Orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon
March 1st, 2019
Burada, iki orta-den geçerek deneyleri Ca2 +etkileri değerlendirilmesi için-sinyalizasyon ve acrosome tepki insan sperm olarak açıklanmıştır. Bu deneyleri bileşikler üzerinde Ca2 +etkileri için büyük miktarda hızlı ve kolay bir ekran için kullanılabilir-insan sperm sinyal ve acrosome reaksiyon.
Bizim tahliller insan sperm hücresi fonksiyonu üzerindeki etkileri için bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Özellikle, bu yöntemler hızlı ve kolay insan sperm hücrelerinde kalsiyum sinyalizasyon ve akrozom reaksiyonu üzerindeki etkileri için bileşiklerin çok sayıda ekran için kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimleri, başkalarının kendi laboratuvarlarında benzer deneyler ayarlamalarını kolaylaştırır.
45 derecelik açıyla bir tüp raf içine ham meni numunesi bir mililitre başına 50 mililitrelik tüp yerleştirerek ve her tüp için 37 derece Santigrat İnsan Tubal Sıvı veya HTF pozitif orta dört mililitre ekleyerek başlayın. Daha sonra, dikkatle her tüpün altına sıvılaştırılmış meni örnek bir mililitre pipet ve bir saat boyunca 37 derece santigrat tüpler yerleştirin. Kuluçka sonunda, 45 derecelik açıda tutulan modifiye pipet ucu kullanarak, HTF pozitif ortam içeren hareketli sperm hücresinin üst fraksiyonunun büyük bir kısmını yeni 15 mililitrelik plastik bir tüpe yavaşça aktarın.
Toplanan sperm hücrelerini saymak için, 20 mikrolitrelik bir aliquot'u beklenen konsantrasyona göre yuvarlak bir alt iki mililitrelik tüpte S100 tamponundaki 10, 20, 30, 50 veya 90 faktörüne seyreltin. Dakikada 700 dönüşte seyreltilmiş sperm hücrelerini 10 saniye boyunca girdap. Daha sonra, numunenin içine bir SP1 kaseti batırın ve beyaz pistonun baskısını tamamen bastırarak numunenin bir aliquot'unu kasete aspire edin.
Daha sonra kaseti görüntü sitometre tepsisine yerleştirin ve PI lekeli insan sperm hücresi titresini uygulanan seyreltme faktörüne göre çalıştırın. Serbest hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri ölçmek için, sperm örneğini bir kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin ve 50 mikrolitre florofor lekeli sperm hücresini 384 mikro kuyunun bir sırasının 24 kuyusuna çıkarmak için otomatik tekrarlayıcı pipet kullanın. Mikro kuyu plakasını floresan plaka okuyucusuna 30 santigrat derecede yerleştirin ve florofor için uygun protokolü seçin.
Sperm hücrelerinin sırasına bir kuyu seçin ve kazancı %20'lik bir hedef değere ayarlayın ve ölçümü başlatın. 10 temel döngüden sonra, denemeyi duraklatın ve mikro kuyu plakası ile çekmeceyi atın. 12 kanallı pipet kullanarak, hızlı bir şekilde satırda 12 yinelenen kuyular içine bileşikler ve ilgi kontrolleri hazırlanan çözümler 25 mikrolitre ekleyin ve hemen mümkün olduğunca çabuk ölçüm devam etmek için okuyucuya plaka döndürün.
Bileşiklerin veya kontrollerin eklenmesine yanıt olarak floresan herhangi bir değişiklik alet tarafından yakalanır. Akrozom reaksiyon analizi için, kapasitasyonlu sperm hücrelerini uygun floresan boyalar, bileşikler veya kontrollerle kuluçkaya yatırdıktan sonra, numuneleri pipetleme ile karıştırın ve her test numunesinin 50 mikrolitresini 100 mikrolitre immobilize solüsyonuna ekleyin. Numuneleri tekrar karıştırın ve numune başına bir A2 kaydırağının odalarını oda başına yaklaşık 30 mikrolitre numune ile yükleyin.
Ardından ilk yüklenen slaydı görüntü sitometresinin tepsisine yerleştirin. FlexiCyte Protokolü'nü seçin ve Çalıştır'a basın. Burada temsili sonuçlar dört bileşiğin etkisini test ederek, pozitif progesteron kontrolü ve orta eldeli kalsiyum sinyal testini kullanarak negatif tampon kontrolü ile gözlemlenebilir.
Bu grafikte, progesteron seri seyreltilmiş konsantrasyonu tarafından indüklenen hücre içi serbest kalsiyum konsantrasyonunda pik yüzde değişiklikleri elde progesteron bir doz yanıt eğrisi gösterilmiştir. Bu veriler, bir negatif veya iki pozitif kontrolden birinin orta seviyedeki bir akrozom reaksiyon testinde kapasite edilmiş insan sperm hücrelerinde bir akrozom reaksiyonunun indüksiyonu üzerindeki etkilerini göstermektedir. İndüklenen sinyallerin doruklarını kaçırmamak için, kimyasalları çoğaltma kuyularına hızlı bir şekilde eklemek ve bundan sonra ölçüme hemen devam etmek çok önemlidir.
Florofor ve boyaların türünü değiştirerek, tahlillerimiz farklı bilimsel soruları yanıtlamak için kolayca değiştirilebilir. Bu tahliller zaten insan sperm fonksiyonu üzerindeki etkileri için bileşiklerin büyük gruplar test etmek için çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, insan sperm hücrelerindeki kalsiyum sinyalizasyonu ve akrozom reaksiyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tasarlanmış iki orta verimli ölçüm yöntemi sunmaktadır. Bu ölçüm yöntemleri, çok sayıda bileşiğin hızlı bir şekilde taranmasına olanak sağlayarak sperm hücre işlevi hakkında bilgiler sunar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Üreme biyolojisi
- Hücre sinyalizasyonu
- Yöntem geliştirme
Arka Plan
- Kalsiyum sinyalizasyonu, sperm işlevinde hayati bir rol oynar.
- Akrozom reaksiyonu, sperm-yumurta etkileşimi için kritik öneme sahiptir.
- Etkili bileşenleri belirlemek için verimli tarama yöntemlerine ihtiyaç vardır.
Kullanılan Yöntemler
- Orta verimli kalsiyum sinyalizasyonu ölçümü
- İnsan sperm hücreleri
- Florofor boyalı ölçümler ve görüntü sitometrisi
Ana Bulgular
- Bileşenlerin hücre içi kalsiyum konsantrasyonu üzerindeki etkilerinin gösterilmesi.
- Olumlu ve olumsuz kontrollerle doz-yanıt ilişkilerinin gösterilmesi.
- Çeşitli bileşiklerin taranması için ölçüm tekrarlanabilirliğinin kurulması.
Sonuçlar
- Ölçümler, sperm işlevini değerlendirmek için değerli bir platform sağlar.
- Bu yöntemler, üreme araştırmasında daha geniş biyolojik sorulara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Medium-throughput assays for Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm enable rapid, quantitative evaluation of compound effects on key fertility mechanisms. These platforms support early-stage compound triage, mechanistic de-risking, and predictive assessment of reproductive liabilities or contraceptive potential. Their integration enhances portfolio decision-making by providing robust, scalable data on compound impact in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of compound effects on sperm-specific signaling pathways and functional endpoints.
- Supports biological de-risking by clarifying mechanisms underlying fertility modulation or toxicity.
- Facilitates predictive confidence in target engagement and off-target risk assessment.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, quantitative assays for medium-throughput compound screening.
- Delivers reproducible, dose-response data for both Ca2+-signaling and acrosome reaction endpoints.
- Enables scalable evaluation of large compound libraries for reproductive impact or contraceptive activity.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro sperm function assays with translational biomarker strategies for reproductive safety.
- Supports continuity from early discovery through preclinical reproductive toxicology assessment.
- Provides mechanistic data to inform risk-adjusted advancement of candidate molecules.
Pipeline & Workflow Integration
These assays position within the early discovery to lead identification continuum, enabling rapid hypothesis testing and mechanistic de-risking for compounds with potential reproductive effects.
- Discovery Biology: Quantifies compound-induced changes in Ca2+-signaling and acrosome reaction to clarify biological pathways.
- Screening: Provides standardized, medium-throughput platforms for reproducible compound evaluation.
- Analytics: Generates quantitative dose-response and additivity/synergism data for robust decision-making.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical reproductive safety assessments when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers adaptable assay formats for diverse compound classes and mechanistic questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in reproductive safety and contraceptive research.
- Operational Value: Standardizes and scales compound screening for sperm function endpoints.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing early, quantitative risk data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds with reproductive liabilities or contraceptive potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sperm biology, fluorescence assays, and image cytometry.
- Needs access to fluorescence plate readers and image cytometers for quantitative readouts.
- Demands rigorous cross-team standardization for assay reproducibility and data comparability.
- Assay adaptation may be needed for different compound classes or mechanistic endpoints.
- Rapid compound addition and measurement are critical to capture transient signaling events.
