Orta-den geçerek deneyleri Ca^{2 +}etkileri değerlendirilmesi için eleme-sinyal ve insan Sperm Acrosome reaksiyon

Bizim tahliller insan sperm hücresi fonksiyonu üzerindeki etkileri için bileşikleri test etmek için kullanılabilir. Özellikle, bu yöntemler hızlı ve kolay insan sperm hücrelerinde kalsiyum sinyalizasyon ve akrozom reaksiyonu üzerindeki etkileri için bileşiklerin çok sayıda ekran için kullanılabilir. Bu yöntemin görsel gösterimleri, başkalarının kendi laboratuvarlarında benzer deneyler ayarlamalarını kolaylaştırır.

45 derecelik açıyla bir tüp raf içine ham meni numunesi bir mililitre başına 50 mililitrelik tüp yerleştirerek ve her tüp için 37 derece Santigrat İnsan Tubal Sıvı veya HTF pozitif orta dört mililitre ekleyerek başlayın. Daha sonra, dikkatle her tüpün altına sıvılaştırılmış meni örnek bir mililitre pipet ve bir saat boyunca 37 derece santigrat tüpler yerleştirin. Kuluçka sonunda, 45 derecelik açıda tutulan modifiye pipet ucu kullanarak, HTF pozitif ortam içeren hareketli sperm hücresinin üst fraksiyonunun büyük bir kısmını yeni 15 mililitrelik plastik bir tüpe yavaşça aktarın.

Toplanan sperm hücrelerini saymak için, 20 mikrolitrelik bir aliquot'u beklenen konsantrasyona göre yuvarlak bir alt iki mililitrelik tüpte S100 tamponundaki 10, 20, 30, 50 veya 90 faktörüne seyreltin. Dakikada 700 dönüşte seyreltilmiş sperm hücrelerini 10 saniye boyunca girdap. Daha sonra, numunenin içine bir SP1 kaseti batırın ve beyaz pistonun baskısını tamamen bastırarak numunenin bir aliquot'unu kasete aspire edin.

Daha sonra kaseti görüntü sitometre tepsisine yerleştirin ve PI lekeli insan sperm hücresi titresini uygulanan seyreltme faktörüne göre çalıştırın. Serbest hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikleri ölçmek için, sperm örneğini bir kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin ve 50 mikrolitre florofor lekeli sperm hücresini 384 mikro kuyunun bir sırasının 24 kuyusuna çıkarmak için otomatik tekrarlayıcı pipet kullanın. Mikro kuyu plakasını floresan plaka okuyucusuna 30 santigrat derecede yerleştirin ve florofor için uygun protokolü seçin.

Sperm hücrelerinin sırasına bir kuyu seçin ve kazancı %20'lik bir hedef değere ayarlayın ve ölçümü başlatın. 10 temel döngüden sonra, denemeyi duraklatın ve mikro kuyu plakası ile çekmeceyi atın. 12 kanallı pipet kullanarak, hızlı bir şekilde satırda 12 yinelenen kuyular içine bileşikler ve ilgi kontrolleri hazırlanan çözümler 25 mikrolitre ekleyin ve hemen mümkün olduğunca çabuk ölçüm devam etmek için okuyucuya plaka döndürün.

Bileşiklerin veya kontrollerin eklenmesine yanıt olarak floresan herhangi bir değişiklik alet tarafından yakalanır. Akrozom reaksiyon analizi için, kapasitasyonlu sperm hücrelerini uygun floresan boyalar, bileşikler veya kontrollerle kuluçkaya yatırdıktan sonra, numuneleri pipetleme ile karıştırın ve her test numunesinin 50 mikrolitresini 100 mikrolitre immobilize solüsyonuna ekleyin. Numuneleri tekrar karıştırın ve numune başına bir A2 kaydırağının odalarını oda başına yaklaşık 30 mikrolitre numune ile yükleyin.

Ardından ilk yüklenen slaydı görüntü sitometresinin tepsisine yerleştirin. FlexiCyte Protokolü'nü seçin ve Çalıştır'a basın. Burada temsili sonuçlar dört bileşiğin etkisini test ederek, pozitif progesteron kontrolü ve orta eldeli kalsiyum sinyal testini kullanarak negatif tampon kontrolü ile gözlemlenebilir.

Bu grafikte, progesteron seri seyreltilmiş konsantrasyonu tarafından indüklenen hücre içi serbest kalsiyum konsantrasyonunda pik yüzde değişiklikleri elde progesteron bir doz yanıt eğrisi gösterilmiştir. Bu veriler, bir negatif veya iki pozitif kontrolden birinin orta seviyedeki bir akrozom reaksiyon testinde kapasite edilmiş insan sperm hücrelerinde bir akrozom reaksiyonunun indüksiyonu üzerindeki etkilerini göstermektedir. İndüklenen sinyallerin doruklarını kaçırmamak için, kimyasalları çoğaltma kuyularına hızlı bir şekilde eklemek ve bundan sonra ölçüme hemen devam etmek çok önemlidir.

Florofor ve boyaların türünü değiştirerek, tahlillerimiz farklı bilimsel soruları yanıtlamak için kolayca değiştirilebilir. Bu tahliller zaten insan sperm fonksiyonu üzerindeki etkileri için bileşiklerin büyük gruplar test etmek için çeşitli çalışmalarda kullanılmıştır.