Merkezi Sinir Sistemine İntranazal siRNA Teslimi Sırasında Farelerin Yerleştirilmesi için Bir Konumlandırma Cihazı
15 Ağustos 2019
Burada, merkezi sinir sisteminde etkili gen susturma sağlayan beyin hedeflemepeptipeptipeptik peptid-siRNA formülasyonunun intranazal uygulaması için farelerin uygun yerleştirilmesine olanak tanıyan bir fare konumlandırma cihazı kullanarak bir protokol salıyoruz.
Bu protokol, biyomoleküllerin fare CNS'ye intranazal olarak ulaştırılması için bir konumlandırma cihazının kullanımını ayrıntılarıyla anlatır. Bu cihazın kullanımı farelerin kullanımı ve tedavi süresini önemli ölçüde azaltır ve tekniğin verimliliği ve tekrarlanabilirliği ile sonuçlanır. Bu prosedüre başlamak için, cerrahi düzlemi korumak için pedal refleksi ile farelerin anestezi düzeyini değerlendirin.
Ardından, gerekli tüm reaktiflere kolay erişim sağlamak için konumlandırma cihazını uygun bir mesafe ye ve yüksekliğe yerleştirin. Sonra, hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Herhangi bir rahatsızlık olmadan rahat bir konumda iken farenin forelimbs doğal destek sağlamak emin olun, sandalye kemerleri ile bir fare kayış.
Kalan fareler için prosedürleri tekrarlayın. Her fareyi, koltuğun arka desteğine paralel olarak ve 90 derecede sandalye koltuğuna doğru uzanarak, belirlenen sandalyeye yavaşça yerleştirin. Hayvan ın baş aşağı ve ileri pozisyonda itmeden veya bastırmadan doğal olarak yatmasına izin verin.
Tüm fareler bağlandıktan sonra, hemen intranazal aşılamaya başlayın. İntranazal teslimatı gerçekleştirmek için mikropipeti iki mikrolitre RVG9R siRNA kompleks çözeltisi ile yükleyin. SiRNA'yı uygularken kontrolsüz hareketlerden kaçınmak için pipeti baskın elde tutun ve diğer elinizle destekleyin.
Faredoğrudan teneffüs böylece bir burun deliğine çok yakın iki mikrolitrelik bir damlacık hakkında yerleştirin. Küçük bir damla kolayca oluşturulmazsa, pipet ucunu yenisiyle değiştirin ve işlemi tekrarlayın. Fareyi işaret parmağıyla yavaşça aşağı doğru beş saniye itin.
İlacın akciğerlere drenajını önlemek için fare nefes alırken farenin işaret parmağıyla beş saniye boyunca sakince aşağı itilmesi önemlidir. Bundan 3-4 dakika sonra ilk farenin ikinci naresine zaman aşılanması için bir kronometre başlatın. Bu zaman aralığı fare nin ilk dozun teneffüsini tamamlaması ve normal solunumu geri getirmesi için gereklidir.
İlk farede alternatif narelerin aşılanması arasındaki üç ila dört dakikalık aralıkta, cihaza yerleştirilen kalan üç farenin her birinde bir narenin intranazal aşısını tamamlayın. Kronometre çaldığında, ilk farenin üzerindeki ikinci burun deliğini aşılamak ve yukarıdaki gibi diğer fareler için prosedürü tekrarlayın. Dört fare için 20-30 mikrolitre teslim edilene kadar işlemi tekrarlayın.
Tüm aşılama işleminin tamamlanması yaklaşık 30 ila 45 dakika sürer. Hayvanları belirlenen kafeslere geri getirin. Onlar sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmış kadar fareler gözetimsiz bırakmayın.
Gen susturma değerlendirmek için, rna arıtma kiti ile çeşitli beyin bölgelerinden RNA ayıklamak, cDNA sentez kiti kullanarak cDNA içine transkripsiyon ters, ve astar çiftleri ile qPCR gerçekleştirmek. Alexa Fluor 488 etiketli RVG9R peptid in en beyin teslim ilk burada açıklanan fare konumlandırma cihazı kullanılarak test edildi. Aşıdan sonra 48 saat sonra, Çeşitli organlar A488 floresan ölçmek için çıkarıldı.
Negatif kontrollerde hiçbir organda tespit edilmedi. Öte yandan, güçlü bir floresan A488 sinyali sadece RVG9R inostarlı grubun beyinlerinde tespit edildi. Buna ek olarak, fare yerleştirme pozisyonu supine pozisyon yöntemi ve etkinlik için uyanık yöntemi ile karşılaştırıldı.
Sonuçlar, farelerin baş aşağı ve ileri konumlandırma beyin dokusu boyunca RVG9R A488 penetrans ve birikimi ni iyileştirdiğini göstermiştir. Beyne siRNA teslimini doğrulamak için, Cy5 etiketli siRNA'ya göre karmaşık rvg9R'nin tek bir intranazal uygulamasından sonra tam beyin taraması yapıldı. PBS veya RVM9R aksine, RVG9R ile karmaşıkkoku ampul de dahil olmak üzere büyük beyin bölgelerinde siRNA güçlü bir birikimi ile sonuçlandı, korteks, hipokampus, talamus, hipotalamus, orta beyin, ve beyincik.
Konumlandırma cihazı fare CNS ilaç veya moleküllerin teslimi için kullanılabilir. Uygulamalar terapötik test yanı sıra CNS hücresel mekanizmaların incelenmesi için uzanır. Bu konumlandırma cihazı Batı Nil Virüsü hastalığı tedavisinde siRNA'ların gücünü göstermek için araştırmacılar tarafından kullanılmıştır, yanı sıra diğer CNS hastalıkları için tedaviler keşfetmek.
Genel Bakış
Bu protokol, merkezi sinir sisteminde etkili gen susturulmasını kolaylaştırmak amacıyla, beyin hedefli bir peptid-siRNA formülasyonunun intranazal uygulaması için bir fare konumlandırma cihazının kullanımını açıklamaktadır. Bu yöntem, farelerle yapılan temas ve işlemleri minimize ederken verimliliği ve tekrarlanabilirliği artırır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gen Terapisi
- Biyomoleküler İletim
Arka Plan
- İntranazal uygulama, MSS hedefli tedaviler için gelecek vaat eden bir yoldur.
- Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için etkili uygulama teknikleri kritik öneme sahiptir.
- Fare konumlandırması, ilaç iletiminin etkinliğini etkileyebilir.
- siRNA aracılığıyla gen susturma, nörobilim araştırmalarında değerli bir araçtır.
Çalışmanın Amacı
- siRNA'nın fare MSS'sine etkili intranazal iletimi için bir protokol oluşturmak.
- Fare konumlandırmasının ilaç iletim verimliliği üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Konumlandırma cihazının gen tedavisi uygulamalarındaki faydasını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Pozisyonlandırma öncesinde farelerde anestezi seviyelerinin değerlendirilmesi.
- Fareleri rahat bir pozisyonda sabitlemek için bir pozisyonlandırma cihazının kullanımı.
- siRNA kompleks solüsyonunun intranazal olarak inokülasyonu.
- Gen susturma etkinliğini değerlendirmek için RNA ekstraksiyonu ve qPCR.
Ana Sonuçlar
- İnokülasyon sonrası beyin bölgelerinde belirgin gen susturması gözlemlenmiştir.
- Konumlandırma cihazı kullanılarak yapılan siRNA iletiminin diğer yöntemlere göre daha gelişmiş olduğu görülmüştür.
- İşlem gören farelerin beyinlerinde tespit edilen güçlü floresans, iletimin başarılı olduğunu göstermektedir.
- Başın aşağı doğru konumlandırılması, siRNA formülasyonunun penetrasyonunu ve depozisyonunu artırmıştır.
Sonuçlar
- Fare konumlandırma cihazı, MSS ilaç iletimi için etkilidir.
- Bu yöntem, çeşitli terapötik ve araştırma bağlamlarına uygulanabilir.
- İleri çalışmalar, cihazın MSS hastalıklarının tedavisinde kullanımını araştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Merkezi sinir sistemi (MSS) hedefli terapötiklerin etkili bir şekilde intranazal iletimi, preklinik nörobilim ve gen tedavisi geliştirmede kritik bir darboğaz olmaya devam etmektedir. Bu konumlandırma cihazı, siRNA, peptitler veya nanopartiküller gibi biyomoleküllerin fare beynine standardize edilmiş ve yüksek kapasiteli bir şekilde uygulanmasını sağlayarak, hedef etkileşim çalışmalarındaki tekrarlanabilirliği artırır ve değişkenliği azaltır. Tutarlı bir baş-aşağı ve ileri konumlandırmayı destekleyerek, MSS alımındaki öngörüsel güveni artırır ve intranazal terapötik adayların translasyonel ilerlemesindeki riskleri azaltır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: RVG9R-siRNA kompleksları gibi MSS-aktif bileşiklerin tekrarlanabilir şekilde iletilmesini sağlayarak terapötik hipotezlerin hassas bir şekilde sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Dozlamadaki operatöre bağlı değişkenliği azaltarak, güvenilir hedef etkileşimi ve yolak modülasyon değerlendirmelerini destekler.
- Tahmin Güveni: Tedavi grupları genelinde gen susturma veya protein nakavt gibi biyobelirteç okumalarındaki tutarlılığı artırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Bileşiklerin MSS'ye homojen bir şekilde iletilmesini sağlayarak, sonraki taramalar için standartlaştırılmış biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Kontrollü hayvan konumlandırması ve azaltılmış işlem stresi sayesinde analiz tekrarlanabilirliğini kolaylaştırır.
- Platform Yeniden Kullanımı: siRNA, nanoparçacıklar ve antikorlar dahil olmak üzere MSS iletimi için çeşitli modalitelerin değerlendirilmesini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Nörodejenerasyon veya viral enfeksiyon modellerinde yer alan temel beyin bölgelerine tutarlı iletim sağlayarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Operasyonel Değer: Her seansta sekiz fareye kadar paralel işlem yaparak terapötik adayların hızlı bir şekilde test edilmesini sağlar.
- Riskle Düzenlenmiş İlerleme: MSS maruziyeti ve hedef modülasyon verilerine olan güveni artırarak devam/dur kararlarını destekler.
Pipeline ve İş Akışı Entegrasyonu
Cihaz, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik optimizasyonuna kadar keşif iş akışına entegre olarak, IND öncesi çalışmalardan önce güvenilir MSS iletim değerlendirmelerini destekler.
- Keşif Biyolojisi: Hedef modülasyonunu in vivo doğrulamak için siRNA veya peptid terapötiklerinin tutarlı bir şekilde iletilmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: İntranazal bileşik uygulaması sırasında hayvan konumlandırmasını standardize ederek analiz hazırlığını ve tekrarlanabilirliği artırır.
- Analitik: Tedavi grupları arasında floresan, qPCR veya biyobelirteç okumaları yoluyla MSS alımının kantitatif karşılaştırmasına olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: Doz aralığı ve etkinlik çalışmalarında kullanılan MSS iletim metriklerinin güvenilirliğini artırarak, keşif sürecini preklinik sürekliliğe bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı projeler ve terapötik alanlar genelinde birden fazla MSS hedefli modalitenin değerlendirilmesi için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Prosedürel değişkenliği azaltarak MSS iletimi ve hedef etkileşimi konusundaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: İşlem hacmini ve standardizasyonu iyileştirerek, manuel uygulama süresini ve teknisyen bağımlılığını azaltır.
- Stratejik Değer: Veri kalitesini artırarak ve MSS iletim analizlerindeki yanlış negatifleri azaltarak daha iyi git/gitme kararlarını destekler.
- Portföy Etkisi: Tekrarlanabilir MSS alım verilerine dayanarak, intranazal terapötik adayların riskle uyumlu şekilde önceliklendirilmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Konforu ve doğru pozisyonlandırmayı sağlamak için anestezi değerlendirmesi ve uygun hayvan sabitleme konusunda eğitim gerektirir.
- Tutarlı damlacık oluşumu için mikropipetler ve steril uçlar gibi intranazal uygulama ekipmanlarına erişime bağlıdır.
- Burun delikleri arasındaki inokülasyonlarda tek tip baş aşağı ve öne eğik pozisyonlandırmanın ve zamanlamanın sağlanması için ekipler arası standardizasyon gereklidir.
- Ayarlanabilir koltuk yüksekliği ve eğim özellikleri kullanılarak farklı fare suşlarına veya boyutlarına göre uyarlanmalıdır.
- Hassas intranazal uygulama gerektiren prosedürlerle sınırlıdır; intravenöz veya oral uygulama yolları için uygun değildir.
