Name: RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Öğrenin, PKR proteininin RNA etkileşimcilerini genom çapında belirlemek için formaldehit çapraz bağlama ve immünopresipitasyon yöntemini. Bu teknik, gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesini ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser temel bilim araştırma programı aracılığıyla Ulusal Araştırma Vakfı, Kore (Kore hükümeti Bilim Bakanlığı ve ICT (NMK-2016R1C1B2009886) tarafından desteklenen NMK) tarafından desteklenmiştir.

1. çözüm ve hücre hazırlık
<ol><li>Çözüm hazırlık<ol>
<li>Hücre kültür ortamı için orta HeLa hücre kültürü için 50 mL fetal sığır serum (FBS) ekleyerek 500 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) için hazır olun. Not: Antibiyotik hücre kültür ortamına eklenebilir, ancak biz antibiyotik kullanmayın.</li>
		<li>%0,1 paraformaldehyde için 1 %4 (w/v) paraformaldehyde erimesi x Phosphate-Buffered serum fizyolojik (%0,1 (v/v) paraformaldehyde 30 mL 1 x PBS ekleyerek yapmak için PBS) Isıtma sıcak tabakta ve seyreltik ile. Dikkat: bir duman mahallede tüm adımlarını gerçekleştirin ve paraformaldehyde çözüm kaynatın değil dikkatli olun. % 0,1 çözüm ışıktan korumak ve 4 ° C'de depolayın Bir ay içinde çözüm kullanın. Not: Son %0,1 (v/v) paraformaldehyde çözüm pH 7 civarında olmalıdır.</li>
		<li>FCLIP lizis arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 15 mM NaCl, 10 mM EDTA, %0,5 (v/v) nonidet-p40 (NP-40), (v/v) Triton X-100, % 0,1 %0,1 (v/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) ve % 0.1 (w/v) sodyum deoxycholate. Üçlü distile su (TDW) için 40 mL ekleyin. 4 ° C'de mağaza</li>
		<li>FCLIP yıkama arabellek hazırlamak: 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, %0,1 (v/v) NP-40, %0,1 (v/v) Triton X-100, (v/v) SDS % 0,1 ve %0,1 (w/v) sodyum deoxycholate. TDW 40 mL ekleyin. 4 ° C'de mağaza</li>
		<li>4 PK arabellek x hazırlamak: 400 mM Tris-HCl (pH 7.5), 200 mM NaCl, 40 mM EDTA ve % 4 (v/v) SDS. TDW 40 mL ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>FCLIP elüsyon arabellek hazırlamak: 4 PK arabellek, üre 21 g ve TDW 8,5 mL x 20 mL. Taze hazırlayın.</li>
		<li>RNA elüsyon arabellek hazırlamak: 0.3 M NaOAc ve %2 (w/v) SDS. Oda sıcaklığında saklayın.</li>
		<li>2 x RNA yükleme boya hazırlamak: % 0,025 (w/v) bromophenol mavi, (w/v) % 0,025 Ksilen cyanol, 5 mM EDTA, %0.05 (w/v) SDS ve %95 (v/v) formamide. -20 ° C'de mağaza</li>
		<li>1 x TBE arabellek hazırlamak: 0.089 M Tris-Bor ve 0.002 M EDTA. 500 mL TBE tampon hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>S veya M faz tutuklandı hücre hazırlanması<ol>
<li>HeLa hücreleri S veya M faz tutuklandı örnekleri için sırasıyla tohum ~ 750.000 veya ~ 1.000.000. 37 ° C ve % 5 CO2 24 h için hücrelerin büyümesine.</li>
		<li>2 mM timidin hücrelerle tedavi etmek ve 18 h 37 ° C'de için kuluçkaya</li>
		<li>Hücreleri iki kez PBS ile yıkayın. Taze medya ekleyin ve 37 ° C'de 9 h için kuluçkaya</li>
		<li>S hücreler için faz tutuklandı, 2 mM timidin hücrelerle tedavi. M hücreler için faz tutuklandı, 100 ng/mL nocodazole hücrelerle tedavi. 15 h 37 ° C ve hasat hücreleri için kuluçkaya. Not: Hücre döngüsü örnekleri polimerlerin FACS kullanarak kontrol edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. formaldehit cross-linking ve immunoprecipitation
<ol><li>Hücre hasat<ol>
<li>Bir S faz örnek için hücreleri hücre kazıyıcı ve transfer 15 mL konik tüp içine toplamak. M faz örneği için M hücreleri faz tutuklandı ayırmak ve 15 mL konik tüp içine aktarmak için hücre kültür çanak yan dokunun. Not: bir hücre kazıyıcı faz tutuklandı M hücreleri polimerlerin artırmak için kullanmayın.</li>
		<li>380 x g 3 dk. Kaldır için oda sıcaklığında, hücreleri süpernatant santrifüj kapasitesi ve 1 mL soğuk PBS ve transfer içine 1.5 mL microcentrifuge tüp ile yeniden askıya alma.</li>
		<li>10.000 x g 4 ° c de hücreler için 30 s. Kaldır süpernatant tamamen santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Formaldehit crosslinking<ol>
<li>% 0.1 paraformaldehyde 10 dk için 750 μL hücreleri düzeltmek için oda sıcaklığında ekleyin.</li>
		<li>1 M glisin 250 μL ekleyin ve ek bir 10 min tepki gidermek için oda sıcaklığında kuluçkaya. 10.000 x g 4 ° c de hücreler için 30 s. Kaldır süpernatant tamamen santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>PBS 1 mL ile yeniden askıya alma. 10.000'hücreleri santrifüj kapasitesi 30 s ve Kaldır süpernatant için 4 ° C'de g x.</li>
		<li>FCLIP lizis arabelleği %0,2 (v/v) proteaz inhibitörü ve %2 (v/v) RNase inhibitörü ile 400 μL ile yeniden askıya alma. 10 dakika buz üzerinde kuluçkaya ve bir ultrasonicator kullanarak solüsyon içeren temizleyicide.</li>
		<li>~ 150 mm NaCl toplama ayarlamak için 5 M NaCl 11 μL ekleyin. Kısaca girdap ve 21,130 x g 4 ° c de 15 dakika süreyle santrifüj süpernatant önceden soğutulmuş 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Not: yeni bir santrifüj tüpü süpernatant ile 40 μL giriş örnek olarak korur. Mağaza giriş örneği 4 ° c '</li>
	</ol>
</li>
	<li>Immunoprecipitation<ol>
<li>Protein A boncuk 20 μL 1.5 mL microcentrifuge tüp içine ekleyin.</li>
		<li>Boncuk fCLIP lizis arabelleği 400 μL ile yıkayın. 1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP lizis arabelleği 400 μL dikkatle ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.</li>
		<li>Yıkama üç kez tekrarlayın. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Boncuk fCLIP lizis arabellek 300 μL içinde yeniden askıya alma. ~ 150 mm NaCl toplama ayarlamak için 5 M NaCl 8.3 μL ekleyin. PKR antikor 10 μL ekleyin ve bir rotator 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya</li>
		<li>1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP yıkama arabelleği 400 μL ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.</li>
		<li>Yıkama adım iki kere tekrar edin. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın. Not: Hiç bir girdap karıştırıcı kullanın. Tüp elinizle yavaşça tersine çevirin.</li>
		<li>Lysate, 300 μL ekleyin ve bir rotator üzerinde 4 ° C'de 3 h için kuluçkaya. Not: Artan arka plan bağlamada daha uzun kuluçka süresi neden olabilir.</li>
		<li>1000 x g 1 dk. Kaldır 4 ° C'de, boncuk süpernatant santrifüj kapasitesi ve fCLIP yıkama arabelleği 400 μL ekleyin. Yavaşça boncuk 3 ters çevirme tarafından yeniden askıya alma ~ 4 kez.</li>
		<li>Yıkama üç kez tekrarlayın. Son yıkama sonra tamamen süpernatant kaldırın.</li>
		<li>FCLIP elüsyon arabelleği 300 μL ekleyin. Bir thermomixer 3 h PKR boncuk elute için 25 ° c için kuluçkaya. Not: fCLIP elüsyon arabellek taze hazırlayın.</li>
		<li>1000 x g oda sıcaklığında, santrifüj kapasitesi ve süpernatant temiz bir siliconized tüp aktarın. Not: Bir microcentrifuge tüp de ok, ama silikonlu tüp de crosslinking adım (Adım 2.3.12) sırasında buharlaşma önlemek için tercih edilir.</li>
		<li>300 μL İndinavir K, (20 mg/mL) eklemek ve bir gecede 65 ° C'de kuluçkaya Not: buharlaşma önlemek için ısıtmalı kapaklı bir thermomixer kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA çıkarma<ol>
<li>Asit-fenol kloroform ve girdap 580 μL 1 h için 37 ° C'de 30 s. Incubate ekleyin.</li>
		<li>Girdap 30 s ve 10 min için 12.000 x g oda sıcaklığında, santrifüj için.</li>
		<li>Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant (örneğin, Glycoblue) 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Granül 1 h için 4 ° C'de maksimum hızda centrifuging tarafından çökelti. Not: RNA/DNA parçaları gözlendi değil, RNA/DNA parçaları gözlenen kadar coprecipitant ve santrifüj ek 1 h devam Bu adım için bir ek 0,5 μL ekleyin.</li>
		<li>Süpernatant kaldırın ve 1 mL % 75 etil alkol ekleyin. 5 dakika süreyle santrifüj, 12.000 x g 4 ° C'de yıkama adım bir kez daha yineleyin. Süpernatant tamamen kaldırmak ve oda sıcaklığında Pelet Makinası.</li>
		<li>1s için 37 ° C'de TDW, ben tampon Dnaz 5 μL, 1 μL RNase inhibitörü ve 2 μL Dnaz ı. kuluçkaya, 42 μL ekleyin.</li>
		<li>TDW 150 μL ve asit-fenol kloroform 200 μL ekleyin. 10 dk için 12.000 x g oda sıcaklığında, 30 s. santrifüj için girdap.</li>
		<li>Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve % 100 etil alkol 1 mL 20 μL ekleyin. Gecede-80 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.</li>
		<li>TDW uygun miktarda yeniden askıya alma.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Sıralama kitaplığı hazırlık
<ol><li>rRNA kaldırma<ol>
<li>TDW 28 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma. Not: Toplam RNA en fazla 5'ten μg olmalıdır.</li>
		<li>RRNA kaldırmak için rRNA kaldırma Kit'in başvuru kılavuzu tarafından sağlanan yordamları izleyin.</li>
		<li>Temiz rRNA kadar manyetik boncuklar 160 μL ekleyerek RNA'ların tükendi.<ol>
<li>~ 15 kez pipetting tarafından mix ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
			<li>Manyetik çubuk Tüp takmak ve süpernatant kaldırın.</li>
			<li>Boncuk hala manyetik çubuğunda eklenir ve 30 için kuluçkaya % 80 etil alkol 300 μL eklemek s.</li>
			<li>Etil alkol yerine koymak ile taze bir 300 μL eriyik. Hava Kuru oda sıcaklığında 12 dk için manyetik çubuğu üstündeki.</li>
			<li>Boncuk TDW ve mix 12 μL 15 kez pipetting tarafından yeniden askıya alma.</li>
			<li>Manyetik çubuğunun üstündeki eklemek ve süpernatant temiz bir PCR tüp taşımak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Parçalanmış ribozomal RNA (rRNA'lar) tükenmesi Kit rRNA tarafından sağlanan yordamı tüketmek.</li>
		<li>RNA'ların kadar manyetik boncuklar ve yinelenen adımlar 3.1.3.1 3.1.3.6 110 μL ekleyerek temiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>RNA etiketleme ve adaptör ligasyonu<ol>
<li>RRNA tükenmiş RNA'ların üzerinde 10 x CIAP arabelleğinin 2 μL, 1 μL RNase inhibitörü ve Antarktika alkalen fosfataz 2 μL ekleyin. 37 ° C için 1 h ve daha sonra 65 ° C fosfataz devre dışı bırakabilirsiniz 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>10 x PNK arabelleği 3 μL, 1,5 μL RNase inhibitörü, T4 PNK enzim, r-ATP 0.8 μL ve TDW 1.7 μL 1,5 μL ekleyin. 50 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>10 mm ATP 1,5 μL ekleyin ve ek 40 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Reaksiyon 170 μL RNA elüsyon arabelleği ekleyerek durdurmak.</li>
		<li>Asit-fenol kloroform ve girdap 200 μL 12.000 x g oda sıcaklığında, 30 s. santrifüj 10 dakika için ekleyin.</li>
		<li>Üst katmanı bir temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve % 100 etil alkol 1 mL 20 μL ekleyin. Gecede-80 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın. TDW 4,5 μL içinde yeniden askıya alma ve 2 x RNA yükleme boya 9 μL ekleyin.</li>
		<li>Örnek 5 min ve % 10 üre-sayfa jel üzerindeki yükü için 95 ° c ısı.</li>
		<li>Jel 370 V 40 min için çalıştırın. Not: jel 370 V 90 dk için örnek yüklemeden önce önceden çalıştırın.</li>
		<li>Jel ~ 100-500 nükleotit bölge kesmek ve jel kesin.</li>
		<li>0.3 M NaCl 700 μL ekleyin ve bir gecede bir rotator üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Çözüm bir sütun ve 5 min için oda sıcaklığında maksimum hızda santrifüj aktarın.</li>
		<li>Eluate temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>3' adaptör ligasyonu<ol>
<li>RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.</li>
		<li>RNA granül TDW 6.5 μL içinde yeniden askıya alma ve 10 mikron 3' adaptör 1 μL ekleyin.</li>
		<li>Çözüm bir PCR tüp aktarmak ve 70 ° c 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>10 x ligasyonu arabelleği 1 μL, 0.5 μL RNase inhibitörü ve T4 RNA ligaz 2 in 1 μL ekleyin. 28 ° c için 1 h, 25 ° C 6 h ve 22 ° C 6 h için kuluçkaya.</li>
		<li>2 x RNA yükleme boya ve ısı 12 μL 95 ° c 5 min için ekleyin.</li>
		<li>Jel arındırmak 3' adaptör bakmaksızın RNA'ların 3.2.9-3.2.13 içinde açıklandığı gibi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5' adaptör ligasyonu<ol>
<li>RNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın.</li>
		<li>RNA granül TDW 4.2 μL içinde yeniden askıya alma ve 5 mikron 5' adaptör 1 μL ekleyin.</li>
		<li>Çözüm bir PCR tüp aktarmak ve 70 ° c 2 min için kuluçkaya.</li>
		<li>10 x ligaz arabelleği, RNase inhibitörü, 10 mm ATP, T4 RNA ligaz 1 0,8 μL 0.8 μL 0.4 μL 0.8 μL ekleyin. 28 ° c için 1 h, 25 ° C 6 h ve 22 ° C 6 h için kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ters transkripsiyon ve PCR güçlendirme<ol>
<li>5' bağdaştırıcısında ve birleştirilmiş RNA'ların, 4 mikron ters transkripsiyon astar 1 μL ekleyin. 70 ° c 2 min için kuluçkaya ve hemen 4 ° C'ye serin</li>
		<li>5 x FS arabelleği 4 μL, 2.5 mM dNTP 4 μL, 0.1 M DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve transkriptaz 1 μL 1 μL ekleyin. 50 ° c için 1 h ve 70 ° C 15dk için kuluçkaya.</li>
		<li>PCR güçlendirme hazırlamak<ol>
<li>Mix 1 μL RT ürün, 1 μL 25 mikron RPI astar, 1 μL 25 mikron RP1 astar, 5 x HF arabellek, 2.5 mM dNTP 4 μL, TDW 32,5 μL 10 μL ve yüksek sadakat polimeraz 0.5 μL.</li>
			<li>PCR programı 11 ~ 13 döngüleri. Not: PCR programdır: 30 98 ° C s, 98 ° C 10 için sıcak bir başlangıç için s, 60 ° C 30 45 72 ° C ve s s amplifikasyon ve 5 min için 72 ° C için. Amplifikasyon adım 11-13 döngüleri için yinelenir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Manyetik boncuklar ve aşağıdaki adımları 3.1.3.1 3.1.3.6 40 μL kullanarak ama TDW 10 μL DNA elute kullanarak PCR ürünleri kadar temiz.</li>
		<li>10 x DNA yükleme boya 2 μL ekleyin. Örnek % 6 Akrilamid jel üzerinde yük ve 200 V 30 dk için çalıştırın.</li>
		<li>Sybr altın (%0.01 (v/v) 1 x TBE arabelleği) oda sıcaklığında 5 min için leke.</li>
		<li>1 x TBE tampon oda sıcaklığında 5 min için de-leke.</li>
		<li>Jel ~ 200-700 nükleotit bölge kesmek ve jel kesin.</li>
		<li>0.3 M NaCl 700 μL ekleyin ve gecede DNA elute için oda sıcaklığında kuluçkaya.</li>
		<li>Her şey bir sütun ve 5 min için oda sıcaklığında maksimum hızda santrifüj üzerine yükleyin.</li>
		<li>Eluate temiz 1.5 mL microcentrifuge tüp içine aktarın. 3 M NaOAc, coprecipitant, 0.5 μL ve isopropanol eşit bir hacmi 1/10 hacmi ekleyin. Gecede-20 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>DNA granül çökelti ve 2.4.4-2.4.5 adımlarda açıklandığı gibi % 75 etil alkol ile yıkayın. TDW 20 μL içinde yeniden askıya alma.</li>
		<li>Bir sequencer kullanarak örneğini analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analiz RNA'ların PKR etkileşim qRT-PCR kullanarak
<ol><li>Yöntem 1: Rasgele hexamer ters transkripsiyon<ol>
<li>TDW 8,5 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma ve çözüm için PCR tüp aktarın.</li>
		<li>100 μm kalınlığında rasgele hexamers 0.5 μL ve 4 μL 2.5 mM dNTP karışımı ekleyin.</li>
		<li>Isı 65 ° c 5 min için ve hemen çözüm kuluçkaya en az 1 dakika buzda.</li>
		<li>Mix tepki olun: 5 x SSIV arabellek 4 μL, 100 mm DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve ters transkriptaz (200 U/μL) 1 μL 1 μL. RNA tepki karışımı ekleyin.</li>
		<li>Karışımı 10 dakika, 10 min 50 ° C 23 ° C'de kuluçkaya ve 10 dk 80 ° C.</li>
		<li>Bir gerçek zamanlı PCR sistemi kullanarak cDNA analiz. Not: Gerçek zamanlı PCR programdır: 95 ° C sıcak başlangıç, 95 ° C 5 için 3 min için s ve 60 ° C 10 s amplifikasyon ve 95 ° C 30 s, 65 ° C 30 s ve 95 ° C 30 s eritmek için. Amplifikasyon adım 40 döngüleri için yinelenir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yöntem 2: Strand özgü ters transkripsiyon<ol>
<li>Ters astar ana karışımı hazırlar: CMV organizatörü sıra içeren gen belirli ters transkripsiyon astar eşit miktarda gen belirli dizileri ~ 20 nükleotit tarafından takip Mix. Not: Kombine tüm gen belirli RT astar 4 mikron bölgedir.</li>
		<li>TDW 8,5 μL adımla 2.4.10 RNA çökeltilerini yeniden askıya alma ve çözüm için PCR tüp aktarın.</li>
		<li>4 mikron ana karışımı ters transkripsiyon astar ve 2.5 mM dNTP Mix 4 μL 0.5 μL ekleyin.</li>
		<li>Isı 65 ° c 5 min için ve hemen çözüm kuluçkaya en az 1 dakika buzda.</li>
		<li>Reaksiyon çözüm 4 μL 5 x SSIV arabelleği, 100 mm DTT, 1 μL RNase inhibitörü ve ters transkriptaz (200 U/μL) 1 μL 1 μL karıştırarak hazırlayın. Reaksiyon çözüm RNA-astar karışıma ekleyin.</li>
		<li>Çözüm 50 ° C'de 10 dakika ve 10 dk 80 ° C kuluçkaya.</li>
		<li>Gerçek zamanlı PCR sistemi kullanılarak cDNA analiz. Not: Program gerçek zamanlı PCR için yöntem 1'da açıklanan gibi.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meurs, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+human+double-stranded+RNA-activated+p68+kinase+in+murine+cells+mediates+phosphorylation+of+eukaryotic+initiation+factor+2+and+partial+resistance+to+encephalomyocarditis+virus+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth.</a> Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).</li>
<li>Patel, R. C., Stanton, P., McMillan, N. M., Williams, B. R., Sen, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interferon-inducible+double-stranded+RNA-activated+protein+kinase+self-associates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">The interferon-inducible double-stranded RNA-activated protein kinase self-associates in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (18), 8283-8287 (1995).</li>
<li>Bennett, R. L., Pan, Y., Christian, J., Hui, T., May, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RAX%2FPACT-PKR+stress+response+pathway+promotes+p53+sumoylation+and+activation%2C+leading+to+G%281%29+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">The RAX/PACT-PKR stress response pathway promotes p53 sumoylation and activation, leading to G(1) arrest.</a> Cell Cycle. 11 (1), 407-417 (2012).</li>
<li>Yang, X., Nath, A., Opperman, M. J., Chan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+differentially+regulates+insulin+receptor+substrates+1+and+2+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">The double-stranded RNA-dependent protein kinase differentially regulates insulin receptor substrates 1 and 2 in HepG2 cells.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (19), 3449-3458 (2010).</li>
<li>Zamanian-Daryoush, M., Mogensen, T. H., DiDonato, J. A., Williams, B. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappa+B+Activation+by+Double-Stranded-RNA-Activated+Protein+Kinase+%28PKR%29+Is+Mediated+through+NF-kappa+B-Inducing+Kinase+and+Ikappa+B+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">NF-kappa B Activation by Double-Stranded-RNA-Activated Protein Kinase (PKR) Is Mediated through NF-kappa B-Inducing Kinase and Ikappa B Kinase.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (4), 1278-1290 (2000).</li>
<li>Takada, Y., Ichikawa, H., Pataer, A., Swisher, S., Aggarwal, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+deletion+of+PKR+abrogates+TNF-induced+activation+of+IkappaBalpha+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22JNK%2C+Akt+and+cell+proliferation+but+potentiates+p44%2Fp42+MAPK+and+p38+MAPK+activation.+Oncogene%22%5BJournal%5D)">Genetic deletion of PKR abrogates TNF-induced activation of IkappaBalpha kinase.</a> JNK, Akt and cell proliferation but potentiates p44/p42 MAPK and p38 MAPK activation. Oncogene. 26 (8), 1201-1212 (2007).</li>
<li>Dabo, S., Meurs, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-dependent+protein+kinase+PKR+and+its+role+in+stress%2C+signaling+and+HCV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">dsRNA-dependent protein kinase PKR and its role in stress, signaling and HCV infection.</a> Viruses. 4 (11), 2598-2635 (2012).</li>
<li>Black, T. L., Safer, B., Hovanessian, A., Katze, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+68%2C000-Mr+Protein-Kinase+Is+Highly+Autophosphorylated+and+Activated+yet+Significantly+Degraded+during+Poliovirus+Infection+-+Implications+for+Translational+Regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Cellular 68,000-Mr Protein-Kinase Is Highly Autophosphorylated and Activated yet Significantly Degraded during Poliovirus Infection - Implications for Translational Regulation.</a> Journal of Virology. 63 (5), 2244-2251 (1989).</li>
<li>Bando, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-strand+RNA+dependent+protein+kinase+%28PKR%29+is+involved+in+the+extrastriatal+degeneration+in+Parkinson%27s+disease+and+Huntington%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Double-strand RNA dependent protein kinase (PKR) is involved in the extrastriatal degeneration in Parkinson's disease and Huntington's disease.</a> Neurochemistry International. 46 (1), 11-18 (2005).</li>
<li>Onuki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-dependent+protein+kinase+is+involved+in+tunicamycin-induced+apoptosis+and+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">An RNA-dependent protein kinase is involved in tunicamycin-induced apoptosis and Alzheimer's disease.</a> The EMBO Journal. 23 (4), 959-968 (2004).</li>
<li>Peel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+cell+stress+kinase+PKR+in+Alzheimer%27s+disease+and+human+amyloid+precursor+protein+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Activation of the cell stress kinase PKR in Alzheimer's disease and human amyloid precursor protein transgenic mice.</a> Neurobiology of Disease. 14 (1), 52-62 (2003).</li>
<li>Peel, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+binds+preferentially+to+Huntington%27s+disease+%28HD%29+transcripts+and+is+activated+in+HD+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, binds preferentially to Huntington's disease (HD) transcripts and is activated in HD tissue.</a> Human Molecular Genetics. 10 (15), 1531-1538 (2001).</li>
<li>Suen, K. C., Yu, M. S., So, K. F., Chang, R. C., Hugon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Upstream+signaling+pathways+leading+to+the+activation+of+double-stranded+RNA-dependent+serine%2Fthreonine+protein+kinase+in+beta-amyloid+peptide+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Upstream signaling pathways leading to the activation of double-stranded RNA-dependent serine/threonine protein kinase in beta-amyloid peptide neurotoxicity.</a> Journal of biological chemistry. 278 (50), 49819-49827 (2003).</li>
<li>Nakamura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PKR+complexes+with+TRBP+in+Immunometabolic+regulation+and+eIF2alpha+phosphorylation+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A critical role for PKR complexes with TRBP in Immunometabolic regulation and eIF2alpha phosphorylation in obesity.</a> Cell Reports. 11 (2), 295-307 (2015).</li>
<li>Saito, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+the+interferon-induced+double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase+activity+by+Sindbis+virus+infection+and+heat-shock+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enhancement of the interferon-induced double-stranded RNA-dependent protein kinase activity by Sindbis virus infection and heat-shock stress.</a> Microbiology and Immunology. 34 (10), 859-870 (1990).</li>
<li>Youssef, O. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+role+for+snoRNAs+in+PKR+activation+during+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Potential role for snoRNAs in PKR activation during metabolic stress.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (16), 5023-5028 (2015).</li>
<li>Murtha-Riel, P., Davies, M. V., Choi, S. Y., Hershey, J. W., Kaufman, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+Phosphorylation-resistant+Eukaryotic+Initiation+Factor+2+a-Subunit+Mitigates+Heat+Shock+Inhibition+of+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of a Phosphorylation-resistant Eukaryotic Initiation Factor 2 a-Subunit Mitigates Heat Shock Inhibition of Protein Synthesis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 268, 12946-12951 (1993).</li>
<li>Benkirane, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+potential+of+TAR+RNA+binding+protein+TRBP+and+its+regulatory+interaction+with+RNA-dependent+protein+kinase+PKR%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Oncogenic potential of TAR RNA binding protein TRBP and its regulatory interaction with RNA-dependent protein kinase PKR.</a> The EMBO Journal. 16 (3), 611-624 (1997).</li>
<li>Koromilas, A., Roy, S., Barber, G., Katze, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malignant+transformation+by+a+mutant+of+the+IFN-inducible+dsRNA-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Malignant transformation by a mutant of the IFN-inducible dsRNA-dependent protein kinase.</a> Science. 257 (5077), 1685-1689 (1992).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+is+activated+by+cellular+dsRNAs+during+mitosis+and+acts+as+a+mitotic+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PKR is activated by cellular dsRNAs during mitosis and acts as a mitotic regulator.</a> Genes & Development. 28 (12), 1310-1322 (2014).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+human+tarbp2+reveals+cellular+microRNA+targets+and+cell-cycle+function+of+TRBP%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Deletion of human tarbp2 reveals cellular microRNA targets and cell-cycle function of TRBP.</a> Cell Reports. 9 (3), 1061-1074 (2014).</li>
<li>Zhu, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+PKR+promotes+network+excitability+and+enhanced+cognition+by+interferon-gamma-mediated+disinhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of PKR promotes network excitability and enhanced cognition by interferon-gamma-mediated disinhibition.</a> Cell. 147 (6), 1384-1396 (2011).</li>
<li>Dagon, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+RNA-dependent+protein+kinase%2C+PKR%2C+down-regulates+CDC2%2Fcyclin+B1+and+induces+apoptosis+in+non-transformed+but+not+in+v-mos+transformed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR, down-regulates CDC2/cyclin B1 and induces apoptosis in non-transformed but not in v-mos transformed cells.</a> Oncogene. 20 (56), 8045-8056 (2001).</li>
<li>Elbarbary, R. A., Li, W., Tian, B., Maquat, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAU1+binding+3%27+UTR+IRAlus+complements+nuclear+retention+to+protect+cells+from+PKR-mediated+translational+shutdown%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">STAU1 binding 3' UTR IRAlus complements nuclear retention to protect cells from PKR-mediated translational shutdown.</a> Genes & Development. 27 (13), 1495-1510 (2013).</li>
<li>Cho, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN28A+is+a+suppressor+of+ER-associated+translation+in+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">LIN28A is a suppressor of ER-associated translation in embryonic stem cells.</a> Cell. 151 (4), 765-777 (2012).</li>
<li>Licatalosi, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HITS-CLIP+yields+genome-wide+insights+into+brain+alternative+RNA+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing.</a> Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).</li>
<li>Van Nostrand, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+transcriptome-wide+discovery+of+RNA-binding+protein+binding+sites+with+enhanced+CLIP+%28eCLIP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP).</a> Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKR+Senses+Nuclear+and+Mitochondrial+Signals+by+Interacting+with+Endogenous+Double-Stranded+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">PKR Senses Nuclear and Mitochondrial Signals by Interacting with Endogenous Double-Stranded RNAs.</a> Molecular Cell. 71 (6), 1051-1063 (2018).</li>
<li>Kim, B., Jeong, K., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+Mapping+of+DROSHA+Cleavage+Sites+on+Primary+MicroRNAs+and+Noncanonical+Substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Genome-wide Mapping of DROSHA Cleavage Sites on Primary MicroRNAs and Noncanonical Substrates.</a> Molecular Cell. 66 (2), 258-269 (2017).</li>
<li>Ricci, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+senses+overall+transcript+secondary+structure+to+regulate+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Staufen1 senses overall transcript secondary structure to regulate translation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 26-35 (2014).</li>
<li>Kim, B., Kim, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((fCLIP-seq+for+transcriptomic+footprinting+of+dsRNA-binding+proteins%3A+Lessons+from+DROSHA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">fCLIP-seq for transcriptomic footprinting of dsRNA-binding proteins: Lessons from DROSHA.</a> Methods. , (2018).</li>
<li>Dhir, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+double-stranded+RNA+triggers+antiviral+signalling+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial double-stranded RNA triggers antiviral signalling in humans.</a> Nature. 560 (7717), 238-242 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

S veya M faz tutuklandı örnekleri hazırlamak için işlem şekil 1' de gösterilmiştir. S aşamada hücreleri tutuklamaya biz nereye biz timidin sürümüyle arasında yüksek tutuklama verimliliği (şekil 1A) sağlamak için iki kez bir 9 h hücrelerle tedavi timidin çift blok yöntemi kullanılır. M faz durması için biz timidin bir kez hücrelerle tedavi 9 h yayın tarafından takip ve nocodazole prometafaz (şekil 1B) blok hücreleri uygulanır. Hücre ...

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek, olarak da bilinen ökaryotik başlama faktör 2-Alfa kinaz 2 (EIF2AK2), RNA'ların tarafından sağlanan bilgi ileten bir iyi karakterize protein kinaz var. Ökaryotik çeviri başlatma 2 alt birim alfa (eIF2α) ait kinaz aile ve serin 51 yanıt olarak küresel çeviri1bastırmak için enfeksiyon, eIF2α phosphorylates. Bu bağlamda, PKR PKR dimerization ve autophosphorylation2için bir platform sağlamak viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs), tarafından etkinleştirilir. EIF2α ek olarak, PKR da p53, insülin reseptör substrat 1, inhibitörü κB ve c-Jun N-terminal kinaz (JNK) çok sayıda sinyal iletim yollarının3,4,5, etkinliği düzenleyen fazdan 6.
PKR aslında poliovirus'dsRNAs7,8tanıyarak poliovirus enfeksiyon sırasında eIF2α fosforile kinaz olarak tespit edilmiştir. PKR giderek bağışıklık yanıtı ötesinde çok yönlü rolleri oynamak için bulunur ve onun anormal harekete geçirmek ya da arıza çok sayıda insan hastalıklarda ima etti. Aktif/Phosphorylated PKR (pPKR) apoptosis sırasında sık sık gözlenen ve dejeneratif hastalıklar, özellikle gibi Huntington nörodejeneratif hastalıklar, Parkinson'ın ve Alzheimer hastalığı9 hastalarda genel özelliği olduğunu ,10,11,12,13. Buna ek olarak, PKR metabolik stres ve ısı şok14,15,16,17gibi çeşitli stres koşullarında etkinleştirilir. Öte yandan, PKR inhibisyonu artan hücre çoğalması ve hatta Malign transformasyon18,19ile sonuçlanır. PKR işlevi de normal beyin işlevinde önemli ve pPKR düzeyi olarak hücre döngüsü sırasında sırasında M faz20,21,22yükseltilmiş. Bu bağlamda pPKR küresel çeviri bastırır ve uygun hücre bölünmesi20için gerekli olan anahtar Mitotik sinyal sistemleri için ipuçları sağlar. Ayrıca, uzun süreli PKR aktivasyonu hücre döngüsü tutuklama Çin hamster yumurtalık içinde23hücreleri G2/M aşamasında sonuçlandı. Sonuç olarak, PKR fosforilasyon sırasında M/G1 geçiş21hızlı devre dışı bırakma sağlamak için negatif geribesleme tarafından düzenlenmiştir.
PKR geniş aralığı işlevi rağmen PKR harekete geçirmek anlayışımızı yakalamak ve PKR etkinleştirebilirsiniz dsRNAs tanımlamak için standart yüksek üretilen iş deneysel yaklaşım eksikliği nedeniyle sınırlıdır. PKR iki ters Alu yineler (IRAlus)20,24, ama PKR hücre döngüsü sırasında veya altında etkinleştirebilirsiniz ek hücresel dsRNAs varlığı olasılığını tarafından kurulan dsRNAs ile etkileşim kurabilir önceki çalışmalar göstermiştir insan hücreleri stres koşullarında keşfedilmemiş. RNA-interactors bir RNA bağlayıcı protein (RBP) belirlenmesinde geleneksel yaklaşım UV ışık crosslink RNA-RBP kompleksleri25,26,27için kullanılır. Yeni yapılan bir çalışmada bu UV crosslinking yaklaşım bir fare sisteminde uygulanan ve küçük genelde RNA'ların PKR etkinleştirme sırasında metabolik stres16düzenleyen teşhis etti. Formaldehit verimliliğini yüksek crosslinking kullanarak, biz PKR etkileşim RNA'ların HeLa hücreleri28Hücre döngüsünde sırasında tanımlamak için alternatif bir yöntem sundu. Benzer bir yaklaşım Staufen ve Drosha29,30,31gibi diğer dsRBPs çalışma uygulandı. Bulduğumuz gibi kısa serpiştirilmiş nükleer öğesi (sinüs), uzun Nükleer öğesi (satır), endojen retrovirüsü öğesi (modül) ve hatta Alfa-uydu RNA'ların serpiştirilmiş PKR kodlamayan RNA'ların türleri ile etkileşim kurabilir. Buna ek olarak, biz PKR ağır iplikçik ve ışık arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla hangi formu cins dsRNAs RNA'ların28strand mitokondrial RNA'lar ile (mtRNAs), etkileşim içinde olduğunu gösterdi. Son yayın daha fazla desteklenen bizim veri bazı mtRNAs bir çift yönlü formunda yer alan ve dsRNA sensörleri interferonlar32ikna etmek için Melanom farklılaşma ilişkili protein 5 gibi etkinleştirebilirsiniz. Daha da önemlisi, ifade ve mtRNAs hücre altı yerelleştirme hücre döngüsü sırasında ve tarafından çeşitli stresler, PKR harekete geçirmek28düzenleyen yeteneğini önemli olabilecek modülasyonlu.
Bu makalede, biz son zamanlarda geliştirilen formaldehit crosslinking ve immunoprecipitation (fCLIP) için detaylı bir protokolü mevcut yakalamak ve RNA'ların PKR etkileşim hücre döngüsü sırasında analiz yöntemi. Hücre döngüsü tutuklama örnekleri timidin ve nocodazole kullanarak hazırlamak için yöntemi göstermektedir. Biz o zaman fCLIP işleminin PKR bağımlı RNA'ların ve bu RNA'ları tanımlamak için bir yöntem yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı hazırlamak için izole etmek için mevcut. Ayrıca, biz PKR bağımlı RNA'ların qRT-PCR kullanarak analiz ile ilgili ayrıntılı yordamlar betimlemek. Özellikle, biz mtRNAs strandedness analiz etmek için bir iplikçik özgü ters transkripsiyon yordam mevcut. Açıklanan protokol HeLa hücreleri ve PKR için optimize edilmiştir, ancak hücre döngüsü örnek, fCLIP ve strand özgü qRT-PCR analizleri hazırlanması gibi önemli adımlar kolayca hücresel dsRNAs çalışmaya ya da diğer dsRBPs, RNA interactors belirlemek için değiştirilebilir.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 7,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris, pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>1,7 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>%10 Nonidet-p40 (NP-40)</td><td>Biyoçözelti</td><td>BN015</td><td></td></tr><tr><td>10X DNA yükleme tamponu</td><td>TaKaRa</td><td>9157</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüp</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>3' adaptör</td><td></td><td></td><td>5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3</td></tr> <tr><td>M Sodyum Asetat pH 5.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>5</td>' adaptör <td></td><td></td><td>5'-GUU ÇAĞ AGU UCU ACA GÜÇ CGA CGA UCN NNN-3'</td></tr><tr><td>5 M NaCl</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüp</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Asit-fenol kloroform, pH 4.5</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9722</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td>Manyetik boncuklar DNA / RNA temizleme</td></tr><tr><td>Antarktika alkalin fosfataz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0289S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-DGCR8</td><td></td><td></td><td>Evde üretilmiştir</td></tr><tr><td>Anti-PKR (D7F7)</td><td>Hücre sinyalizasyon teknolojisi</td><td>12297S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PKR (Milli)</td><td>Millipore EMD</td><td>07-151</td><td></td></tr><tr><td>ATP (100 mM)</td><td>GE Healthcare</td><td>GE27-2056-01</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavi sodyum tuzu</td><td>Sigma-aldrich</td><td>B5525</td><td></td></tr><tr><td>Buzağı bağırsak alkalin fosfataz</td><td>TaKaRa</td><td>2250A</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı 25 cm 2 konumlu</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>CMV promotör dizisi</td><td></td><td></td><td>5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3'Dulbecco'nun</td></tr> <tr><td>modifiye kartal ortamı</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>dNTP karışımı (2,5 mM)</td><td>TaKaRa</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Mutlak, ACS Sınıfı</td><td>Alfa-Aesar</td><td>A9951</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Merck</td><td>M-TMS-013-BKR</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Merck</td><td>104008</td><td></td></tr><tr><td>Glisin</td><td>Biyo-bazik</td><td>GB0235</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue kopreçökitan (15 mg / mL)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9516</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Merck</td><td>8.18766.1000</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext rRNA Tükenme Kiti</td><td>New England Biolabs</td><td>E6318</td><td>rRNA Tükenme Kiti</td></tr><tr><td>Nokodazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Normal tavşan IgG</td><td>Hücre sinyal teknolojisi</td><td>2729S</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6148</td><td></td></tr><tr><td>PCR ileri astar (RP1)</td><td></td><td></td><td>5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CG TCC GA-3'</td></tr><tr><td>PCR indeksi ters primer (RPI)</td><td></td><td></td><td>5'-CAA, GCA, GAA, GAA, GGC, GGC, ATA CGA, GAT NNN, NNN, GTG, ACT, GGA, GTT, TGG, CAC, CCG, AGA, ATT, CCA-3'</td></tr>, <tr><td>düz kapaklı PCR tüpleri, 0.2 mL</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat bufered salin (PBS) Tablet</td><td>TaKaRa</td><td>T9181</td><td></td></tr><tr><td>Phusion yüksek kaliteli DNA polimeraz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530</td><td>Yüksek kaliteli polimeraz</td></tr><tr><td>Açılır rotorlu PlateFuge mikrosantrifüj</td><td>Benchmark</td><td>c2000</td><td></td></tr><tr><td>Polinükleotid kinaz (PNK)</td><td>TaKaRa</td><td>2021A</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K, rekombinant, PCR Sınıfı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: CO1 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-GCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer sırası: CO1 Işığı</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR astar sırası: CO2 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: CO2 Işığı</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: CO3 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: CO3 Işığı</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: CYTB Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: CYTB Işık</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: GAPDH</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND1 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND1 Işık</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND4 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR astar dizisi: ND4 Işık</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND5 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND5 Işık</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-TAGGGAGAGCTGGGTTGTT-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND6 Ağır</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>qPCR primer dizisi: ND6 Işık</td><td></td><td></td><td>İleri/Geri: 5&prime;-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3&prime;/5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>Rastgele heksamer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Dnase I (Rnaz içermez) (5 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2270A</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant Rnaz inhibitörü (40 U/&mu; L)</td><td>TaKaRa</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>Ribo-Zero rRNA Çıkarma Kiti</td><td>Illumina</td><td>MRZH116</td><td>rRNA Çıkarma Kiti</td></tr><tr><td>Rotator</td><td>FINEPCR, ROTATOR AG</td><td>D1.5-32</td><td></td></tr><tr><td>RT primer dizisi: CO1 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: CO1 Işık</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar sırası: CO2 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: CO2 Işık</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar sırası: CO3 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: CO3 Işık</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTTTACCACTCCAGCCTAG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: CYTB Heavy</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: CYTB Light</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RT primer dizisi: GAPDH</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar sırası: ND1 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: ND1 Işık</td><td></td><td></td><td>5 & prime; -CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGCCCTG-3 & prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: ND4 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGTGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: ND4 Işık</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTCACCATTCTCAACCC-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar sırası: ND5 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTTTGTTGAGGTGATG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: ND5 Işık</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: ND6 Ağır</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3&prime;</td></tr><tr><td>RT astar dizisi: ND6 Işık</td><td></td><td></td><td>5&prime;-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCC-3&prime;</td></tr><tr><td>Silikonize polipropilen 1.5 mL G-tüp</td><td>Bio Plas</td><td>4167SLS50</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dedesil sülfat</td><td>Biosesang</td><td>S1010</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase In Rnaze inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III ters transkriptaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18080093</td><td>Kütüphane hazırlığı için ters transkriptaz</td></tr><tr><td>SuperScript IV ters transkriptaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>18090010</td><td>qRT-PCR</td></tr><tr><td>SYBR altın nükleik asit gl boyası</td> için ters transkriptaz <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 polinükleotid kinaz</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz 1 (ssRNA Ligaz)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0204</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligaz 2, kesilmiş KQ</td><td>New England Biolabs</td><td>M0373</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf ThermoMixer C, ThermoTop</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Timidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>Tris-borat-EDTA tamponu (TBE)</td><td>TaKara</td><td>T9122</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Ultralink Protein A sefaroz boncuk</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22810</td><td>Protein A boncuk</td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Bioruptor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Biyo-bazik</td><td>UB0148</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>VM-10</td><td></td></tr><tr><td>Ksilen siyanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X4126</td><td></td></tr><tr><td>&gama;-32P-ATP (10 &mu; Ci/&mu; L, 3.3 & mu; M)</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A100UC</td><td></td></tr></tbody></table>

rna interactors protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında rna-harekete geçirmek, eğitim

Studying RNA Interactors of Protein Kinase RNA-Activated during the Mammalian Cell Cycle

Protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek doğuştan gelen bağışıklık yanıtı proteinler üyesidir ve viral RNA'ların çift iplikçikli ikincil yapısını tanır. Viral çift iplikçikli RNA (dsRNAs) bağlandığında, PKR dimerization ve sonraki autophosphorylation uğrar. Fosforile PKR (pPKR) aktif hale gelir ve fosforilasyon bir alfa alt birimi ökaryotik başlama Factor global çeviri bastırmak için 2 (eIF2α) neden olmaktadır. Kanıt artan PKR hücre döngüsü sırasında gibi fizyolojik koşullar altında veya enfeksiyonu olmadan çeşitli stres koşullarında etkinleştirilebilir öneriyor. Ancak, PKR RNA aktivatörler anlayışımızı yakalamak ve PKR etkileşim dsRNAs analiz için standart bir deneysel yöntem eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Burada, bir deneysel mevcut özellikle zenginleştirmek ve PKR çözümlemek için iletişim kuralı bağlı RNA'ların HeLa hücreleri kullanarak hücre döngüsü sırasında. Biz verimli crosslinking etkinlik formaldehit PKR-RNA kompleksleri düzeltmek ve onları immunoprecipitation yolu ile izole etmek için kullanmaktadır. PKR co-immunoprecipitated RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama kitaplığı oluşturmak için işlenebilir. Bir büyük PKR etkileşim hücresel dsRNAs (mtRNAs), hangi cins dsRNAs ağır iplikçik ve ışık iplikçikli RNA'ların arasında tamamlayıcı etkileşimi aracılığıyla olarak bulunabilir mitokondrial RNA'lar sınıfıdır. Bu çift yönlü mtRNAs strandedness çalışmaya da strand özgü qRT-PCR için bir iletişim kuralı mevcut. Bizim iletişim kuralı PKR bağımlı RNA'ların analizi için optimize edilmiştir, ama hücresel dsRNAs veya RNA-interactors diğer dsRNA bağlayıcı proteinlerin eğitimi için kolayca değiştirilebilir.

Hücre döngüsü S veya M aşamasında HeLa hücreleri tutuklamaya işleminin şematik Resim 1' de gösterilen. M faz tutuklandı bir örnek, açıkça (şekil 2A) mikroskop altında yuvarlak şekilli hücreler görselleştirebilirsiniz. Hücre döngüsü tutuklama verimliliğini incelemeye, nükleer hücre içeriğini FACS (şekil 2B) kullanılarak analiz edilebilir. Şekil 3 D7F7 antikor immunoprecipitate PKR üstün yeteneği gösterir nerede immunopreci...

Memeli hücre HeLa hücreleri kullanarak döngüsü sırasında eğitim RNA-interactors için çift iplikçikli RNA bağlayıcı protein kinaz (PKR) RNA-harekete geçirmek ve deneysel yaklaşımlar mevcut. Formaldehit crosslink RNA-PKR kompleksleri ve immunoprecipitation PKR bağımlı RNA'ların zenginleştirmek için bu yöntemi kullanır. Bu RNA'ların daha da yüksek üretilen iş sıralama veya qRT-PCR ile çözümlenebilir.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Protein kinase RNA-activated (PKR) is a member of the innate immune response proteins and recognizes the double-stranded secondary structure of viral ...

Bu protokol, rna bağlayıcı protein PKR'nin RNA interaktörlerini genom çapında bir şekilde tanımlamak için bir yöntem sağlar. RNA bağlayıcı protein tarafından gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesini daha iyi anlamamıza yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, RNA bağlayıcı proteinlere bağlı RNase'yi onarmak ve immünopresipitasyon yoluyla zenginleştirmek için formaldehitin verimli çapraz bağlanmasını kullanmastır.Parkinson ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalığı olan hastalarda aktive PKR gözlenir. PKR-etkileşen çift iplikçikli RNase'nin tanımlanması bu dejeneratif hastalıkların patogenezini daha iyi anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu yöntem, herhangi bir RNA bağlayıcı proteinlerin RNA interactors çalışma için kullanılabilir.Özellikle, bu yöntemin yapılandırılmış RNase tanıyan proteinleri incelemek için yararlı olduğuna inanıyoruz, örneğin çift iplikli RNase gibi. Hücreleri toplamadan önce döngüden tutuklanan numunenin homojenliğini kontrol edin. Buna ek olarak, mevcut en iyi antikor kullanarak immünopresid verimliliğini optimize etmek için önemlidir.Başlangıç olarak, sırasıyla S-veya M fazı tutuklanan numuneler için 750, 000 veya bir milyon HeLa hücresi tohum. Hücreleri 37 derecede ve %5 karbondioksitle 24 saat boyunca büyütün. Hücreleri iki milimolar timidin ile tedavi edin ve 18 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Sonra, taze medya ekleyin ve dokuz saat boyunca 37 santigrat derecede kuluçka. S-faz-arrested hücreleri için, iki milimolar timinin ile hücreleri tedavi.M-faz-arrested hücreleri için, nocodazol mililitre başına 100 nanogram ile hücreleri tedavi. 15 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yat. Bir S-faz örneği için, bir hücre kazıyıcı ile hücreleri toplamak ve 15 mililitrelik konik tüp içine aktarın.M fazlı bir örnek için, M fazı tutuklanan hücreleri ayırmak ve bunları 15 mililitrelik konik tüpe aktarmak için hücre kültür çanağının yan tarafına dokunun. Daha sonra, üç dakika oda sıcaklığında 380 g hücreleri santrifüj. Supernatant çıkarın ve soğuk PBS bir mililitre ile hücreleri yeniden askıya.Hücreleri 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri 10, 000 g'da 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve süpernatantları tamamen çıkarın. Formaldehit crosslinking gerçekleştirmek için, ilk hücrelere% 0.1 paraformaldehit 750 mikrolitre ekleyin ve hücreleri düzeltmek için 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka.Daha sonra, tek azılı glisin 250 mikrolitre ekleyin ve reaksiyonu bastırmak için ek bir 10 dakika oda sıcaklığında kuluçka. Hücreleri 10,000 g'da 4 derece santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin. Supernatants'ı tamamen çıkarın.Sonra, bir mililitre PBS ile askıya alın. Hücreleri 10,000 g'de 4 santigrat derecede 30 saniye santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. FCLIP lysis tampon 400 mikrolitre ile resuspend 0.2 hacimli proteaz inhibitörü ve iki hacimli RNase inhibitörü ile desteklenir.10 dakika boyunca buz üzerinde kuluçka ve ultrasonicator kullanarak sonicate. Daha sonra, sodyum klorür konsantrasyonu ayarlamak için beş molar sodyum klorür 11 mikrolitre ekleyin 150 milimolar, ve girdap kısaca. Sonra, santrifüj 21, 130 g dört derece santigrat 15 dakika.Supernatants önceden soğutulmuş 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüp aktarın. İmmünopits gerçekleştirmek için, ilk 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine protein A boncuk 20 mikrolitre ekleyin. Daha sonra boncukları 400 mikrolitre fCLIP lysis tamponu ile yıkayın.Boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Daha sonra, supernatant çıkarın, fCLIP lysis tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, supernatants tamamen çıkarın. FCLIP lysis tampon 300 mikrolitre boncuk resuspend. Sodyum klorür konsantrasyonu 150 milimolar ayarlamak için beş molar sodyum klorür 8.3 mikrolitre ekleyin.Protein kinaz RNA-aktive antikor 10 mikrolitre ekleyin ve üç saat boyunca dört derece santigrat bir rotator üzerinde kuluçka. Sonra, boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın, fCLIP yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya.Yıkama adımını iki kez tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, supernatants tamamen çıkarın. Daha sonra, 300 mikrolitre lysate ekleyin ve üç saat boyunca bir rotator üzerinde dört santigrat derecede kuluçka.Sonra, boncukları 1,000 g'de 4 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin. Supernatant çıkarın, fCLIP yıkama tampon 400 mikrolitre ekleyin ve yavaşça üç ila dört kez ters çevirerek boncuk ları yeniden askıya. Yıkama adımını üç kez tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, supernatant tamamen çıkarın. Ardından, 300 mikrolitre fCLIP elüsyon arabelleği ekleyin. Boncuklardan aktive protein kinaz RNA'yı eleştirmek için 25 derecede 25 santigrat derecede kuluçkaya yatın.Oda sıcaklığında 1,000 g'da santrifüj edin ve süpernatantları temiz silikonlu bir tüpe aktarın. Son olarak, Proteinaz K 300 mikrolitre ekleyin ve 65 santigrat derece gecede kuluçka. S veya M fazındaki HeLa hücrelerinin hücre döngüsü ndeki arrestinin etkinliği FACS kullanılarak incelendi.D7F7 antikor immün çökelti protein kinaz RNA aktive üstün bir yetenek gösterdi. PKR immünopresör veya total HeLa lysate batı leke analizi PKR büyüklüğüne karşılık gelen sadece bir güçlü bant gösterdi, D7F7 antikor PKR tanımada son derece spesifik olduğunu gösteren. Farklı immün çökeltme verimliliği ile farklı PKR antikorları kullanarak, harita sıralama okuma farklı bir sınıf dağılımı ile sonuçlandı.Başarılı rRNA çıkarılması sırasında PKR co-immünoppititated RNase için radyoizotop sinyalinde azalma gözlendi. PKR co-immünopprepititated RNA örneği, negatif kontrollere göre mitokondriyal RNase güçlü zenginleştirme gösterdi. İplik spesifik ters transkripsiyon, S veya M fazı tutuklanan hücreler için PKR ile birlikte immünoppresipitated olan ağır ve hafif iplikçik mitokondriyal RNase ayırt etmek için kullanılmıştır.Hücre döngüsü tutuklama örneğinin hazırlanmasında en kritik adım, hücreleri PBS ile iki kez yıkamanız gereken ve homojenlik için sadece hücre pastel toplamanız gereken veya numunenin bozulduğu yerdir. Etik süreç için, en kritik adımlar formaldehit crosslinking ve miktar vardır. Bu işlemden sonra eluted RNA'lar kuzey blotlama, qRT PCR veya yüksek iş elde ekincing kullanılarak analiz edilebilir.Bu denemeler, PKR'ye bağlı RNase'nin türünü ve göreli miktarını belirleyebilir. Bu teknik, RNA bağlayıcı proteinlerin transkripsiyonel regülasyonu hakkındaki anlayışımızı geliştirecek olan RNA bağlayıcı proteinlerin RNA interaktörlerini incelemek ve tanımlamak için uygulanabilir. Formaldehit tehlikelidir, bu nedenle fiksasyon, çözelti ve ilk yıkama tamponunun dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.

studying-rna-interactors-protein-kinase-rna-activated-during

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

, Hücrelerden oluşan bir nüfus hücre döngüsü konumunun belirlenmesi, ya da sinyalleri çoğalması nasıl etkilediğini anlamak, bu protokolü kullanarak flow sitometri ile kolayca ölçülebilir. Biz hücreleri boyama ve hücre döngüsü konumlarını miktarının belirlenmesi için basit bir deneysel yaklaşım raporu.

Memeli Hücreler, Hücre Döngüsü Pozisyon Analizi

Bu el yazması, ökaryotik hücrelerde oluşan seçilmiş akraba RNP'leri spesifik bir oligonükleotid yönelimli zenginleştirme yoluyla izole etmek için bir yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşımın uygulanabilirliğini, DHX9/RNA helikaz A'dan oluşan retroviral 5' çevrilmemiş bölgeye bağlı bir akraba RNP'yi izole ederek gösteriyoruz.

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

RNA-protein etkileşimleri birçok hücresel sürecin merkezinde yer alır. Burada, spesifik RNA'yı izole etmek ve onunla ilişkili yeni proteinleri tanımlamak için in vivo bir yöntemi açıklıyoruz. Bu, RNA'ların hücrede nasıl düzenlendiğine yeni bir ışık tutabilir.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

Hücre döngüsünün belirli evreleriyle ilgili olayları incelemek için bir bağlam sağlayan iki hücre senkronizasyon protokolünü bildiriyoruz. Bu yaklaşımın, pertürbüssüz bir hücre döngüsünde spesifik genlerin düzenlenişini analiz etmek için veya hücre döngüsünü etkileyen maddelere maruz kaldığında yararlı olduğunu göstermektedir.

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Biz bir protokol yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu kullanılarak analiz tarafından takip HeLa hücreleri Çift Kişilik timidin eşitlenmesi için mevcut. Bu yöntem de interfaz işlevleri sahip çok fonksiyonlu proteinlerin Mitotik rolleri üzerinde çalışmalar etkinleştirme mitoz, zaman uyumlu olarak S faz geçin hücreleri çok sayıda elde anahtarıdır.

Mitotik hücre eşitleme ve yüksek çözünürlüklü Confocal mikroskobu mitoz sırasında çok fonksiyonlu hücre döngüsü proteinlerin rolü çalışmaya birleştirme

Siklin bağımlı kinaz 1 (Cdk1) hücre döngüsünün G2 aşamasında aktif ve birçok hücresel yolları düzenler. Burada, bir vitro kinaz tahlil için bir protokol ile bu önemli kinaz hücresel hedefleri oluşturmak üzere Cdk1 özgü fosforilasyon siteler tanımlaması sağlar Cdk1 mevcut.

Siklin bağımlı kinaz 1 tanımlaması belirli fosforilasyon siteleri bir Vitro kinaz tarafından tahlil

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

Bu protokol, küçük DNA ve RNA yüzeyleri üzerinde polinükleotid kinazların (PNKs) kinaz aktivitesini ölçmek için radyoaktif olmayan bir testi tanımlar.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Öğrenin, PKR proteininin RNA etkileşimcilerini genom çapında belirlemek için formaldehit çapraz bağlama ve immünopresipitasyon yöntemini. Bu teknik, gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesini ve nörodejeneratif hastalıkların patogenezini anlamaya yardımcı olur.

RNA Interactors Protein kinaz memeli hücre döngüsü sırasında RNA-harekete geçirmek, eğitim

Daha fazla video keşfet