Name: Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'da dopamin sinyalini değerlendirmek için Yüzme Felç (SWIP) davranışsal testini. Bu yöntem, dopaminerjik sinapsla ilgili genleri hızla tanımlamaya ve davranış üzerindeki etkileri incelemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Dr Osama Refai Dr Randy Blakely'nın Lab SWIP otomatik analizi ile rehberlik için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser NIH R01 DA042156 LC için fon tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlık çözümler ve medya
<ol><li>KH2PO4 3.0 g (22,05 mM), Na2HPO4 6.0 g (42,2 mM), çözülerek M9 arabellek hazırlamak ve NaCl 5.0 g (85.5 mM) autoclaved deiyonize su 1 litre. 1 M MgSO4 (100 mL autoclaved deiyonize su son hacmi 12 g) 1.0 mL ısıyla sonra ekleyin. Elde edilen 10 x Mix 100 mL su 1 x çözüm yapmak M9 ile autoclaved 900 mL deiyonize.</li>
	<li>Yumurta tampon yapmak, HEPES autoclaved deiyonize su 1 litre, 6.896 g NaCl (118 mM), KCl (48 mM), CaCl2-2 H2O (2 mM), MgCl2-6 H2O (2 mM) 0.406 g 0,294 g 3.578 g ve 5.958 g (25 mM) geçiyoruz. PH NaOH kullanarak 7,3 için ayarlayın.</li>
	<li>Taze sodyum hipoklorit/NaOH çözüm 1 mL % 5-6 sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) ve 10 N NaOH 180 µL 3.8 mL deiyonize su ekleyerek hazırlayın.</li>
	<li>60 g Sükroz tartmak ve autoclaved deiyonize su 100 mL % 60 Sükroz çözüm yapmak için son bir birime dağıtılması.</li>
	<li>0,684 g autoclaved deiyonize su 200 mM Sükroz yapmak 10 ml sukroz geçiyoruz. Kontrol edin ve sizin için osmometer kullanarak bir Osmolarite ayarlayın. 1 mL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler yapmak ve -20 ° C'de dondurmak</li>
	<li>AMPH (Moleküler ağırlığı 184.75 g/mol) 0,184 g tartmak ve 10 mL deiyonize su 100 mM hisse senedi çözüm yapmak geçiyoruz. 0,5 mM çalışma çözüm yapmak için su 400 µL hisse senedi çözüm mix 2 µL.</li>
	<li>
Besin büyüme medya (NGM) tabak hazırlamak
	<ol>
<li>Mix 3 gr NaCl (52.65 mM), pepton, 25 g bacto-agar ve 975 mL deiyonize suyla bir 2 L Erlenmeyer şişesi 20 g. Bir manyetik heyecan bar ve otoklav (121 ° C, 15 PSI) sıvı döngüsü kullanılarak 1 saattir bulunmaktadır.</li>
		<li>Serin ve karıştırma sırasında bir ısıtıcı şişeye koyarak yaklaşık 50 ° C sıcaklıkta korumak. Kolesterol (5 mg/mL etanol), 0,5 mL 1 mL 1 M MgSO4, 1 mL 1 M CaCl2 ve 1 M potasyum fosfat tampon, pH 7,4 (KH2PO4108.3 g, K2HPO4 35,6 g 25 mL ekleyin deiyonize su için 1 L).</li>
		<li>25 mL 100 mm x 15 mm Petri kalıplara pipet ve kuvvetlendirmek ortam sağlar. Baş aşağı 4 ° C'de plakaları 4 hafta için bir kutu içinde saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysogeny suyu (LB) suyu hazırlanması
	<ol>
<li>Bir Erlenmeyer flask deiyonize suyla 200 ml LB toz karışımı 5 g geçiyoruz. Otoklav 30 dakika kullanan sıvı sterilizasyon döngüsü. Suyu soğumasını sağlar. Oda sıcaklığında 1-2 hafta için saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
NA22 bakteriyel plakaları hazırlanması
	<ol>
<li>Steril pipet ucu veya steril bir bakteriyel döngü NA22 E. coli bakteri küçük bir hacim ile bir LB plaka gliserol stoktan çizgi ve plaka baş aşağı 37 ° C kuluçka makinesine gecede izole kolonileri büyümeye kuluçkaya için kullanın. Pick ve 1.8 adımda hazırlanan LB suyu 200 mL içine bir koloni tanıtmak ve gecede 37 ° C'de titreyen bir platform üzerinde büyümeye izin.</li>
		<li>Tabakları temel için 1.7. adımda hazırlanan ve steril cam Hokey sopası ile yayıldı NGM plakalar üzerine bakteriyel kültürünün 200 µL dağıtmak. Gece veya daha uzun bir başlık altında kuru ve baş aşağı 4 ° C'de bir hava geçirmez kutusunda saklamak plakaları izin</li>
	</ol>
</li>
	<li>Solucanlar almaya kirpik/Platin araç yapmak için bir kalın kirpik veya Platin filaman Pasteur pipet süper yapıştırıcı kullanarak bir cam içine yapıştırın. Kirpik ucu bir jilet kullanarak bir açıyla kesilmiş. Alternatif olarak, Bunsen burner Platin filaman çevresinde cam pipet ucu eritmek için kullanılabilir.</li>
</ol>2. C. elegans yetiştiriciliği
Not: Kültür vahşi tipli N2C. elegans Escherichia coli NA22 plakaları üzerinde yük. Detaylı kültür yöntemleri aşağıda açıklanmıştır.
<ol><li>
Solucan kültür hazırlanması
	<ol>
<li>Starter kültür Worms yapmak için iyi beslenmiş hayvanlar içeren bir plaka agar küçük bir parça kesti ve steril bir spatula kullanarak 1.9 adımda hazırlanan NA22 E. coli bakteri plaka üzerine aktarın. Tabak 20 ° C'de 3-4 gün kuluçkaya. Stereo mikroskop altında görsel olarak gravid yetişkin varlığını doğrulamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Worms eşitlenmiş nüfus hazırlanması
	<ol>
<li>Gravid yetişkin autoclaved deiyonize suyla arası tüm fışkırmak şişe kullanarak plaka dağıtımı tarafından en az 2 tabak toplamak. Yavaşça solucan çıkarmak ve solucanlar bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bir 15 mL polistren konik tüp toplamak için plaka girdap.</li>
		<li>Spin aşağı vasıl 140 x g solucanlar cips, sonra bir vakum pompası süpernatant kullanarak Aspire edin 2 dk santrifüj tüpü veya laboratuvar vakum inşa.</li>
		<li>Adım iki veya daha fazla kez solucanlar (su zaman karışık net görünür bakterilerden berraklaşana kadar resuspend ve autoclaved deiyonize su ve karışımı ve 2 dakika süreyle 140 x g , santrifüj tüpü doldurarak solucanlar süpernatant Aspire edin ve bu son tekrar yıkama Kurtlarla).</li>
		<li>5 mL taze yapılmış sodyum hipoklorit/NaOH çözeltisi (Adım 1.3) solucan Pelet ve bir girdap kullanarak hızla karıştırın. Bir rocker için yaklaşık 4-8 dk metroyla kuluçkaya. Sodyum hipoklorit/NaOH çözüm ile kuluçka süresi 4-8 hisse senedi sodyum hipoklorit çözüm (çamaşır suyu) kalitesinebakarak dakika arasında değişir.</li>
		<li>Bir damla (2-50 µL) cam mikroskop Slayt üzerindeki solucan içeren çözüm koymak ve her 2 dk solucan lizis için mikroskop altında kontrol edin. Solucanların % 70'i lysed ve yumurta serbest bırakılır, dolgu ile yumurta tampon tüp 1.2 adımda hazırlanan ve hemen 140 x g embriyo cips ve leşleri solucan için de 1 dk santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin ve Pelet 3 tüp her zaman yumurta arabellek ile doldurarak daha fazla kere yıkayın. Spin aşağı vasıl 140 x g 1 dk. için ve süpernatant her zaman kaldırmak. Pelet yıkar sonunda beyaza döner.</li>
		<li>Son yıkama sonra embriyo % 30 Sükroz çözümde ölü leşleri ayırmak. Pelet için 5 mL autoclaved deiyonize su ekleyin, resuspend ve 5 mL % 60 Sükroz 1.4 adımda hazırlanan de ekleyin. İyice karıştırın ve 160 x g 6 dk, santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Bir cam Pasteur pipet üst Menisküs taze 15 mL konik tüp içine yüzen embriyo aktarmak için kullanın. 3-4 mL den fazla almayın. Kalan herhangi bir Sükroz kaldırmak için embriyo yıkama 3 kez 140 x g 3 dk de centrifuging tarafından autoclaved su ile süpernatant kaldırma ve Pelet resuspending (ve tüp doldurma) her zaman.</li>
		<li>Yıkama 1 x M9 arabellek ile yineleyin. Son yıkama sonra Pelet M9 10 mL resuspend. Tüpler L1 larvalar yumurtadan yumurta üzerinde bir shaker gecede (en fazla 14 h) bırakın. Solucanlar gıda yetersizliği L1 larva aşamasında kalacaktır.</li>
		<li>140 x g 2 dakika süreyle de centrifuging tarafından larva tarafından yayımlanan herhangi bir feromonlar kaldırmak için 3 kez autoclaved su ile yıkama L1 larva larvalar 1 mL su Resuspend. 1:10 yapmak seyreltme solucanların su, cam slayt üzerindeki bir 10 µL damla pipette, bir coverslip giy ve solucanlar bir stereoscope altında saymak. Bunu iki kez tekrarlayın ve sonuçları ortalama.</li>
		<li>Pipet (yani daha önce oda sıcaklığına kadar getirildi) bir NA22 plaka üzerine yaklaşık 1000 solucanlar küçük yerleştirerek karşılık gelen solucan hacmi plaka üzerinde bırakır. Damla kurur kadar plaka yarı-açık bırakın. Sonra plaka kapak ve baş aşağı 20 ° C kuluçka yaklaşık 44-48 h veya solucanlar bir stereomicroscope altında görsel olarak teyit olarak geç L4 sahne ulaşmak kadar kuluçkaya. Solucanlar SWIP için test edilmesi hazırsınız.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. SWIP
Not: Biz vahşi tipi solucan AMPH ile tedavi SWIP değerlendirilmesi elle yapılan yöntem açıklanmaktadır. Biz de kısaca solucanlar izleme ve solucan Kinetik bir otomatik solucan izci ve Hardaway vd.10tarafından daha önce tarif edildi bir izleme yazılımı kullanarak daha iyi inceleyebilmemiz tartışıyorlar.
<ol><li>
SWIP için test etmek için elle yapılan yöntem
	<ol>
<li>Aliquot 40 µL 200 mOsm/L Sükroz çözüm ile veya olmadan bir cam spot levha içine 0,5 mM AMPH. Stereoscope altında bir kirpik ya da Platin ile 8-10 L4 geç sahne solucanlar pick pick ve solucanlar çekme taşımak ve çözüm içine yüzmek kadar solüsyon içeren plaka çekmede daldırın. Kuyunun içine aldı solucanlar sayısını not edin, sayacı başlatmak, gözlemlemek ve SWIP her dakika işareti olarak sergilenmesi solucanlar kaydedin.</li>
		<li>Ham verileri bir elektronik tabloya kopyalayıp her dakikada felç solucanlar solucan tahlil test toplam sayısı tarafından sayısı bölerek felç solucanlar yüzdesini hesaplamak ve 100 ile çarpmak. Herhangi bir grafik içine yüzde değerleri kopyalamak ve istatistiksel yazılım ve arsa Y ekseni üzerindeki yüzde değerler ve zamanında X ekseni XY grafiğini kullanarak verileri biçimlendirebilir.</li>
		<li>Denetim, AMPH grupları ve zaman tedavi arasında istatistiksel anlamlılık için test etmek için Post-hoc analizi (örneğin, Bonferroni sonrası test) tarafından takip iki yönlü ANOVA gerçekleştirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SWIP otomatik analizi
	<ol>
<li>Bir kerede tek bir solucan otomatik çözümlemesi. İletişim kuralı ayarlamak için kamera yukarıya belgili tanımlık solucan tracker yazılım ve izleme yazılımı çalıştırmak için komut dosyası analiz Hardaway vd.16ayrıntılı olarak açıklanmıştır.</li>
		<li>Kısaca, bir tek geç L4 sahne hermafrodit kirpik kıracağı elle yapılan yöntem 3.1.2 bölümünde açıklandığı gibi kullanan bir cam spot tabak yerleştirin. O zaman bir solucan Yüzme videoları kaydedin ve solucan tracker yazılım vücut kıvrımları frekansını hesaplamak için kullanın.</li>
		<li>Solucan dayak frekans elde etmek için izleme yazılımı ile birlikte sağlanan komut dosyasını izleyin ve ısı üretmek için solucan dayak verilerden eşler.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>de Bono, M., Villu Maricq, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Substrates+of+Complex+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal Substrates of Complex Behaviors in C. elegans.</a> Annual Review of Neuroscience. 28 (1), 451-501 (2005).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+Locomotory+Rate+Is+Modulated+by+the+Environment+through+a+Dopaminergic+Pathway+and+by+Experience+through+a+Serotonergic+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans Locomotory Rate Is Modulated by the Environment through a Dopaminergic Pathway and by Experience through a Serotonergic Pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>McDonald, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vigorous+Motor+Activity+in+Caenorhabditis+elegans+Requires+Efficient+Clearance+of+Dopamine+Mediated+by+Synaptic+Localization+of+the+Dopamine+Transporter+DAT-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Vigorous Motor Activity in Caenorhabditis elegans Requires Efficient Clearance of Dopamine Mediated by Synaptic Localization of the Dopamine Transporter DAT-1.</a> Journal of Neuroscience. 27 (51), 14216-14227 (2007).</li>
<li>Carvelli, L., Blakely, R. D., DeFelice, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+Transporter%2FSyntaxin+1A+Interactions+Regulate+Transporter+Channel+Activity+and+Dopaminergic+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dopamine Transporter/Syntaxin 1A Interactions Regulate Transporter Channel Activity and Dopaminergic Synaptic Transmission.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 14192(2008).</li>
<li>Carvelli, L., Matthies, D. S., Galli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+amphetamine+actions+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of amphetamine actions in Caenorhabditis elegans.</a> Molecular Pharmacology. 78 (1), 151-156 (2010).</li>
<li>Refai, O., Blakely, R. D. Blockade and reversal of swimming-induced paralysis in C. elegans by the antipsychotic and D2-type dopamine receptor antagonist azaperone. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRefai%2C+O+%22Neurochemistry+International%22">Neurochemistry International</a>. , (2018).</li>
<li>Bermingham, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Atypical+MAP+Kinase+SWIP-13%2FERK8+Regulates+Dopamine+Transporters+through+a+Rho-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The Atypical MAP Kinase SWIP-13/ERK8 Regulates Dopamine Transporters through a Rho-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 37 (38), 9288-9304 (2017).</li>
<li>Nass, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+in+Caenorhabditis+elegans+for+dopamine+neuron+insensitivity+to+6-hydroxydopamine+identifies+dopamine+transporter+mutants+impacting+transporter+biosynthesis+and+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">A genetic screen in Caenorhabditis elegans for dopamine neuron insensitivity to 6-hydroxydopamine identifies dopamine transporter mutants impacting transporter biosynthesis and trafficking.</a> Journal of Neurochemistry. 94 (3), 774-785 (2005).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+genetic+analysis+to+identify+determinants+of+dopamine+signaling+in+Caenorhabditis+elegans+using+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Forward genetic analysis to identify determinants of dopamine signaling in Caenorhabditis elegans using swimming-induced paralysis.</a> G3. 2 (8), Bethesda, Md. 961-975 (2012).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+Expression+of+the+Caenorhabditis+elegans+Gene+swip-10+Supports+Glutamate+Dependent+Control+of+Extrasynaptic+Dopamine+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial Expression of the Caenorhabditis elegans Gene swip-10 Supports Glutamate Dependent Control of Extrasynaptic Dopamine Signaling.</a> Journal of Neuroscience. 35 (25), 9409-9423 (2015).</li>
<li>Felton, C. M., Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+signaling+in+C.+elegans+is+mediated+in+part+by+HLH-17-dependent+regulation+of+extracellular+dopamine+levels%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Dopamine signaling in C. elegans is mediated in part by HLH-17-dependent regulation of extracellular dopamine levels.</a> G3. 4 (6), Bethesda, Md. 1081-1089 (2014).</li>
<li>Lanzo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+of+Syntaxin+1A+in+the+Dopaminergic+Neurons+Decreases+the+Activity+of+the+Dopamine+Transporter+and+Prevents+Amphetamine-Induced+Behaviors+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Silencing of Syntaxin 1A in the Dopaminergic Neurons Decreases the Activity of the Dopamine Transporter and Prevents Amphetamine-Induced Behaviors in C. elegans.</a> Frontiers in Physiology. 9 (576), (2018).</li>
<li>Safratowich, B. D., Lor, C., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+an+amine-gated+chloride+channel+to+generate+behavioral+effects+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates an amine-gated chloride channel to generate behavioral effects in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (30), 21630-21637 (2013).</li>
<li>Safratowich, B. D., Hossain, M., Bianchi, L., Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+Potentiates+the+Effects+of+-Phenylethylamine+through+Activation+of+an+Amine-Gated+Chloride+Channel%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Amphetamine Potentiates the Effects of -Phenylethylamine through Activation of an Amine-Gated Chloride Channel.</a> Journal of Neuroscience. 34 (13), 4686-4691 (2014).</li>
<li>Carvelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphetamine+activates+%2F+potentiates+a+ligand-gated+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Amphetamine activates / potentiates a ligand-gated ion channel.</a> Channels (Austin). 8 (4), 294-295 (2014).</li>
<li>Hardaway, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.An+open-source+analytical+platform+for+analysis+of+C.+elegans+swimming-induced+paralysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">et al.An open-source analytical platform for analysis of C. elegans swimming-induced paralysis.</a> Journal of Neuroscience Methods. 232, 58-62 (2014).</li>
<li>Lüersen, K., Faust, U., Gottschling, D. -C., Döring, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gait-specific+adaptation+of+locomotor+activity+in+response+to+dietary+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Gait-specific adaptation of locomotor activity in response to dietary restriction in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Experimental Biology. 217, Pt 14 2480-2488 (2014).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> Journal of Visualized Experiments. (64), e4019(2012).</li>
<li>Lamitina, S. T., Morrison, R., Moeckel, G. W., Strange, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.+to+extreme+osmotic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Adaptation of the nematode Caenorhabditis elegans. to extreme osmotic stress.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 286 (4), 785-791 (2004).</li>
<li>Masoudi, N., Ibanez-Cruceyra, P., Offenburger, S. -L., Holmes, A., Gartner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraspanin+%28TSP-17%29+Protects+Dopaminergic+Neurons+against+6-OHDA-Induced+Neurodegeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Tetraspanin (TSP-17) Protects Dopaminergic Neurons against 6-OHDA-Induced Neurodegeneration in C. elegans.</a> PLoS Genetics. 10 (12), 1004767(2014).</li>
<li>Jayanthi, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gene+T23G5.5+encodes+an+antidepressant-+and+cocaine-sensitive+dopamine+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gene T23G5.5 encodes an antidepressant- and cocaine-sensitive dopamine transporter.</a> Molecular Pharmacology. 54 (4), 601-609 (1998).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, bir davranış yöntemi, SWIP, C. elegansiçinde gerçekleştirmek için adım adım bir protokol açıklayın. Bu iletişim kuralı bu tahlil çok kullanıcı dostu yapmak hiçbir büyük teknik engel ile basit ve anlaşılır. Yine de, etkili bir şekilde tahlil gerçekleştirmek için dikkat edilmesi gereken bazı önemli yönleri vardır.
Diyet kısıtlama SWIP17etkiler bu yana tahlil için kullanılan solucanlar iyi beslenmiş olması için özen gösterilmelidir. İyi zamanlanmış sodyum ...

Hayvanlar farklı nörotransmitter karmaşık sinyalleşme işlemler tarafından koordine tarafından aracılı doğuştan gelen ve karmaşık davranışlar çeşitli gerçekleştirmek. Nörotransmitter dopamin (DA) son derece korunmuş davranışlar öğrenme, motor işlevleri ve ödül işleme gibi türler arasında aracılık eder.
Toprak Yuvarlak solucanlar C. elegans, nispeten basit ve de eşlenen sinir sadece 302 nöronlar oluşan sistemi ile belirgin karmaşık davranışları DA çiftleşme, öğrenme, yiyecek arama, hareket ve yumurta atma gibi düzenlenir da dahil olmak üzere, gösterir 1. diğer özellikleri arasında kısa yaşam döngüsü, kullanım kolaylığı ve moleküller sinyal koruma, C. elegans korunmuş davranışları nöral temeli eğitimi için bir model olarak kullanmanın yararları vurgulayın.
C. elegans hermafrodit sekiz dopaminerjik nöron içerir; Bunlara ek olarak, altı ilave çiftlerini amaçlar çiftleşme için erkek içerir. Memeliler, olduğu gibi bu nöronlar DA sentez ve DA ışınlama (DAT-1), hangi DA sinaptik yarık geri dopaminerjik nöron serbest nakliye sadece dopaminerjik nöronlarda bulunan bir membran protein ifade eder. Ayrıca, çoğu protein sentezi, paketleme ve serbest bırakmak-in DA her adımda dahil solucanlar ve insanlar arasında son derece korunmuş ve gibi memelilerde DA beslenme davranışları ve hareket C. elegans2modüle.
C. elegans düz yüzeylerde tarar ve karakteristik dayak davranış suda yüzüyor. İlginçtir, DAT-1 (dat-1) ifadesi eksik mutantlar normalde katı yüzey üzerinde tarama ama suya dalmış zaman Yüzme ayakta tutmak başarısız. Bu davranış indüklenen Yüzme felç veya SWIP olarak adlandırdığı oldu. Önceki deneyler SWIP, kısmen DA sonuçta D2-benzeri postsinaptik reseptörler (DOP-3) overstimulates sinaptik yarık içinde aşırı kaynaklanır gösterdi. Her ne kadar başlangıçta dat-1 nakavt hayvanlar3' te tanımlanan, SWIP da o blok faaliyet DAT (örneğin, imipramine4) ilaçlar ile tedavi vahşi-türü hayvanlarda gözlenen ve/veya DA yayın (örneğin, amfetamin5) ikna etmek. Öte yandan, sentez ve serbest bırakmak-in DA önlenmesi ve engelleme DOP-3 reseptör fonksiyonu farmakolojik veya genetik manipülasyon SWIP6önlemek. Birlikte ele alındığında, bu zaten yayımlanmış veri SWIP mutasyona uğramış proteinlerin dopaminerjik sinapslarda3,4,7 içinde neden davranışsal etkileri çalışmaya ve için istihdam için güvenilir bir araç olarak kurduk kimliği roman yasal yolları7,8,9,10,11,12sinyal DA dahil ileri genetik ekranlar. Buna ek olarak, uyuşturucu kaynaklı davranış yaşayan hayvanlarda kolayca ölçülebilir bir okuma sağlayarak, SWIP mekanizmaları eylem amfetamin (AMPH) gibi ilaçlar aydınlatma sağlar ve azaperone dopaminerjik,5, synapses 6 , 13 , 14 , 15.
SWIP deneyleri yerine getirmek için kullanılan protokolleri16daha önce anlatmıştık. Metodoloji ve etkili bir şekilde SWIP gerçekleştirmek C. elegans toplum için görsel bir kılavuz sağlamak amacı ile tahlil yapmak için Kur'u burada, biz ayrıntılı olarak tarif.

<table><tbody><tr><td>Alüminyum folyo</td><td>Reynolds wrap</td><td>1091835</td><td></td></tr><tr><td>Amfetamin</td><td>Sigma</td><td>51-63-8&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Otoklav</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyel İnkübatör</td><td>New Brunswick scientific</td><td>M1352-0000</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik sınıf, Agar</td><td>Lab Scientific, Inc</td><td>&nbsp; A466</td><td></td></tr><tr><td>Bacto (TM) Pepton</td><td>BD</td><td>REF 211677</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür (dihidrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>Kamera&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf 5810R 15amp</td><td>E215059</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-88-5</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su</td><td>Millipore Z00QSV0WW Milli-Q</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Depresyon cam spot plakası</td><td>Corning</td><td>Corning, Inc. 722085</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer şişesi</td><td>ThermoFisher</td><td>4103-0250PK</td><td></td></tr><tr><td>Kirpik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam slayt</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Grafik ve istatistik yazılımı</td><td>Prism</td><td></td><td>Graphpad 5</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB = H3375 & H7006</td><td></td></tr><tr><td>Hipoklorit</td><td>Hawkins</td><td>Sodyum Hipoklorit %4-6, USP "1 gal</td><td></td></tr><tr><td>LB Et Suyu, Miller</td><td>Fisher</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Klorür (Heksahidrat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>RB = M0250</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat (heptahidrat)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik karıştırma çubuğu</td><td>Fisherbrand</td><td>16-800-510&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj tüpleri</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>NA 22 bakteri</td><td>CGC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma</td><td>1400-61-9</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>Advanced Instruments, Inc</td><td>Model 3320</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur Pipetler</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Petriplates</td><td>Falcon</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>pH Metre</td><td>Orion VersaStar Pro</td><td>IS-68X591202-B 0514</td><td></td></tr><tr><td>Polistrin konik tüpler</td><td>Falcon</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum dihidrojen fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat - DIBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8281</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum Fosfat - MONOBASIC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>VWR</td><td>10ml = 89130-898</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı</td><td>Güvenilir Bilimsel</td><td>55S 12x16</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher</td><td>RB=BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen Fosfat</td><td>Fisher</td><td>RB=S381</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Tablo</td><td>MS office</td><td></td><td>Microsoft Excel</td></tr><tr><td>Stereo Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Modeli tlb3. 1 stemi2000</td><td></td></tr><tr><td>Steril Pipet uçları</td><td>Çeşitli</td><td>02-707-400</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RB = S5016</td><td></td></tr><tr><td>Süper Yapıştırıcı</td><td>Loctite</td><td>1647358 .14 oz.</td><td></td></tr><tr><td>SwimR yazılımı</td><td>10.18129/B9.bioc.SwimR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tracker 2</td><td>Worm Tracker 2.0</td><td>www.mrc-lmb.cam.ac.uk/wormtracker/</td><td></td></tr> <tr><td>Video kayıt yazılımı</td><td>Virtualdub</td><td>http://www.virtualdub.org/</td><td></td></tr></tbody></table>

yüzme felç indüklenen caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için

Swimming Induced Paralysis to Assess Dopamine Signaling in Caenorhabditis elegans

Bu protokol için açıklanan Yüzme tahlil dopaminerjik düzenleyen proteinler tanımlamak için geçerli bir araç synapses olduğunu. Benzer şekilde memeliler, dopamin (DA) C. elegans öğrenme ve motor aktivite de dahil olmak üzere çeşitli işlevlerini kontrol eder. Bu DA yayın (örneğin, amfetamin (AMPH) tedavileri) teşvik veya DA izni engel koşulları (örneğin, hayvanlar DA ışınlama eksik (dat-1) DA nöronların reaccumulating aciz olan) hücre dışı DA aşırı oluşturmak Sonuçta ortaya çıkan Inhibe gezisidir. Bu davranış özellikle belirgin olduğunda hayvanlar yüzmek. Aslında, uzun bir süre için yüzmeyi vahşi-türü hayvanlar devam ederken, dat-1 boş mutantlar ve vahşi-tipi AMPH ile tedavi veya DA ışınlama inhibitörleri Kuyunun dibine batırın ve hareket etmiyor. Bu davranış "Yüzme felç" (SWIP) indüklenen olarak adlandırılır. SWIP tahlil iyi kurulmuş olsa da, yöntemin ayrıntılı bir açıklama bulunmuyor. Burada, SWIP gerçekleştirmek için adım adım yönergeler açıklanmaktadır. Tahlil gerçekleştirmek için geç larva sahne-4 hayvan kontrol Sükroz çözümü ile ya da ezelî AMPH içeren bir cam spot levha yerleştirilir. Hayvanlar için bir stereoscope altında görselleştirme tarafından el ile veya otomatik olarak kayıt ile bir fotoğraf makinesi üzerinde stereoscope monte Yüzme davranışlarını attı. Videolar sonra dayak frekans ve felç ısı haritaları şeklinde görsel bir gösterimini verir bir izleme yazılımı kullanılarak analiz edilir. El ile ve otomatik sistemler ve hayvanların Yüzme yeteneği kolayca ölçülebilir bir okuma garanti böylece tarama için mutasyonlar dopaminerjik sistem içinde taşıyan hayvan veya yardımcı genler için kolaylaştırmak. Buna ek olarak, SWIP kötüye AMPH gibi ilaçların etki mekanizmaları aydınlatmak için kullanılabilir.

Biz SWIP tahlil AMPH tedavi tarafından indüklenen örneği mevcut. Şekil 1 yukarıda açıklandığı gibi tahlil kurulumunun şematik gösterim gösterir. İçin el ile tahlil, eşitlenmiş geç L4 sahne solucanlar bir kirpik ya da Platin ile toplanan yaklaşık 8-10 yaş almak ve 40 µL 200 mOsm/L sukroz (kontrol çözümü) veya sukroz 0,5 mM AMPH ile dolu ve SWIP için test edilmiş bir cam spot levha içine yerleştirilir.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1...

Yüzme indüklenen felç (SWIP) olan köklü bir davranış tahlil Caenorhabditis elegans içinde (C. elegans) sinyal dopamin temel mekanizmaları çalışırdım. Ancak, tahlil gerçekleştirmek için detaylı bir yöntem bulunmamaktadır. Burada, SWIP için bir adım adım Protokolü açıklar.

Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için

The swimming assay described in this protocol is a valid tool to identify proteins regulating the dopaminergic synapses. Similar to mammals, dopamine (DA) ...

Bu prosedürün genel amacı Yüzme Kaynaklı Felç veya SWIP göstermektir, C.elegans dopamin sinyalizasyon değerlendirmek için bir davranışsal tedavi. SWIP içinde veya dopaminerjik sinaps ile ilgili genlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlar. Bu yöntem, örneğin ilaçlar veya dopamin taşıyıcı mutasyonlar neden olduğu ekstrasellüler dopamin aşırı tarafından üretilen etkilerin araştırılmasını sağlar.Test sırasında test edilen tüm solucanların aynı süre boyunca yüzmesini sağlamak için hayvanların çözeltiye hızlı bir şekilde aktarılması gerekir. Prosedürü gösteren Sirisha Kudumala ve Serene Sossi olacaktır. İkisi de laboratuvarımda çalışıyor.Solucan başlangıç kültürleri kurmak için, iyi beslenen C.elegans içeren bir tabak agar küçük parçalar kesmek ve bireysel NA22 E.coli plakalar içine agar parçaları aktarmak için steril bir spatula kullanın. Plakaları 3-4 gün boyunca 20 derecede kuluçkaya yattıktan sonra, stereo mikroskop altında gravid yetişkinlerin varlığını görsel olarak doğrulayın. Senkronize bir solucan popülasyonu elde etmek için, gravid yetişkinlerle dolu bir tabağa su fışkırtın.Solucanları yerinden çıkarmak için plakayı hafifçe döndürün ve solucanları 15 mililitrelik polistire

swimming-induced-paralysis-to-assess-dopamine-signaling

Research

JoVE Journal

Behavior

Davranış

Bu video C. elegans dopaminerjik nöron nörodejenerasyon, Parkinson hastalığı için bir model olarak değerlendirmek için nasıl kullanılacağını göstermektedir. Ayrıca, genetik ekranlar ya dejenerasyon geliştirmek veya nöroprotektif faktörleri tanımlamak için kullanılır.

Potansiyel Parkinson Hastalığı Genler Doğrulama için C. elegans Dopamin Nöron Dejenerasyonu Testi Uygulama

Bu video iki sinir uyarıcı, aldicarb ve pentylenetetrazole (PTZ), nematod, C. elegans sinaptik fonksiyonu çalışma tamamlayıcı yollardan nasıl istihdam göstermektedir. Bu modüle nöronal senkronizasyonu için evrimsel olarak korunmuş mekanizmaları tamamlayıcı bir yaklaşım da ışık tutmak için kullanılan ve epilepsi ve nöbet etkileri olabilir.

C. elegans Sinaptik İletim Mutants farmakolojik karakterizasyonu için Paradigmalar

Bu yazıda, UV öldürüldü bakteriyel gıda ile sağlam bir medya üzerinde muhafaza nematod ömrü ölçmek için genel bir protokol mevcut.

Ölçme Caenorhabditis elegans Katı Medya Ömrü

Burada, yüzme gibi şiddetli hareketler sırasında ortaya çıkan davranışsal bir C. elegans fenotipi olan SWIP'yi ölçmek için bir test sunuyoruz. Örnek protokol hem manuel hem de otomatik analiz yaklaşımlarını tartışır.

Yüzmeye Bağlı Felç (SWIP) Testi: Dopamin Aracılı Hareketi Ölçmek İçin Bir Yöntem C. elegans

Bu video, vahşi tip veya ALS-mutant insan TDP-43 proteinini eksprese eden C. elegans'daki motor disfonksiyonu değerlendirmek için bir radyal hareket testinin kullanımını göstermektedir. Farklı seviyelerde vahşi tip veya mutant TDP-43 ekspresyonuna sahip solucanların sürünmesine izin verilir ve hareketleri, tahlil plakası üzerindeki merkezi noktadan kat edilen radyal mesafe ile ölçülür. Test, farklı C. elegans suşlarının kat ettiği mesafeye bağlı olarak hafif, orta ve şiddetli motor bozukluklar...

C. elegans Modellerinde Motor Bozukluğun Radyal Hareket Testi Kullanılarak Değerlendirilmesi

Içinde isteğe bağlı hareket ikna etmek için bir yarı-otomatik mikro-elektro-akışkan...

On-talep Kantitatif Analiz için mikroakışkan tabanlı Electrotaxis<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

sıvı içinde nematod yüzme davranış bilgisayar tabanlı analiz için etkin ve basit bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem C. elegans laboratuarlar için hiçbir yatırım çok az gerektirir. kullanılan donanım standart ve davranışsal analizi (Celest) için bilgisayar yazılımı açık kaynak kodlu bir tanesidir.

ve Otomatik Analizi<em&gt; C. elegans</emCelest Yazılım Kullanma&gt; Deniz Davranışı

Bu protokol, C. elegans amyotrofik lateral skleroz modellerinde hafif, orta ve şiddetli motor bozukluk arasında ayrım yapmak için iki hassas tahlil, C. elegans suşları için genel yarar ile değiştirilmiş hareketlilik ile açıklanmaktadır.

C. elegans Amyotrofik Lateral Skleroz Modellerinde Motor Bozukluğun Değerlendirilmesi

Bu yazıda, C. elegans'tadopaminerjik nöron dendrit morfolojislerindeki değişiklikleri tutarlı bir şekilde ölçmek için yedi puanlık bir puanlama sisteminin nasıl kullanılacağını sergiliyoruz. Bu sistem, nörodejeneratif bozuklukların genetik, kimyasal ve yaşa dayalı modellerini kullanan dopaminerjik nörodejenerasyon testlerinin analizleri için tasarlanmıştır.

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Mevcut protokol, Caenorhabditis elegans asetilkolin reseptörlerinin bir sınıfının farmakolojik agonisti olan levamisole'ye yanıtı belirlemek için bir tahlili açıklamaktadır. Bu sıvı levamisol yüzme testinde, araştırmacılar 24 kuyucuklu plakalarda yetiştirilen hayvanların zamana bağlı felcini görsel olarak gözlemler ve nicelleştirir.

Caenorhabditis elegans Ölçümü Asetilkolin Reseptör Agonisti Levamisol'a duyarlılık

Bu protokol, genç RAC1/CED-10 mutant Caenorhabditis elegans'ta niceliksel bir dışkılama testini detaylandırır ve prodromal Parkinson hastalığı evrelerini incelemek için basit bir model sunar. Diğer hayvan modellerinin sınırlamalarını aşar ve erken Parkinson patolojisini hedefleyen terapötik stratejilerin test edilmesini kolaylaştırır.

Caenorhabditis elegans RAC1/CED-10 mutantlarında Gastrointestinal Motilite'nin Erken Parkinson Hastalığını Araştırmak İçin Bir Araç Olarak Değerlendirilmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'da dopamin sinyalini değerlendirmek için Yüzme Felç (SWIP) davranışsal testini. Bu yöntem, dopaminerjik sinapsla ilgili genleri hızla tanımlamaya ve davranış üzerindeki etkileri incelemeye yardımcı olur.

Yüzme felç indüklenen Caenorhabditis elegans dopamin sinyal değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet