h depolanamaz.<ol>
<li>Numune kan ve dışkı açık olduğundan emin olun. Hassas diseksiyon makası kullanarak herhangi bir aşırı yağlı veya cerrahi klipleri/zımba vb kaldırın. Numune tartın. Not: Bir parça yaklaşık 0,75-2,5 g nişan al.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Numune 0.5 cm parçalar halinde kesilmiş ve tampon #1 şelat 30 mL (1.2 adımda hazırlanan gibi) yer.
	<ol>
<li>4 ° C'de 15 dakika düşük hızda sallamak</li>
		<li>Doku 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı aracılığıyla atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku şelat arabellek # 2 30 mL (Adım 1.3 hazırlanırken) ekleyin.
	<ol>
<li>4 ° C'de 15 dakika düşük hızda sallamak</li>
		<li>Doku 100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akışı aracılığıyla atın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Membran matris kullanılmak üzere adım 2.8 buzda 500 mL çözülme.</li>
	<li>
Soğuk DMEM 50 mL konik tüp 10 mL doku eklemek ve el 10 tarafından şiddetle çalkalanır s.
	<ol>
<li>100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve (etiket #1) aracılığıyla akış toplamak. Tüp #1 buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Başka bir 10 mL soğuk DMEM ayrı 50 mL konik tüp içinde doku eklemek ve el 10 tarafından şiddetle çalkalanır s.</li>
		<li>100 µm hücre süzgeç aracılığıyla filtre ve akış (etiket #2) toplamak.</li>
		<li>Dört konik tüpler (etiketli tüpler #1-4) ile akışı ile olana iki ek kere tekrar edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Filtre #1 solution'ı bir 100 µm hücre süzgeç ve aktarım akış 15 mL konik tüp (etiket #1) içine tüp. #2-4 için yineleyin.
	<ol>
<li>15 mL tüpler #1-4'te 200 x g 4 ° C'de 15 dakika santrifüj kapasitesi</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laminar akış başlıklı süpernatant tüpler #1-4 kaldırmak ve atın. Bazı süpernatant geride bırakarak anlamına gelse bile bulut hemen üstündeki Pelet doku engellemeden kaçının.
	<ol>
<li>Yavaş yavaş pipetting tarafından Pelet artık #1-4 tüplerde süpernatant ile karıştırın.</li>
		<li>Karışım tüpler #1-4 bir tek 2 mL konik tüp içine aktarın.</li>
		<li>Konik tüp vasıl 200 x g 4 ° C'de 20 dk santrifüj kapasitesi</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Süpernatant kaldırmak ve Pelet membran matris 500 µL içinde yeniden askıya alma. Not: membran matris buz üzerinde sürekli ve hızlı bir şekilde çalışmak için sonraki adımlar. Bu ürün çok hızlı bir şekilde oda sıcaklığında polymerizes.<ol>
<li>Numune/Bodrum membran matris süspansiyon 50 µL 24-şey plaka bir kuyuda ortasına uygulayın. Bu kubbe seklinde görünmesi gerekir. Not: Soğutulmuş pipet ipuçları kullanımını polimerizasyon en aza indirerek daha düzgün aktarımda süspansiyon, yardımcı olur.</li>
		<li>10 toplam wells doldurmak için 9 kere tekrar edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>24-şey plaka 37 ° C, % 5 CO2 kuluçka polimerizasyon izin vermek 30 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Bir insan Minigut medya (1.5 adımda hazırlanırken) tam 500 µL her şey için ekleyin. Yerine 2 günde.</li>
	<li>Enteroids 5-10 gün sonra ne zaman tomurcuklanan görselleştirildiği, toplamak. Adımları 4 ve 5 koleksiyonu yönergeler için bkz:.</li>
</ol>3. indüksiyon deneysel NEC
<ol><li>5 mg/mL lipopolysaccharide (LPS) 10 µL 500 µL insan Minigut medya (1.5 adımda hazırlanırken) tam her iyi bir gün 0 ekleyin. 2 günde koleksiyonu kadar değiştirin.</li>
</ol>4. parafin katıştırma için hazırlık
<ol><li>
Medya yavaşça çıkarın.
	<ol>
<li>PBS 1 mL ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı membran matris enteroids koşullar değil özenle çözülmeye pipet.</li>
		<li>PBS/enteroid karisimin santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1s için oda sıcaklığında düzeltmek için %4 paraformaldehyde ekleyin.</li>
	<li>
Santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.
	<ol>
<li>Yıkama yavaşça 1 mL PBS ve, santrifüj kapasitesi < 300 x g cips ve PBS kaldırmak 5 min için.</li>
		<li>4.3.1 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Konik bir tüp içinde istenilen miktarda yerleştirip sıvı kadar bir kuru banyo kuluçka 65 ° C'de 3-10 min için Isınma jel (yaklaşık 300 µL) işleme doku yeterli hacim eritebilir.
	<ol>
<li>Jöleye Pelet işleme doku ekleyin ve karışımı yavaşça.</li>
		<li>Bir coverslip küçük bir klonlama halka yerleştirin.</li>
		<li>Jel ve enteroid karışımı coverslip monte edilmiş bir klonlama halka içine işleme doku pipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
1s için 4 ° C'de kuvvetlendirmek için jel ve enteroid karışımı işleme doku sağlar.
	<ol>
<li>Klonlama yüzük katılaşmış karışımı ile % 70 etanol parafin katıştırma için hazırlık içine daldırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Enteroid koleksiyonu için RNA ve Protein çıkarma
<ol><li>Yavaşça insan Minigut medya tam her kuyudan çıkarın.</li>
	<li>
1 mL PBS ekleyin ve hafifçe yukarı ve aşağı membran matris çözülmeye pipet. Enteroids ayırmak değil dikkatli olun.
	<ol>
<li>PBS/enteroid karışımı bir steril 2 mL konik tüp içine yerleştirin.</li>
		<li>Santrifüj kapasitesi < 300 x g cips 5 min için.</li>
		<li>PBS, dikkat çekici enteroids değil çıkarmak için yavaşça çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Adım serisi 5.2 iki kez daha tekrarlayın.</li>
	<li>Protein ve/veya RNA ayıklama için hazır kadar-80 ° C'de dondurmak.</li>
	<li>Gen ifade ve protein izole edilmesi enteroids köklü qRT-PCR ve Western Blot teknikleri kullanarak gerçekleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
<li>Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+cell+monolayers+as+a+model+for+drug+transport+across+the+intestinal+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa.</a> Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).</li>
<li>In, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mini-guts%3A+new+insights+into+intestinal+physiology+and+host-pathogen+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions.</a> Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).</li>
<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
<li>Moore, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+barrier+dysfunction+in+human+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Surgery%22%5BJournal%5D)">Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
<li>Lanik, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+Milk+Enhances+Growth+of+Enteroids%3A+An+Ex+Vivo+Model+of+Cell+Proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), 56921(2018).</li>
<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu roman ex vivo insan bağırsak enteroid modeli bağırsak bariyer disfonksiyonu Nekroze edici enterokolit (NEC) içinde çalışma için yararlı bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Burada sunulan enteroid işleme yöntemleri Drs. Misty iyi, Michael Helmrath ve Jason Wertheim10,11,12önceki işten uyarlandı.
Ayrıntılar tüm çevreleyen doku toplama ve zamanlama crypt yalıtım bu protokolündeki kritik adım vardır....

İnsan enteroids olan ex vivo 3 boyutlu kültür sistem kök hücreleri insan intestinal doku örnekleri bağırsak kriptalarının izole. Bu çığır açan model 2007 aşağıdaki fareler1bağırsakta kriptalarının, Lgr5 + kök hücre keşfi Hans Clevers vd tarafından öncülük. İşlerini eski bir kurmak için temeli atıldı vivo bağırsak epitel kültür önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler2olmadan passaged birden çok hücre tiplerinin. Keşfinden bu yana enteroids, normal sindirim fizyolojisi ve inflamatuvar barsak hastalığı, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve rejeneratif tıp2gibi bağırsak hastalıkları Patofizyoloji çalışmaya yeni bir model olarak kullanılmıştır.
Kullanım eski bir olarak enteroids in vivo modeli bağırsak patofizyolojisi incelenmesi için alternatif teknikleri üzerinde birçok avantajı vardır. Son birkaç on yıl için hayvan modelleri ve ölümsüzleştirdi bağırsak kanseri türetilmiş hücre hatları bağırsak fizyolojisi3,4,5eğitim için kullanılmaktadır. Tek hücre kültürleri böylece hücre-hücre çapraz-hadis ve segment-özgüllük protein ifade, sinyal ve patojen kaynaklı hastalık6eksik hücre tipleri içinde normal bağırsak epiteli, mevcut çeşitliliği temsil etmemektedir. Enteroids kök hücre Binbaşı epitel hücre tipleri enterositler, Paneth hücreleri, goblet hücreleri, enteroendocrine hücreleri ve daha fazla3gibi ayırt etmek. Onlar polarite sergi, epitel taşıma iþlevlerini ve bağırsak segment özgüllük6için izin. Enteroids insan bağırsak epitel birden çok hücre türleri özetlemek beri onlar kanser hücre tabanlı sistemler tanınan bu sınırlamayı aşmak mümkündür. Zamanla, hücre hatları türevleri subcloned ve protein ifade ve Yerelleştirme3daha fazla çeşitlilik gösteren gelişmeye. Aksine, enteroids önemli genetik veya fizyolojik değişiklikler2olmadan passaged. NEC için çok sayıda hayvan modelleri mevcut olmasına rağmen yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Bu sınırlamalar bir sonucu olarak, hayvan modellerden elde edilen tedavi başarısız zaman % 90 toksisite veya etkinliği3farklılıkları nedeniyle insan çalışmalarda test edilirken. Enteroids daha iyi bir karmaşık bağırsak patofizyolojisi ve bu nedenle, daha fazla anlayış için önde gelen bu yetersizliklerin üstesinden gelebilir umut verici önceden klinik modelleri hizmet başarılı ve uygun maliyetli tedavi yenilikler. Biyolojik açıdan önemli7yaşında bir enteroid kaynaklandığı doku kalır son kanıtlar da vardır. Enteroids böylece NEC ile hastaların fizyolojik alaka Bakımı, Yenidoğan dokusundan üretilen bu yana bu modelimiz için özellikle önemli bir ayrıntı var.
Enteroids yardımcı programı gibi modelleri insan hastalıkların tedavileri şiddetli ve yaygın koşullarına inanışı genişletmeye devam ediyor. Enterokolit Nekroze edici (NEC) tarafından bağırsak nekroz ile karakterize ventilasyon yıkıcı bir bağırsak hastalığı ve sık sık için bağırsak duvarı, septisemi ve ölüm8delikli açar. NEC karmaşık ve multifaktöriyel Patofizyoloji nedeniyle hastalığın kesin mekanizması henüz tam aydınlatılmamıştır değil; Ancak, artan bağırsak geçirgenliği açıkça hastalık süreci8' karıştığı olmuştur. Verilen, NEC ve potansiyel terapötik ajanlar insan denekler, özellikle çocuklar etik meydan okuyor, bu insan yenidoğan dokusu kullanarak NEC biyolojik ilgili enteroid modeli kullanmak için son derece arzu edilir. Şimdiye kadar enteroids NEC çalışmada sınırlı bir role sahip. Bu iletişim kuralı ex vivo modeli nekrotizan enterokolit çalışma için bir roman olarak insan bağırsak dokusu örneklerinden elde edilen enteroids açıklar.

<table><tbody><tr><td>%4 Paraformaldehit</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R& D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>B-27 takviyesi eksi A Vitamini</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Bodrum Membran Matrisi (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Orta (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat Tamponlu Salin (DPBS)</td> <td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Büyüme Faktörü (EGF)</td> <td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td> <td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ( L-glutamin)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-gastrin 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkarit (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 takviyesi</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-hidroksietilpiperazin-N-2-etan sülfonik asit (HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-Asetilsistein</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nikotinamid</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td> <td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>İnvitrojen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Doku İşleme Jeli (Histogel)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D Sistemleri A.Ş</td>. <td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

bir roman insan epitel enteroid nekrotizan enterokolit modeli

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Enterokolit Nekroze edici (NEC), yeni doğan bebeklerin yıkıcı bir hastalıktır. Artan bağırsak geçirgenliği için önde gelen insan bağırsak epitel içinde birden çok Etyopatogenezi değişiklikler ile karakterize, restitüsyon engelliler ve hücre ölümü arttı. NEC çok sayıda hayvan modelleri olmakla birlikte, yaralanma ve tedavi müdahaleler karşısında türler arasında son derece değişken olabilir. Ayrıca, hastalık patofizyolojisi veya insan denekler, özellikle çocuklar doğrudan roman terapötik ajanlar çalışmaya etik meydan okuyor. Bu nedenle, insan dokusu kullanarak NEC yeni bir model geliştirmek için son derece arzu edilir. Enteroids bağırsak epitel hücrelerinden elde edilen 3 boyutlu organoids vardır. Karmaşık fizyolojik etkileşimleri, hücre sinyallemesi ve ana bilgisayar-patojen savunma çalışma için idealdir. Bu el yazması biz o kültürlerin insan enteroids bağırsak rezeksiyonu geçiren hastaların bağırsak kök hücreleri izole sonra bir iletişim kuralı tanımlamak. Crypt hücre farklılaşması çeşitli hücre türleri yerli bir insan bağırsak epitel içine teşvik büyüme faktörleri içeren medya kültürlü. Bu hücreler ekstra hücresel membran taklit eden bir iskele hizmet proteinler kolajen, sentetik karışımı yetiştirilmektedir. Sonuç olarak, enteroids demiri apikal polarite geliştirmek. Lipopolysaccharide (LPS) medya ortak yönetim enteroids, histolojik, genetik için önde gelen ve protein ifade değişiklikler bu insan NEC görülen benzer bir enflamatuar yanıt neden olur. Biz bu hastalık için bir tedavi tanımlamak için çalışıyoruz gibi insan dokusu kullanarak NEC deneysel bir model uyuşturucu ve insan denemeler önce test tedavi için daha doğru bir platform sağlar.

Hemen sonra kaplama, taze izole bağırsak kriptalarının uzun çubuklar görüntülenir. Saat içinde bir yuvarlak görünüşüne (şekil 1bir) enteroid alacak. Önümüzdeki birkaç gün boyunca, enteroids küre Resim 1bgörüldüğü gibi şekillendirme başlar. Tomurcuklanma (şekil 1c) 5-10 gün arasında oluşması ve enteroid koleksiyonu o zaman olmamalıdır.
<p class="j...

Enteroids insan hastalık insan yeni bir model olarak ortaya çıkıyor. Protokol insan nekrotizan enterokolit yenidoğan dokusundan üretilen enteroids tedavisinde lipopolysaccharide (LPS) kullanarak bir enteroid modeli benzetimi açıklar. Toplanan enteroids benzer-e doğru o insan nekrotizan enterokolit görülen iltihabi yapılan değişiklikleri göstermektedir.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Enteroidler bağırsak epitel hücrelerinden elde edilen üç boyutlu organoidlerdir. Onlar karmaşık fizyolojik etkileşimleri çalışma için idealdir, hücre sinyal, ve konak patojen savunma. Protokolümüz, bağırsak rezeksiyonu yapılan hastalardan bağırsak kök hücrelerini izole ettikten sonra insan enteroidlerinin nasıl kültürlendirilebildiğini açıklamaktadır.Kültür medyamızda lipopolisakkaritin birlikte uygulanması, insan nekrotizan enterokolitinde görülenlere benzer histolojik, genetik ve protein ekspresyonu değişikliklerine yol açan enteroidlerde inflamatuar bir yanıta neden ollardır. Nekrotizan enterokolit ve potansiyel terapötik ajanların çalışmasının insan deneklerde, özellikle de çocuklarda etik açıdan zorlayıcı olduğu göz önüne alındığında, insan neokolitinin biyolojik olarak alakalı enterokolit modelini insan neonatal dokusu kullanarak kullanmak son derece arzu edilir. Bu tekniğin en büyük avantajı enteroidlerin insan bağırsak epitelinin birden fazla hücre tipini özetleyebilmeleri ve hayvan modellerinin ve hücre tabanlı sistemlerin tanınan sınırlamalarının üstesinden gelebilmeleridir.Prosedürü göstermek için yardımcı Christie Buonpane, bir cerrahi ikamet ve Carrie Yuan, bizim laboratuvar dan bir laboratuvar teknisyeni olacaktır. Operatif süitte toplama sırasında, soğuk DPBS insan ince bağırsak doku örneği yerleştirin. Numuneyi soğuk DPBS'de kan ve dışkı temizlenene kadar yıkayın.Numuneyi RPMI 1640 orta noktasında, crypt izolasyona hazır olana kadar dört santigrat derecede saklayın. Devam etmeye hazır olduğunuzda, numunenin dışkı ve kandan temiz olup olmadığını tekrar kontrol edin. Hassas kesme makas kullanarak herhangi bir aşırı yağ veya cerrahi klips ve zımba kaldırın.Numuneyi ağırlıklendirin ve yaklaşık 0,75 ila 2,5 gram lık bir parçayı hedefleyin. Sonra, 0.5 santimetre parçalar halinde doku kesmek ve bir numaralı şelite 30 mililitre içeren bir tüp yerleştirin. Dört santigrat derecede 15 dakika düşük hızda çalkalayın.Daha sonra, 100 mikrometre hücresüzlük yoluyla doku filtre ve üzerinden akış atın. Filtrelenmiş dokuyu, iki numaralı şelite tamponunun 30 mililitresini içeren bir tüpe ekleyin. Dört santigrat derecede 15 dakika düşük hızda çalkalayın.100 mikrometrelik bir filtreden dokuyu filtreleyin ve akışı atın. Bundan sonra, daha sonra kullanmak için buz üzerinde bodrum membran matris 500 mikrolitre çözülme. 50 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre soğuk DMEM'e biraz doku ekleyin ve 10 saniye boyunca elle şiddetle çalkalayın.Bu süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı toplayın. Bu tüpü buzda tut. Ayrı bir 50 mililitre konik tüp soğuk DMEM başka 10 mililitre bazı doku ekleyin ve 10 saniye boyunca şiddetle elle çalkalayın.Bu süspansiyonu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı toplayın. Bir ile dört arasında etiketli akış içeren dört konik tüpler olana kadar işlemi iki kez daha tekrarlayın. Daha sonra, çözeltiyi 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin ve akışı bir numaralı etiketli 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.Bu işlemi ikiden dörde kadar olan tüpler için tekrarlayın. 15 mililitrelik tüpleri 200 kez G'de ve 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüj edin. Laminar akış kaputunda, her tüpten supernatant çıkarın ve atın.Peletin hemen üstündeki doku bulutunu bozmaktan kaçının, bu bazı süpernatant'ı geride bırakmak anlamına gelse bile. Her tüp, pipet yukarı ve aşağı yavaş yavaş kalan supernatant ile pelet karıştırmak için. Karışımı her tüpten 200 kez G'de ve 4 santigrat derecede 20 dakika boyunca tek bir iki mililitrelik konik tüpve santrifüje aktarın.Bundan sonra, supernatant çıkarın ve önceden çözülmüş bazal membran matris 500 mikrolitre pelet resuspend. 24 kuyu plakalı bir kuyunun ortasına bu süspansiyonun 50 mikrolitresini uygulamak için soğutulmuş pipet ucu kullanın. Bu örnek kubbe şeklinde görünmelidir.Toplam 10 kuyuyu doldurmak için bu başvuru işlemini dokuz kez tekrarlayın. Polimerizasyona izin vermek için 24 kuyu plakasını 37 santigrat derecede %5'lik karbondioksit kuvöze aktarın. Sonra, her kuyuya tamamlanmış 500 mikrolitre insan minigut media ekleyin.Aynı koşullar altında kuluçkaya yatarak bu ortamı iki günde bir değiştirin. İlk olarak, insan minigut media 500 mikrolitre gün sıfır plaka her kuyuda tam mililitre başına beş miligram konsantrasyonda LPS 10 mikrolitre ekleyin. %5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya devam edin ve toplama kadar her iki günde bir eklenmiş ortamı değiştirin.Parafin gömmeye hazırlanmak için, önce hafifçe ortamı çıkarın, bir mililitre PBS ekleyin ve enteroidleri lize etmemeye dikkat ederken bodrum membran matrisini eritmek için yavaşça yukarı ve aşağı pipet ler ekleyin. Pelet için beş dakika boyunca 300 kez G'den daha az bir hızda santrifüj ve sonra PBS kaldırın. % 4 paraformaldehit ekleyin ve oda sıcaklığında düzeltmek için bir saat için bir kenara tüp ayarlayın.Pelet için beş dakika boyunca 300 kez G'den daha az bir hızda santrifüj ve sonra paraformaldehit kaldırmak. Bir mililitre PBS ve santrifüj ile 300 kereg'den daha az bir hızda beş dakika boyunca hafifçe yıkayın. Sonra PBS kaldırın.Bu yıkama işlemini PBS ile bir kez tekrarlayın. Konik bir tüp içine doku işleme jel istenilen miktarda yerleştirin ve sıvı kadar 3 ila 10 dakika boyunca 65 santigrat derece kuru bir banyo kuluçka içinde ısıtın. Bundan sonra, pelet için erimiş doku işleme jeli ekleyin ve yavaşça karıştırın.Bir coverslip içine küçük bir klonlama halkası yerleştirin. Pipet doku işleme jeli ve bir coverslip üzerine monte edilir klonlama halkaiçine enteroid karışımı. Doku işleme jeli ve enteroid karışımıbir saat boyunca dört derece santigrat katılaşmak için izin verin.Daha sonra, parafin katıştırma için hazırlamak için% 70 etanol içine katılaşmış karışımı ile klonlama halkası batırın. Kaplamadan hemen sonra, taze izole bağırsak mahzenleri uzatılmış çubuklar olarak görünür. Birkaç saat içinde enteroidler yuvarlak bir görünüm alacak.Önümüzdeki birkaç gün içinde enteroidler küreler oluşturmaya başlayacaklar. Tomurcuklanma 5 ila 10 gün arasında gerçekleşmelidir, enteroid toplama meydana gelmesi gereken zaman. Büyüyen enteroidler de polarite sergiler, merkezi lümen içeren, bir apikal sınır, ve bazilateral etki alanı.Enteroidler aynı zamanda sağlam bir aktin sitoiskeleti ile temsil edilen yapısal bütünlüğü de gösterirler. Kültür birkaç gün sonra, LBS tedavi enteroids daha fazla apoptoz deneyimi ve kontrol grubuna göre daha düşük bir verim var. NEC'nin murine modellerinde insan NEC'sinde görüldüğü gibi, LPS tedavi edilen enteroidlerde kontrollere göre reseptör dört gibi bilançonun artması görülür.Enteroidler de iyi kurulmuş qRT-PCR kullanılarak RNA ve protein ekstraksiyonu için toplanabilir ve batı lekeleme teknikleri gen ekspresyonu ve protein izolasyonu yapılabilir.

a-novel-human-epithelial-enteroid-model-of-necrotizing-enterocolitis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, lipopolisakkarit tedavisinin neden olduğu insan kaynaklı bir neonatal enteroid modelinde nekrotizan enterokolit hastalığının gelişimini göstermektedir. Bu model bağırsak patofizyolojisini incelemeye yardımcı olur.

İnsan Epitelyal Enteroid Modelinde Nekrotizan Enterokolit İndüksiyonu

Bu protokol, apikal yüzeye erişime izin veren, ters polariteye sahip ince bağırsak enteroidlerini kullanan apikal-dışarı nekrotizan enterokolit (NEC) bir çanak içi modelini tanımlar. NEC ile ilişkili epitel bozulmasını tespit etmek için bir immünofloresan boyama protokolü ve NEC-in-a-dish protokolüne tabi tutulan apikal-out enteroidlerin yaşayabilirliğini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Bu protokol, fetal bağırsak dokusundan üç boyutlu bir bağırsak modeli olan enteroidlerin kurulmasını detaylandırır. Model karakterizasyonunda epitel biyobelirteçlerinin immünofloresan görüntülemesi kullanıldı. Bakteriyel bir endotoksin olan lipopolisakkaritlerin apikal maruziyeti, mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak, floresan dekstranın sızıntısı ile ölçülen doza bağımlı bir şekilde epitel geçirgenliğine neden olmuştur.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Bu protokol, hastalık patogenezine yönelik mekanik çalışmalar için kullanılabilen bir in vitro nekrotizan enterokolit (NEC) modelini açıklar. İnsan yenidoğan bağırsağından, endotel hücrelerinden ve şiddetli NEC'li bir yenidoğanın bağırsak mikrobiyomundan türetilen bağırsak enteroidleri ile tohumlanmış bir mikroakışkan çipe sahiptir.

İnsan Yenidoğan Bağırsak Enteroidlerini ve Disbiyotik Mikrobiyomu İçeren Nekrotizan Enterokolitin Mikroakışkan Modeli

Bu protokol, nekrotizan enterokolitin (NEC) yenidoğan fare modelini ve ardından yenidoğan murin ince bağırsağından lamina propria bağışıklık hücrelerinin izolasyonunu özetlemektedir.

İmmün Hücre Profili Oluşturma için Nekrotizan Enterokolit ve Lamina Propria İzolasyonunun Yenidoğan Fare Modeli

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme...

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

İnsan solunum sinsityal virüsü (HRSV) küçük bebeklerde ciddi bronşiyolite neden olabilir. Şiddetli HRSV hastalığının patogenezinin bir kısmı, konakçı immün yanıtından kaynaklanır. Primer insan bağışıklık hücrelerinin HRSV ile uyarılması, enflamatuar yolların ve enfeksiyonun aktivasyonunu incelemek için hızlı ve tekrarlanabilir bir model sistem sağlar.

İnsan Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinin İnsan Solunum Sinsityal Virüs Enfeksiyonuna İmmün Tepkilerini İncelemek İçin Bir İn vitro Model

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Keşfedin insan enteroidlerinde nekrotizan enterokolit modellemesini. Bağırsak epitel hücrelerinden türetilen bu üç boyutlu organoidler, lipopolisakkarit ile inflamatuar yanıtları inceleyerek tedavi araştırmaları için etik bir platform sunar.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Daha fazla video keşfet