Name: Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 33 s
Description: Öğrenin, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanarak hücrelerdeki yerel Ca²⁺ sinyallerini ayırmayı. Bu yöntem, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında alt hücresel çözünürlükte gerçek zamanlı izleme sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser aşağıdaki hibe tarafından desteklenir: Japonya bilim ve teknoloji Ajansı (JST) / Precursory araştırma embriyonik bilim ve Teknoloji (saygınlık) (JPMJPR15F8, Japonya); Japonya toplum bilim (JSP'ler) tanıtımı için / Takeda Vakfı bilimsel araştırma (KAKENHI) (JP18H05414, JP17H05710, JP16K07316), yardım verir. Yazarlar Haruhiko Bito (Tokyo Üniversitesi) RCaMP2 ve Arthur J.Y. Huang verdiğiniz için teşekkür ederiz ve Thomas McHugh (RIKEN CBS) AAV vektörel çizimler sağlamak için ve talimatlar için AAV hazırlık ile ilgili. Yazarlar ayrıca editörler günlük, görselleştirildiği deneyler için video filme ve düzenleme ile onların yardım etmek, teşekkür etmek istiyorum.

Burada açıklanan tüm deneylerin eğitim, kültür, spor, bilim ve teknoloji Japonca Bakanlıkça verilen kılavuz göre RIKEN Emanet Komitesi ve hayvan deney Komitesi tarafından kabul edildi.
1. hücre hazırlanması
<ol><li>Poli (ethyleneimine) hazırlanması-kaplı coverslips Not: Nöronlar ve astrocytes gelişimini engelleyen olmadan coverslips için sıkı bir şekilde takmak için izin verdiği Poly(ethyleneimine) (PEI) kaplama cam cihazları için önerilir. Ancak, diğer kaplama yöntemleri (örneğin, Poli-Ornitin, Poli L-lizin, kaplama laminin), gerekirse, cam-alt yemekleri mevcuttur.<ol>
<li>Bir 18 mm çaplı cam coverslip 12-şey plaka her kuyuya yerleştirin. Steril su kullanarak %0,04 PEI solüsyonu (12,5 mL/12-iyi plaka) hazırlayın.</li>
		<li>Her şey için 1 mL %0,04 PEI çözeltisi ekleyin. Coverslips altında hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.</li>
		<li>Tabaklar CO2 kuluçka gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Ertesi gün, kaplamalı coverslips 3 yıkama x 1 mL steril su ile. Bir aspiratör PEI Çözümle kaldırmak, her şey için 1 mL steril su ekleyin ve böylece PEI çözüm coverslip ve plaka arasında iyice yıkanabilir 12-şey plaka sallamak. Kalan PEI hücreler için toksik olduğu gibi son yıkama tamamen emişli sonra bu su emin olun.</li>
		<li>Kuru ve coverslips ultraviyole (UV) en az 15 dakikadır ışık ile örtünün içinde sterilize. PEI kaplı yemek 4 ° C'de 2 aya kadar saklanabilir. Yemekleri UV ışık kullanmadan sadece 15 dakika ile aydınlatmak.</li>
		<li>5 mL steril distile su buharlaşma kültür ortamının önlemek için kuyu arasında boşluk ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Kaplama hücre hatları Not: Bu protokolü transfection HeLa hücreleri ve COS-7 hücreleri gibi memeli hücre satırlarından hücreye için sadece bir örnek sağlar. Kullanıcılar kendi deneyleri için optimize edilmiş diğer transfection iletişim kuralları uygulayabilirsiniz. Bu bölümde, biz de COS-7 hücrelere uygulanabilir HeLa hücre kültür Protokolü anlatacağız.<ol>
<li>% 70-%90 izdiham elde onlar kadar transfection önce günde 10 cm kültür çanak hücrelerde kültür.</li>
		<li>Kültür orta prewarm ( Tablo malzemelerigörmek) ile 37 ° c</li>
		<li>Hücreler 2 yıkama x fosfat tamponlu tuz olmadan Ca2 + ve Mg2 + (PBS [-]) ile.</li>
		<li>PBS(-) Aspire edin, 1 mL % 0.5 tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözeltisi ekleyin ve 90 37 ° C'de hücreler kuluçkaya yuvarlak bir şekil elde onlar kadar s.</li>
		<li>Prewarmed kültür trypsinization durdurmak için orta 9 mL ekleyin. Kültür orta 1:6 oranında hücrelerle sulandırmak.</li>
		<li>Tohum PEI kaplı coverslips 12-şey tabak içinde seyreltilmiş hücrelerin 1 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Hipokampal nöron-astrocyte karışık kültür fareler veya fareler hazırlanması Not: Bölümler 1.3 ve 1.4 ilk gözden geçirilmesi gerekir ve bir hayvan Kurulusları ve kullanmak Komitesi tarafından onaylanmış ve bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı için resmen onaylanmış yordamlar izlemeniz gerekir. Nöronal kültür iletişim kuralının akış şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.<ol>
<li>Laminar akış başlık altında tüm reaktifler hazırlayın. Yer Dulbecco'nın değiştirilmiş kartal orta (DMEM) içine iki 100 mm bir buz kutusunda bulunuyor yemekleri (yaklaşık 20 mL/çanak) kültür.</li>
		<li>Diseksiyon orta DMEM ve 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) oluşan 50 mL hazırlamak ( Tablo malzemelerigörmek) ve Orta üç 60 mm kültür yemekleri (yaklaşık 7 mL/tabak) ve sekiz 35 mm dağıtmak Kültür yemekleri (yaklaşık 2 mL/çanak). Bulaşıkları başka bir buzdolabına koyun.</li>
		<li>Kuluçka salin, Hanks dengeli tuz solüsyonu ile 20 mM ( Tablo malzemelerigörmek) HEPES, takıma oluşan 50 mL hazırlamak ve 8 mL serum 15 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirin.</li>
		<li>B-27, glutamin ve penisilin-streptomisin ile (bkz. Tablo reçetesi) takıma kaplama orta minimum temel orta (MEM) ile hazırlayın. Bu orta oda sıcaklığında (20-28 ° C) korumak.</li>
		<li>% 70 etanol ile cerrahi aletler sterilize.</li>
		<li>Bir kağıt havlu kapaklı ve 1 mL isoflurane bir cam kavanoza yerleştirin. 1 dk. için buharlaşır isoflurane izin.</li>
		<li>A gebe iri fare ya da bir fare adım 1.3.6 göre hazırlanmış kavanoz yerleştirin ve derin anestezi kadar hayvan kavanozda saklıyorum (yaklaşık 30 s 1 dk).</li>
		<li>İmzalat hayvan kavanozdan almak ve dezenfekte belgili tanımlık hayvan ve diseksiyon ekipman % 70 etanol ile püskürtülerek. Ventral orta hat standart diseksiyon makası ve cımbız ile kesme ve rahim gebe iri fare veya fare ayıklamak.</li>
		<li>E18-19 embriyo imzalat dişi sıçan veya fare, hassas diseksiyon makası kullanarak rahim hulâsa ve ayıklanan embriyo halka Forseps ile 10 cm tabak soğuk anestezi için buz gibi DMEM içine yer.</li>
		<li>Embriyo ince diseksiyon makası ile başını kesmek ve 10 cm tabak içinde buz gibi DMEM baş yer.</li>
		<li>Her embriyo 13 cm ile beyin ayıklamak Semken forseps ve forseps iyi ipuçları ile kavisli. 60 mm tabak içinde buz gibi diseksiyon orta beyni.</li>
		<li>İyi ipuçları, buz gibi diseksiyon orta 35 mm yemekler ile iki forseps kullanarak hippocampi, kaldırmak ve kuluçka serum 15 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirilen izole dokusunda korumak.</li>
		<li>Hippocampi kuluçka salin ile yıkama ve kuluçkaya tripsin (1.25 mg/mL) ve Dnaz ile ben (0.25 mg/mL) olarak 37 ° C'de 5 min için kuluçka serum Kuluçka tuz, 150 µL hisse senedi tripsin x 20 ve 20 x stokunun Dnaz 150 µL 2.7 mL önerilen kuluçka birimdir ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>3 hippocampi yıkama x buz gibi kuluçka salin ile.</li>
		<li>Kuluçka salin Aspire edin ve Dnaz içeren kaplama orta 1 mL ekleyin ben (hisse senedi çözüm 10 µL; bkz: Malzemeler tablo). Doku pipetting çok 20 x tarafından askıya alma ve bir hücre sayaç ve Trypan mavi tahlil kullanarak hücrelerin, yoğunluğunu ölçmek.</li>
		<li>1.4 x 105 canlı hücre/mL için rats ve 2.5 x 105 canlı hücre/mL fareler için bir yoğunluk Hipokampal hücrelere sulandırmak. Seyreltilmiş hücre süspansiyonlar 12-şey kültür plakaları PEI kaplı coverslips üzerine 1 mL tohum.</li>
		<li>Hücreleri bir CO2 İnkübatör yapılan 37 ° C'de 2-3 gün için korumak.</li>
		<li>Kaplama orta kaldırın. Hücreleri kurumasına izin vermeyin. Yavaşça ve hızlı bir şekilde prewarmed bakım orta ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	</ol></li>
	<li>Sıçan kortikal nöron-astrocyte karışık kültür ve donmuş hücreleri ve donmuş kültürler canlanma hazırlanması Not: Bir dondurma yöntemi kortikal hücreler için açıklanan previously11 idi. Burada, hangi kortikal hücrelerinin-80 ° C'de en az 3 ay süreyle saklanabilir değiştirilmiş bir protokol sağlanır. Bu iletişim kuralının akış şeması Şekil 2' de gösterilmiştir.<ol>
<li>DMEM, diseksiyon orta, kuluçka serum ve adımları 1.3.1–1.3.4 ve Malzemeler tablobelirtildiği gibi kaplama orta hazırlayın.</li>
		<li>DMEM, ısı inaktive fetal sığır serum ve penisilin-streptomisin (bkz. Tablo reçetesi) oluşturdu yıkama orta hazırlamak, gerekirse.</li>
		<li>E18-19 embriyo imzalat dişi sıçan veya fare, hassas diseksiyon makası, kullanılarak rahim hulâsa ve halka forseps soğuk anestezi için buz gibi DMEM içine ayıklanan her embriyo eklemenizi sağlar.</li>
		<li>Beyin embriyo kaldır ve buz gibi diseksiyon ortamda saklayın. Başparmaklarınız kaldırmak ve onları kuluçka serum 15 mL konik tüp buz üzerinde yerleştirilen korumak.</li>
		<li>Kuluçka salin ile başparmaklarınız yıkama ve tripsin (1.25 mg/mL) ve Dnaz başparmaklarınız kuluçkaya kuluçka salin 37 ° C'de 5 dakika içinde ben (0.25 mg/mL) Kuluçka salin, 20 hisse senedi tripsin x 300 µL ve 20 x stokunun Dnaz 300 µL 5.4 mL önerilen kuluçka birimdir 12 başparmaklarınız için ben.</li>
		<li>3 başparmaklarınız yıkama x buz gibi kuluçka salin ile.</li>
		<li>Süpernatant kaldırın ve kaplama orta 2 mL takıma Dnaz 150 µL ile ben stok ekleyin. 20'den az vuruş pipetting tarafından hücreleri ayırmak ve 70 µm gözenek boyutu ile bir hücre süzgeç kullanarak hücreleri filtre.</li>
		<li>Kaplama için hücre süzgeç kaplama orta 20 mL ile yıkayın. Donmuş hücre stok hazırlanması için yıkama orta 20 mL hücrelerle yıkayın ( Tablo malzemelerigörmek)</li>
		<li>Bir hücre sayaç ve Trypan mavi yöntemi kullanarak hücrelerin, yoğunluğunu ölçmek.</li>
		<li>1.4 x 105 canlı hücre/mL ile kaplama Orta yoğunluk kortikal hücrelere sulandırmak ve PEI kaplı coverslips 12-şey kültür tabak içinde seyreltilmiş hücre süspansiyon 1 mL ekleyin.</li>
		<li>2-3 gün için bir CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreleri korumak ve kültür orta bakım Orta olarak değiştirin.</li>
		<li>1.4.9 adımdan sonra 187 x g 3 dk, bir salıncak rotor kullanarak hücreleri centrifuging tarafından dondurulmuş kortikal hücre hisse senedi hazırlayın.</li>
		<li>Süpernatant Aspire edin ve dondurma orta ( Tablo malzemelerigörmek) 4 ° C'de 1 x 107 hücre/mL hücre yoğunluğu elde etmek için sürekli ekleyin. Kriyojenik tüpler içine hücre süspansiyon aliquot 1 mL.</li>
		<li>Tüpler-80 ° C sıcaklık değerine ulaşılana kadar konteyner-1 ° C/dak, buz gibi bir fiyata sahip buz gibi bir hücreye yerleştirin ve-80 ° C dondurucu dondurucu konteyner aktarın. Hücreleri en az 3 ay-80 ° C'de depolanan</li>
		<li>Donmuş hücreleri yeniden canlandırmak için bu yıkama orta (yaklaşık 13 mL her kriyojenik tüpü) ve bakım orta ( Tablo malzemelerigörmek) dondurulmuş kortikal hücreler için prewarm.</li>
		<li>Donmuş hücreleri hızla 37 ° C'de bir su banyosu içinde çözülme.</li>
		<li>Prewarmed yıkama orta çözdürülen hücrelerle yavaşça sulandırmak. 187 x g 3 dk, bir salıncak rotor kullanarak hücreleri santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Pelet yıkama orta 1 mL askıya alma ve uygun hücre yoğunluğu ölçün.</li>
		<li>Bakım orta 3.0 x 105 canlı hücre/mL ve tohum 1 mL PEI kaplı 12-şey plakaları hücre süspansiyon hücre yoğunluğu vermeye donmuş kortikal hücreler için hücrelerle sulandırmak.</li>
	</ol></li>
</ol>2. membran hedefli Turk ifadesidir
<ol><li>
Transfection hücre
	<ol>
<li>250 eklemek GECI plazmid (yani, Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 veya OER-GCaMP6f CMV organizatörü ile) ng7,8,9 düşük serum orta 100 µL için (bkz. Tablo reçetesi) iyi başına. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f, düşük serum orta her iyi 100 µL her plazmid kullanım 250 ng cotransfection için.</li>
		<li>Transfection reaktif 0.5 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) serum plazmid azaltılmış orta karışımı kuyuya başına. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f cotransfection için transfection reaktif iyi başına 0.5 µL ekleyin.</li>
		<li>Karışımı 30 dk, oda sıcaklığında (20-28 ° C) için kuluçkaya.</li>
		<li>100 µL karışımı her coverslip için drop-wise bir şekilde ekleyin.</li>
		<li>48-72 h CO2 kuluçka 37 ° C'de Turk ifade izin vermek için hücreleri kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfection ve Hipokampal veya kortikal nöronların adeno ilişkili virüs enfeksiyonu Not: Transfection (DIV) 3-5 gün tüp bebek için daha yüksek bir transfection oranı nöronlar için sonuçlanır. Transfection 6-8 DIV, astrocytes Turk en iyi ifade için tercih edilir. İfadesi Turk için Disosiye kültür nöronlar içinde 9 DIV sonra adeno ilişkili virüs (AAV) vektörel çizimler enfeksiyon daha iyi ifade etkinlik sağlar. AAV vektörler Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f Organizatör hazırlanan daha önce açıklandığı gibi EF1a altında bir ifade için HEK293 kullanarak hücreleri12 ( Tablo malzemelerigörmek).<ol>
<li>Transfection 3-8 gün sonra kaplama için etiket iki tüpleri, plazmid DNA diğeri transfection reaktif bir tane.</li>
		<li>İndirimli serum orta 50 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her tüpün kuyuya başına.</li>
		<li>Plazmid DNA coverslip başına 0,5 µg ve transfection reaktifi ( Tablo malzemelerigörmek) nöronlar için eşlik ek 1 µL iyi plazmid DNA tüp için ekleyin. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f cotransfection için her plazmid 0,5 µg ve ek 1 µL düşük serum orta iyi başına 50 µL karıştırılır.</li>
		<li>Transfection reaktif 1 µL ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) transfection reaktif tüp bir kuyu başına. Transfection reaktif aynı miktarda cotransfection için kullanılır.</li>
		<li>Girdap her iki için 1-2 s tüpleri.</li>
		<li>Transfection reaktif karışım (Adım 2.2.4) (Kimden adım 2.2.3) DNA karışıma ekleyin. Yavaşça pipetting tarafından mix ve karışımı (coverslip başına 100 µL) oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Hücreleri üzerine bu karışım drop-wise bir şekilde yükleyin.</li>
		<li>Hücreleri bir CO2 kuluçka 2-3 gün için işaretleyici proteinler ifade edilir kadar kuluçkaya.</li>
		<li>AAV enfeksiyon için karışık nöron-astrocyte kültür AAV 3 µL iyi başına ekleyin. Çanak rock yaparak karışımı yavaşça. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f Çift Kişilik enfeksiyon için her AAV 3 µL iyi kullanılmaya başlandı. Turk ifade hücre sayıları yetersiz olduğu durumlarda enfeksiyon için en uygun AAV tutarı tespit edilmelidir.</li>
		<li>Kültür için 1 – 2 hafta Turk ifade edilir kadar korumak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Ca2 + görüntüleme
<ol><li>
Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ifade hücre aynı anda görüntüleme Not: İçin aynı anda kayıt Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyalleri, optik görüntü-yarma gerekmektedir. Optik RCaMP2 ve GCaMP6f ayrılması ve aynı fotoğraf çerçevesi üzerine kendi projeksiyon makinesi (şekil 3A) etkinleştirin. Ayrıca aynı anda görüntüleme gerektirir aynı anda uyarma mavi (450 – 490 nm) ışık yayarlar olabilir (1) ışık kaynakları ve yeşil (500-560 nm) spectra, (2) çift bantlı filtre ve dikroik ayna setleri mikroskobu ve (3) emisyon RCaMP2 için filtreler ve GCaMP6f. Ayrıntılar için Tablo malzemeleriçin bakın.<ol>
<li>Görüntüleme aygıtları ve bilgisayarları en az 30 dk önce kayıt açın. Odası 37 ° C'ye ısınma mikroskop prewarm Görüntü bölme aygıtı, filtreler ve ışık kaynağı ayarlayın. Aynı görüş alanı fotoğraf makinesi üzerinde görünecek şekilde görüntü bölme optik hizalayın. Uygun objektif lens seçin (bkz. Tablo malzeme).</li>
		<li>Mount hücreleri içeren coverslip Lck-RCaMP2 ile transfected ve OER-GCaMP6f kayıt odasında uygun görüntüleme orta veya arabellek (18 mm coverslips için 400 µL) odasında ekleyin ve mikroskop sahnesinde yerini. Bir kapak orta buharlaşma önlemek için kayıt odası yerleştirin.</li>
		<li>Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f tarafından floresan görüntüleme ifade hücreleri bulun. Photobleaching ve fototoksisite önlemek için uyarma ışık yoğunluğunu en aza indirmek.</li>
		<li>Kapağı çıkarın ve 10 Hz değerinde hızlandırılmış bir kaydını başlat seçimini yapın. Bu kayıt sırasında Ca2 + yanıt (örneğin, histamin HeLa hücreleri, COS-7 hücreler için ATP için) uyandırmak için odasına agonist ekleyin.</li>
		<li>Hızlandırılmış verileri sabit disk sürücüsü (HDD) kaydedin.</li>
		<li>Görüntü analiz yazılımı kullanarak veri analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ifade astrocytes spontan faaliyetleri kayıt Not: Optik görüntü-yarma, Ca2 + sinyalleri plazma zarı ve acil servis çevrenizdekileri aynı hücrede izlenebilir. Burada, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sıralı kayıt aynı astrocytes içinde açıklanmıştır. Bir petrol-daldırma hedef 1.3 büyük bir sayısal diyafram ile spontan Ca2 + etkinlik için önerilir.<ol>
<li>Mikroskobunun açmak, kamera, ışık kaynağı ve mikroskop Isıtma en az 30 dk önce kayıt odası.</li>
		<li>Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f kayıt odasında transfected hücreleri içeren coverslip dağ ve görüntüleme orta 400 µL ekleyin. Bir kapak odası üstüne yerleştirin.</li>
		<li>GCaMP6f ve ışık kaynağı için filtre seçin (mavi uyarma ışık, örneğin 470– 490 nm; bkz: Malzemeler tablo). OER-GCaMP6f ifade astrocytes bulun.</li>
		<li>Bir filtre kümesi ve ışık kaynağı RCaMP2 için seçin (yeşil uyarma ışık, örneğin, 510-560 nm; Tablo reçetesibakın) ve Lck-RCaMP2 aynı astrocytes ifade olup olmadığını doğrulayın. Photobleaching önlemek için ışık kaynağı uzun maruz kaçının.</li>
		<li>Lck-RCaMP2 2 Hz değerinde kayıt hızlandırılmış görüntüleri 2 dakika süreyle HDD üzerinde görüntüleme verileri kaydetmek.</li>
		<li>Buna GCaMP6f için ayarla filtresini değiştirin. OER-GCaMP6f aynı görüş alanı, 2 dakika süreyle 2 Hz değerinde kayıt hızlandırılmış görüntülerini HDD üzerinde verileri kaydetmek.</li>
		<li>Görüntü analiz yazılımı kullanarak veri analiz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Nöronlarda kayıt spontan nöronal aktivite ve indüklenen Ca2 + yükseklik Not: Nöronal görüntüleme için mikroskop Kur 3.2 bölümünde açıklanan aynıdır. Burada, spontan Ca2 + yükselmesi nedeniyle Lck-GCaMP6f ve mGluR etkinleştirmesi nedeniyle OER-GCaMP6f tarafından indüklenen Ca2 + yükseklik görüntüleme açıklanmıştır.<ol>
<li>Spontan nöronal etkinliklerini kaydetmek için Lck-GCaMP6f kayıt odasında ifade hücreleri içeren coverslip dağ ve orta görüntüleme 400 µL ekleyin. Bir kapak odası üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Filtre ve ışık kaynağı (mavi uyarma, örneğin 470-790 nm; bkz: Malzemeler tablo) o GCaMP6f için ayarlayın. LCK-GCaMP6f ifade ve spontan aktivite gösteren nöronlar bulmak.</li>
		<li>Görüntüleri 2 Hz veya daha hızlı elde etmek. HDD üzerinde verileri kaydetmek.</li>
		<li>Görüntü analiz yazılımı kullanarak veri analiz.</li>
		<li>İndüklenen Ca2 + yükseklik kaydetmek için OER-GCaMP6f 400 ile ifade hücreleri içeren coverslips monte orta Imaging µL. Bir kapak odası üstüne yerleştirin.</li>
		<li>GCaMP6f için ayarla filtresini kullanarak, OER-GCaMP6f ifade nöronlar bulmak.</li>
		<li>Kapağı kaldırın. 2 Hz veya daha hızlı hızlandırılmış kaydetmeye başlamak. Kayıt sırasında Gq protein birleştiğinde reseptör agonistleri ekleyin (örneğin, mGluR5 agonist [RS] - 3,5 - dihydroxyphenylglycine [DHPG]) acil servis Ca2 + yayınlamasını uyandırmak için.</li>
		<li>HDD üzerinde hızlandırılmış görüntüleri kaydetmek ve verileri analiz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).</li>
<li>Bagur, R., Hajnoczky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Ca%282%2B%29+Sensing%3A+Its+Role+in+Calcium+Homeostasis+and+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Intracellular Ca(2+) Sensing: Its Role in Calcium Homeostasis and Signaling.</a> Molecular Cell. 66 (6), 780-788 (2017).</li>
<li>Bannai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+Control+of+Synaptic+GABAAR+Clustering+by+Glutamate+and+Calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Bidirectional Control of Synaptic GABAAR Clustering by Glutamate and Calcium.</a> Cell Reports. 13 (12), 2768-2780 (2015).</li>
<li>Tojima, T., Hines, J. H., Henley, J. R., Kamiguchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second+messengers+and+membrane+trafficking+direct+and+organize+growth+cone+steering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Second messengers and membrane trafficking direct and organize growth cone steering.</a> Nature Reviews Neuroscience. 12 (4), 191-203 (2011).</li>
<li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nature Neuroscience. 13 (6), 759-766 (2010).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Niwa, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+local+Ca%282%2B%29+signals+inside+cytosol+by+ER-targeted+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Dissection of local Ca(2+) signals inside cytosol by ER-targeted Ca(2+) indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 479 (1), 67-73 (2016).</li>
<li>Vervliet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+ryanodine+receptor+activity+suppresses+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Basal ryanodine receptor activity suppresses autophagic flux.</a> Biochemical Pharmacology. 132, 133-142 (2017).</li>
<li>Sakuragi, S., Niwa, F., Oda, Y., Mikoshiba, K., Bannai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglial+Ca2%2B+signaling+is+generated+by+the+coordination+of+IP3R+and+store-operated+Ca2%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Astroglial Ca2+ signaling is generated by the coordination of IP3R and store-operated Ca2+ channels.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 486 (4), 879-885 (2017).</li>
<li>Inoue, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+high-affinity%2C+fast%2C+red+calcium+indicator+R-CaMP2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a high-affinity, fast, red calcium indicator R-CaMP2.</a> Nature Methods. 12 (1), 64-70 (2015).</li>
<li>Quasthoff, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+frozen+E18+rat+cortical+cells+can+generate+functional+neural+networks+after+standard+cryopreservation+and+thawing+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Freshly frozen E18 rat cortical cells can generate functional neural networks after standard cryopreservation and thawing procedures.</a> Cytotechnology. 67 (3), 419-426 (2015).</li>
<li>Boehringer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Loss+of+CA2+Transmission+Leads+to+Hippocampal+Hyperexcitability%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Chronic Loss of CA2 Transmission Leads to Hippocampal Hyperexcitability.</a> Neuron. 94 (3), 642-655 (2017).</li>
<li>Arizono, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-selective+diffusion+barrier+enhances+sensitivity+of+astrocytic+processes+to+metabotropic+glutamate+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Receptor-selective diffusion barrier enhances sensitivity of astrocytic processes to metabotropic glutamate receptor stimulation.</a> Science Signaling. 5 (218), ra27(2012).</li>
<li>Kanemaru, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+subtle%2C+transient%2C+and+local+activity+of+astrocytes+using+an+ultrasensitive+Ca%282%2B%29+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of subtle, transient, and local activity of astrocytes using an ultrasensitive Ca(2+) indicator.</a> Cell Reports. 8 (1), 311-318 (2014).</li>
<li>Inoue, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TI+Workbench%2C+an+integrated+software+package+for+electrophysiology+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+%28Oxford%2C+UK%29%22%5BJournal%5D)">TI Workbench, an integrated software package for electrophysiology and imaging.</a> Microscopy (Oxford, UK). 67 (3), 129-143 (2018).</li>
<li>Miyamoto, A., Bannai, H., Michikawa, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+microscopic+systems+for+long-term+imaging+of+intracellular+calcium+using+a+ratiometric+genetically-encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Optimal microscopic systems for long-term imaging of intracellular calcium using a ratiometric genetically-encoded calcium indicator.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 434 (2), 252-257 (2013).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Transgenic+Mouse+Lines+for+Selectively+Targeting+Astrocytes+and+Studying+Calcium+Signals+in+Astrocyte+Processes+In+Situ+and+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Transgenic Mouse Lines for Selectively Targeting Astrocytes and Studying Calcium Signals in Astrocyte Processes In Situ and In Vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Farklı biyolojik çıkışlarını Ca2 + sinyalleri tarafından başlatılır. CA2 + çok yönlü bir hücre içi sinyal messenger'dır. Belirli çıkışlarını uyandırmak için Ca2 + sinyalleri şifresini çözmek bir temel biyolojik soru olmuştur ve Ca2 + sinyalleri çeşitliliği açıklamak için Ca2 + görüntüleme teknikleri gereklidir. Şu anda detaylı Protokolü ayrı Ca2 + sinyalleri plazma zarı ve ER (şekil 3 ve şekil 4) ve yerel Ca2 + microdomains (şekil 4 ve şekil 5) hücre içinde algılanmasını sağlar. Bu hücre içi Ca2 + sinyalleri çeşitliliği açıklayan için katkıda bulunur. Ca2 + zamansal çözünürlük sinyallerini ayrıca geliştirilmiş Turk plazma zarı ve ER Ca2 + ve Turk kendilerini üç boyutlu bir Difüzyon etkisini önleyebilirsiniz ve tespit potansiyeline sahiptir çünkü hedefleyerek Ca2 + akını veya membran üzerinde oluşan Ca2 + açıklaması, çok anda.
Protokol bazı sınırlamalar vardır. Kullanıcılar algılanan sinyalleri "Ca2 + akın ya da serbest bırakmak an" toplamı olduğunu göz önünde tutmalı ve "Ca2 + dışarı orijinal Ca2 + kaynaktan, büyük Ca2 + sinyalleri için özellikle yayılmış". Örneğin, her ne kadar onun stimülasyon HeLa hücrelerin çağrıştıran Ca2 + serbest üzerinden ER, onun sonuç Ca2 + sinyalleri sadece ER hedefli OER-GCaMP6f tarafından aynı zamanda plazma membran hedeflenmiş Lck-RCaMP2 (şekil 3) tarafından algılanır. Ca2 + sinyalleri kronolojik zamanmekansal desen Ca2 + sinyal çıktısını tek belirleyici olabilir başka bir kısıtlamadır. Aşağı akım efektör proteinler dağılımı (gibi Ca2 +-bağımlı kinaz ve fosfatazlar) bir belirleyici faktör2de kullanabilirsiniz. Tamamen intrasellüler Ca2 + sinyalleri şifresini çözmek için bu protokol için kapsamına girmeyen, akış aşağı enzim davranış analizi kesinlikle gereklidir.
Başarılı Ca2 + görüntüleme için en önemli unsurlarından biri görüntüleme ayarı ve görüntü edinme koşulları, de diğer canlı görüntüleme çalışmaları gelince. Biz daha önce Ca2 + hücre yanıtlarında süresi ve yoğunluğu uyarma ve görüntü edinme koşulları, pozlama süresi ve satın alma sıklığı16dahil olmak üzere son derece bağımlı olduğunu gösterdi. Uyarma aydınlatma güç en kritik faktör olduğu hafif toksisite ve Turk photobleaching neden olabilir. Pozlama süresi, sıklığı, uyarma ışık şiddeti ve süresi kayıt, kayıt kayıt şartları deneme amaçlı göre optimize edilmelidir. Çekim hızı ve uyarma ışık şiddeti photobleaching ve hücreye fototoksisite önlemek mümkün olduğunca azaltılması tavsiye ediyoruz. Kayıt sıklığı ve süresi, kayıt Ca2 + yükseklik ilgi etkinlikleri karşılamak için yeterli olmalı ama aynı zamanda photobleaching ve fototoksisite önlemek mümkün olduğunca düşük tutulmalıdır. Biz kayıt sıklığı ve süresi önce belirleyerek ve Turk photobleaching simge durumuna küçültülmüş ışık yoğunluğunu ve çekim hızı optimize öneririz. Bir başka önemli faktör Turk ifade düzeyidir. Turk var bir Ca2 +-Ca2 +olduğu gibi etkisi arabelleğe alma-proteinler bağlama. Bu nedenle, Turk overexpression Ca2 +, fizyolojik hücreler için gerekli olan tampon içinde sonuçlanır. GECI ifade miktarını görüntüleme hücreleri Turk yüksek miktarda ifade önlemek için indirilmelidir. 
  Sonuç olarak, Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon çıkış biyolojik fenomen belirleyen intrasellüler Ca2 + sinyalleri şifresini çözmek için en önemli adımlardan biridir. Bu iletişim kuralı bu sinyalleri arasında çeşitlilik açıklamak için Ca2 + sinyalleri diseksiyon için yeni bir yöntem sağlar. Şu anda, bu teknik içinde vitro deneyler için sınırlıdır. Ancak, Lck-GCaMP6f içinde vivo Ca2 + görüntülemede fareler17için kullanılmakta olan ve OER-GCaMP6f Ca2 + izlemek için C. elegans7 VD motor nöronlarda ın vivo sinyalleri onaylandı. Bu nedenle, Turk hücre altı yerde hedefleme içinde vivo gelecekte, böylece etkinleştirme Ca2 + diseksiyon içinde vivo Imaging'e genişletilecek potansiyeline sahiptir.

CA2 + sinyalleri intrasellüler Ca2 + konsantrasyonunun yükselmesi temsil eder. CA2 + ökaryotik hücreler için evrensel ikinci messenger'dır. CA2 +kullanarak, hücreleri farklı hücre içi sinyal yolları çalışır ve çeşitli biyolojik çıkışlarını ikna etmek. Örneğin, nöronlar, sinaptik vezikül yayın presynaptic terminalinde içinde gen ekspresyonu çekirdeği ve postsynapse, sinaptik plastisite indüksiyon düzenlenir, tam olarak uygun etkinleştiren ayrı Ca2 + sinyalleri tarafından aşağı akım enzimler doğru sitelerdeki ve hassas zamanlama1.
Ca2 + sinyallerin belirli kronolojik zamanmekansal desenleri belirli aşağı akım enzimleri aktif hale getirin. CA2 + sinyalleri iki farklı Ca2 + kaynakları arasında koordinasyon tarafından oluşturulur: Ca2 + akını ekstrasellüler boşluk ve Ca2 + sürümü bir intrasellüler Ca2 + hizmet veren endoplazmik retikulum (ER), saklayın. Belirli hücre işlevi ikna etmek için anlamlı kronolojik zamanmekansal Ca2 + sinyal desen Ca2 + kanal plazma zarı veya ER membran2çevresinde oluşturulan 10-100 µM Ca2 + nanodomains tarafından da desteklenir. Önemlisi, Ca2 + sinyalleri aşağı akım biyolojik çıkış belirleyen en önemli faktörlerden biri kaynağıdır. Nöronlarda, Ca2 + akını ve Ca2 + yayın gama - aminobütirikasit (GABA)A reseptörleri (GABAAR) GABAergic sinapslar, kümeleme üzerinde ters etkileri inhibisyonu için sorumlu olduğu vardır nöronal uyarılabilirlik3. Tarafından büyük nöronal uyarma eşliğinde Ca2 + akını sinaptik GABAAR kümeleri dağılım neden olmaktadır, kalıcı Ca2 + yayın ise acil servis sinaptik GABAARs kümeleme teşvik etmektedir. Diğer gruplar da büyüme koniler ayarlama yönünü eleştirel Ca2 + sinyal kaynağında bağlı olduğunu bildirdin: Ca2 + akını indükler itme, Ca2 + yayın cazibe nöronal büyüme yol gösterir iken koni4. Bu nedenle, tamamen belirli hücresel çıkışlarını temel yolları sinyal Ca2 + anlamak için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte açıklayarak Ca2 + sinyal kaynağını tanımlamak önemlidir.
Bu protokol için Ca2 + sinyalleri Ca2 + sinyal kaynakları (şekil 1) tahmini sağlar hücre altı çözünürlükte bildirmek için bir Ca2 + görüntüleme yöntemi açıklanmaktadır. CA2 + microdomains plazma zarı altında başarıyla plazma zarı-yerelleştirme sinyal Lck Src içinde eki ile plazma zarı hedefleyen genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (Turk) tarafından izlenir kinaz Turk5N termini için. Ca2 + sinyal örneği bir daha iyi kayma ve zamansal çözünürlük acil civarında algılamak için biz son zamanlarda OER-GCaMP6f, GCaMP6f hangi6 hedefler acil servis dış membran içinde ER transmembran protein kullanılarak geliştirilmiş. OER-GCaMP6f hassas Ca2 + ve Turk Difüzyon kaçınarak Ca2 + çözünürlükte daha iyi kronolojik zamanmekansal COS-7 hücreleri7 ve HEK293 hücreleri8, geleneksel nontargeted GCaMP6f ER yayınlamasını bildirebilirsiniz . Biz de spontan Ca2 + yükseklik OER-GCaMP6f tarafından bildirilen kültürlü Hipokampal astrocytes farklı bir kronolojik zamanmekansal desen gösterdi doğruladı plazma zarı hedefli GCaMP6f tarafından izlenen ile karşılaştırıldığında (Lck-GCaMP6f)7 ,9OER-GCaMP6f ile Ca2 + görüntülemede Lck-GCaMP6f ile birlikte Ca2 + sinyalleri kaynaklarını tanımlamak için hücre altı çözünürlükte diseksiyon katkıda gösteren,.
Halen, protokol Ca2 + sinyal diseksiyon HeLa hücreleri ve nöron-astrocyte cam coverslips üzerinde kaplama kültürler karışık için ayrıntı. Ca2 + görüntüleme tekniği ile Turk burada, Lck-GCaMP6f, plazma membran hedeflenmiş RCaMP210 (Lck-RCaMP2), belirtilen ve bu Turk belirtilebilir tüm hücrelere OER-GCaMP6f (şekil 1) tabidir.

<table><tbody><tr><td>(RS)-3,5-Dihidroksifenilglisin (DHPG)</td><td>Tocris</td> <td># 0342</td><td></td></tr><tr><td>%0,5 DNaz I stok çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#11284932001</td><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisinde %0,5 DNaz I (a/h) hazırlayın&nbsp; 120 mM MgSO4 ile desteklenmiştir. 160 & hazırlayın; L alikotlar ve -30 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>% 0.5 Tripsin-EDTA çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 25300054</td><td></td></tr><tr><td>100 mM L-glutamin (&kez; 100 stok)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#25030081</td><td>250-750 & mikro'luk küçük alikotların hazırlanması; L ve -30 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>100 mM Sodyum piruvat (&times; 100 stok)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 11360070</td><td>Alikotlar (10 mL) -20 ° C'de saklanabilir. Çözüldükten sonra, çözelti 4 ° C'de tutulabilir; 2 ay boyunca C.</td></tr><tr><td>Düşük buharlaşma kapaklı 12 kuyulu çok kuyulu kültür plakaları</td><td>Falcon</td><td>#353043</td><td>Düşük buharlaşma kapağı, nöron-glia karışık kültürünün kültürlenmesi için kritik öneme sahiptir. Hücre hattı hücreleri için alternatif kültür kapları kullanılabilir.</td></tr><tr><td>18 mm çapında dairesel lameller</td><td>Karl Hecht "Assistent"</td><td>#41001118</td><td>Kalınlık 1, 18 mm çapında dairesel lameller; alternatif lameller kullanılabilir.</td></tr><tr><td>1 M HEPES</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 15630080</td><td>pH 7.2-7.6</td></tr><tr><td>%2.5 Tripsin stok çözeltisi (&times; 20 stok)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#T4674</td><td>150 ve mikro hazırlayın; L alikot ve -30 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>% 50 Poli (etilenim) (PEI) çözeltisi&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#P3143</td><td>%2 (V/V) PEI stok çözeltisi hazırlayın (&kez; 50) filtrasyon ile sterilize edilmiş damıtılmış su ile. Stok çözümünü -30 ° C'de saklayın; C, 250-750 &; L'lik küçük alikotlar hazırladıktan sonra, lamel kaplama gününde damıtılmış su ile% 0.04 PEI çözeltisi hazırlayın.</td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td></td><td></td><td>Yüzey dezenfeksiyonu için kullanılmak üzere sprey şişesinde saklanır.</td></tr><tr><td>EF1a promotörü AAV'nin yönlendirmesi altında Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ve OER-RCaMP2 ekspresyonu için adeno-ilişkili virüs (AAV),</td><td>AAV Helper Free System (Agilent Technologies) ve HEK293 hücreleri veya alternatif yöntemler kullanılarak hazırlanabilir. pAAV.EF1a.Lck-GCaMP6f, pAAV.EF1a.Lck-RCaMP2 ve&nbsp; pAAV.EF1a.OER-GCaMP6f istek üzerine temin edilebilir.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-27 eki (&times; 50 stok)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#17504044</td><td>Bu, B-27 plus takviyesi (Thermo Fisher Scientific; #A3582801) veya MACS NeuroBrew-21 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Almanya; #130-093-566) ile değiştirilebilir.</td></tr><tr><td>B57BL/6</td><td>Japonya SLC, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskobik görüntü kaydı</td><td></td><td></td> için kamera <td>Aşağıdaki kameralar kullanıma hazırdı: soğutmalı CCD kamera (örneğin, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), EM-CCD kamera (örn. Hamamatsu Photonics, vb; ImagEM; Andor, iXon) veya&nbsp; CMOS kamera (örneğin, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)</td></tr><tr><td>Hücre dondurma kabı</td><td>Sarstedt K.K.</td><td>#95.64.253</td><td>Alternatif hücre dondurma kabı kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>#352350</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatör</td><td></td><td></td><td>37 ° C'de koruyun; C, %5 CO<alt>2</alt>.</td></tr><tr><td>Kriyojenik tüp</td><td>Corning</td> <td># 430661</td><td>Alternatif kriyojenik tüpler kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Kriyoprezervasyon ortamı</td><td>Zenoaq</td><td></td> <td>"CELLBANKER1"</td></tr> <tr><td>Kültür ortamı (HeLa hücreleri için)</td><td></td><td></td> <td>Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve penisilin-streptomisin çözeltisi (nihai konsantrasyon: Penisilin 100 U / mL ve Streptomisin 100 & mikro; g/mL)</td></tr><tr><td>Diseksiyon ortamı&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Bir mililitre 1 M HEPES (son konsantrasyon 20 mM) ila 49 mL DMEM&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td> <td># 08456-65</td><td>Alternatif DMEM kullanılabilir.</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Nacalai</td> <td># 08456-65</td><td>Düşük glikozlu</td></tr><tr><td>DNA transfeksiyon reaktifi</td><td>Sigma-Aldrich</td> <td>#</td> <td>6366244001 "X-tremegene HP DNA transfeksiyon reaktifi" Alternatif transfeksiyon reaktifleri kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Kapaklı</td><td></td><td></td> cam kavanoz: <td>Hayvanı uyuşturmak için 500 mL kavanoz (fare için) veya 1.500 mL kavanoz (sıçan için);</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 14170161</td><td>Kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS</td></tr><tr><td>Isı ile etkisiz hale getirilmiş sığır serumu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>#10100147</td><td></td></tr><tr><td>HeLa hücreleri</td><td>RIKEN BioResource Center</td><td>#RCB0007</td><td></td></tr><tr><td>Histamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#H7125</td><td></td></tr><tr><td>Görüntü analiz yazılımı</td><td></td><td></td><td>Metamorph (Moleküler Cihazlar), ImageJ (NIH) ve TI Workbench14 (ısmarlama) gibi&nbsp;</td></tr><tr><td>Görüntü bölme optiği</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>#A12801-01</td><td>W-view GEMINI</td></tr><tr><td>Görüntü bölme optiği dikroik ayna</td><td>Semrock</td><td>#FF560-FDi01-25&times; 36</td><td>Yeşil floresan proteini / kırmızı floresan proteininin ayrılması için; (GFP/RFP) sinyali</td></tr><tr><td>Görüntü bölme optiği emisyon filtreleri</td><td>Semrock</td><td>#FF01-512/25-25, #FF01-630/92-25</td><td>GFP/RFP sinyalinin emisyonu için sırasıyla</td></tr><tr><td>Görüntüleme ortamı ve tampon</td><td></td><td></td><td>Deney için en uygun ortamı veya tamponu kullanın. Ortam kullanıldığında, arka plan floresansını azaltmak için fenol kırmızısı içermeyen ortam arzu edilir. CO2 inkübatörünün dışında pH'ı korumak için 20 mM HEPES ekleyin.</td></tr><tr><td>Kuluçka salin&nbsp;</td><td></td><td></td><td>IX73 (Olympus) gibi 49 mL HBSS Ters floresan mikroskobuna 1 mL 1 M HEPES (20 mM) ekleyin</td></tr><tr><td></td> veya&nbsp;<td></td><td></td><td> Eclipse TI (Nikon Instech)</td></tr> <tr>Anestezi <td>için kullanılan</td> <td>Isofluran</td><td>Pfizer</td><td></td></tr><tr><td>Bakım ortamı (4 ve kez; 12 kuyulu yemek için)</td><td></td><td></td> <td>1 mL B-27, 500 ve mikro ile desteklenmiş 48,5 mL Nörobazal-A ortamı; L L-glutamin stoğu ve 25 & mikro; L Penisilin-Streptomisin çözeltisi.</td></tr><tr><td>Donmuş kortikal hücreler için bakım ortamı (1 ve kez; 12 kuyulu tabak için)&nbsp;</td><td></td><td></td><td>12.2 mL Nörobazal artı 250 & mikro ile desteklenmiş ortam; L B-27, 125 ve mikro; L L-glutamin stoğu ve 6.2 & mikro; L Penisilin-Streptomisin çözeltisi.</td></tr><tr><td>MEM (Minimum Esansiyel Ortam)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#11090-081</td><td></td></tr><tr><td>GCaMP6f görüntüleme</td><td></td><td></td><td>için mikroskop filtre seti GFP için uygun filtre (uyarma, 480 &plusmn; 10 nm; emisyon, 530 &plusmn; 20 nm)</td></tr><tr><td>RCaMP2 görüntüleme</td><td></td><td></td> için mikroskop filtre seti <td>RFP için uygun filtre (uyarma, 535 &plusmn; 50 nm; emisyon, 590 nm uzun geçiş)</td></tr><tr><td>RCaMP2 ve GCaMP6f Semrock'un çift görüntülenmesi için mikroskop filtre setleri</td><td></td><td>#FF01-468 / 553-25, #FF493 / 574-FDi01-25 ve kez; 36, #FF01-512 / 630-25</td><td>Çift uyarma filtresi, Çift dikroik ayna ve GFP / RFP görüntüleme için emisyon filtresi.</td></tr><tr><td>Mikroskop ısıtma sistemi</td><td></td><td></td><td>Hücreleri 37 ° C'de tutmak için bir ısıtma sistemi; Görüntüleme sırasında C. Termal genleşmenin neden olduğu kaymayı önlemek için, tüm mikroskobun kendisini kaplayan ısıtma sistemleri (örneğin, Tokai Hit, Thermobox) önerilir.</td></tr><tr>Uyarma <td></td><td></td><td>için mikroskop ışık kaynağı</td><td>Cıva lambası (100 W), ksenon lamba (75 W), Işık yayan diyot (LED) aydınlatma sistemi (ör. CoolLED Ltd., precisExcite; Thorlabs Inc., 4 dalga boylu LED kaynağı; Lümen, SPECTRA X hafif motor). Cıva topakı ve ksenon lamba durumunda, uyarma yoğunluğunu azaltmak için ND filtresi kullanın.</td></tr><tr><td>Nöronlarda</td><td>ve astrositlerde spontan Ca2+ aktivitesinin kaydedilmesi için 1.3'ten daha yüksek sayısal açıklığa sahip mikroskop</td> objektif <td></td><td></td> objektifi Plan-Apochromat yağa daldırma objektifi şiddetle tavsiye edilir.</tr><tr><td>Neurobazal plus medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#A3582901</td><td></td></tr><tr><td>Neurobazal-A Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#10888022</td><td>Neurobazal-A ortamı yerine nörobazal artı ortam (Thermo Fisher, A3582901) kullanılabilir.</td></tr><tr><td>PBS(-): Ca2+ ve Mg2+&nbsp; içermeyen fosfat tamponlu salin;</td><td>Fujifilm Wako Saf Kimyasal İşbirliği</td> <td># 164-23551</td><td>Ca + ve Mg 2 + yokluğu, tripsin aktivitesini inhibe etmemek için kritik öneme sahiptir. PBS(-)'ye bir alternatif kullanılabilir.</td></tr><tr>Metamorph (Moleküler Cihazlar) gibi <td>PC ve görüntü elde etme yazılımı</td><td></td><td></td><td>; Mikro yönetici; TI Çalışma Tezgahı14.</td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> <td>#15140122</td><td>Penisilin 10.000 U / mL ve Streptomisin 10.000 &mikro; g/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>Sitomegalovirüs promotörü altında Lck-GCaMP6f, Lck-RCaMP2 ve OER-RCaMP2 ekspresyonu için plazmid 7-9</td><td></td><td></td> <td>İstek üzerine temin edilebilir</td></tr><tr><td>Kaplama ortamı (4 ve 12 kuyulu yemekler için)</td><td></td><td></td> <td>1 mL B-27 takviyesi ile desteklenmiş 48 mL MEM, 500 & mikro; L L-glutamin stoğu (nihai konsantrasyon: 2 mM), 500 & mikro; L sodyum piruvat stoğu (1 mM) ve 25 & mikro; L Penisilin-Streptomisin çözeltisi (penisilin 5 U/mL, streptomisin 5 ve mikro; g/mL). Bu Penisilin-Streptomisin konsantrasyonu, 1/20 < Üretici tarafından önerilen konsantrasyon, nöronal sağkalım için kritik öneme sahiptir.</td></tr><tr><td>Kayıt odası</td><td>Elveflow</td><td>Ludin Odası</td><td>Bu kayıt odası 18 mm çapında yuvarlak lameller içindir.</td></tr><tr><td>Azaltılmış serum ortamı</td><td>Thermo Fisher</td><td>#11058021</td><td>Opti-MEM</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td>Hipokampusları incelemek için kullanılır. Olympus SZ60 veya eşdeğeri stereomikroskoplar mevcuttur.</td></tr><tr><td>Cerrahi aletler</td><td></td><td></td><td>Bir farenin veya sıçanın karnını kesmek için standart diseksiyon makası, uterusu sıkıştırmak için cımbız, uterusu ve embriyonun başını kesmek için hassas diseksiyon makası, embriyoları sıkıştırmak için halka forseps, beyinleri çıkarmak için 13 cm kavisli Semken forseps (Güzel Bilim Araçları #11009-13), ince uçlu 3 forseps&nbsp; (Dumont İnoks #5)</td></tr><tr><td>Nöron için transfeksiyon reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>#L3000008</td><td>"Lipofectamine 3000" reaktifi. Adım 2.2.3'te plazmit DNA ile karıştırılması gereken "takviye (P3000)" ve adım 2.2.4'te kullanılan "transfeksiyon reaktifi (lipofektamin 3000)" den oluşur.</td></tr><tr><td>Tripan mavisi (% 0.4)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td> <td># 15250061</td><td></td></tr><tr><td>Donmuş kortikal hücreler için yıkama ortamı&nbsp;</td><td></td><td></td><td>250 & ile desteklenmiş 25 mL DMEM; L ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu + 12.5 & mikro; L Penisilin Streptomisin.</td></tr><tr><td>Wistar sıçanları</td><td>Japonya SLC, Inc</td><td></td><td>Gebe sıçanlar (E18)</td></tr></tbody></table>

yerel ca2 + sinyalleri membran hedefli ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Kalsiyum iyon (Ca2 +) birden çok sinyal yolları, çeşitli biyolojik çıkışlar için önde gelen sürücüler bir evrensel hücre içi haberci moleküldür. İki Ca2 + sinyal kaynağı koordinasyonu — "Ca2 + akını" dan hücre dışında ve "Ca2 + sürümü" hücre içi Ca2 + endoplazmik retikulum (ER) — farklı spatio-temporal desenleri Ca'nın altında yatan kabul edilir birden çok biyolojik fonksiyonları hücrelerde neden 2 + sinyalleri. Bu iletişim kuralının amacı "Ca2 + akını" ve "yayın Ca2 +" çok anda izleme sağlayan yeni bir Ca2 + görüntüleme yöntemi tarif etmektir. OER-GCaMP6f ER dış membran için hedef GCaMP6f oluşan bir genetik olarak kodlanmış Ca2 + (GECI) göstergesidir. OER-GCaMP6f Ca2 + yayın geleneksel GCaMP6f daha yüksek zamansal çözünürlükte izleyebilirsiniz. Plazma zarı hedefli Turk ile birlikte, kendisinin zamansal Ca2 + sinyal örneği hücre altı çözünürlükte tanımlanabilir. Burada açıklanan hücre altı hedefli Ca2 + göstergeleri prensip olarak, tüm hücre türleri için kullanılabilir bile içinde vivo için Caenorhabditis elegans nöronlar Imaging. Bu iletişim kuralı ' Ca2 + görüntüleme hücrelerde hücre satırlarından, sinir hücreleri ve Disosiye birincil kültürlerde gliyal hücreler tanıtmak ve sıçan kortikal nöronların donmuş stok hazırlanması açıklayın.

LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücreleri ifade edildi ve her iki sinyali aynı anda görüntü bölme optik, transfection (şekil 3A ve Video 1) sonra 24 saat kullanılarak kaydedildi. Görüntüleri, hangi Ca2 + ER yayınlamasını neden olmaktadır, kayıt sırasında eklendi 10 Hz. histamin (onun 1 µM), elde. Onun başvuru üzerine, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyal yoğunluğunu, ilk floresan yoğunluğu (şekil 3B) değişiklik gösterir ΔF/F0 yalancı görünümünü tarafından gösterildiği gibi arttı. LCK-RCaMP2 da OER-GCaMP6f tarafından bildirilen zaman derslerin Ca2 + Yükseklik (ΔF/F0) faiz (ROI) (şekil 3 c) aynı bölgede karşılaştırıldı. ΔF/F0 değerleri farklı ifade düzeyleri ve dağıtımları var iki farklı Turk arasında saat ders karşılaştırma etkinleştirmek için en yüksek değerlerine normalleştirilmiş. Her iki sensörler bir salınım benzeri Ca2 + ayrıcalık bildirdi. LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f beş hücre tipleri arasında iki hücre aynı zamanlı Kurs Ca2 + yükselme gösterdi (şekil 3 c, yatırım Getirisi 1 ve 3) inceledi. Ancak, Lck-RCaMP2 tarafından gösterilen Ca2 + yükselmeler OER-GCaMP6f (şekil 3 C, 2, 4 ve 5 yatırım Getirisi) tarafından gösterilen kıyasla daha yüksek düzeyde kaldı. Daha önce onun stimülasyon tarafından indüklenen bu Ca2 + sinyal kaynağı olan ER sonlandırılmadan iken Ca2 + yükseklik plazma zarı çevresinde, uzun sonuçlar gösterir.
Başparmaklarınız (şekil 4B) Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f (şekil 4, Video 2, Video 3 tarafından gösterildi ve spontan Ca2 + astrocytes sıçan hippocampi (şekil 4A) kültüründen karışık nöron astrocyte gelen sinyalleri , Video 4ve Video 5). Kortikal kültürler bu protokol için açıklandığı gibi hazırlanan donmuş stoktan canlandırdı. LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyalleri sırayla aynı hücrelerden 2 Hz'de kaydedildi. Üç ROIs Ca2 + yükselme gösterdi bölgede her GECI tarafından seçildi ve zaman ΔF/Ftemel (yani, floresan yoğunluğu) ortalama Floresans yoğunluğu tüm kayıt döneminde (Ftemel değiştirdi ). Temel Floresans kararlı ve Ca2 + yükselmeler daha seyrek, Ftemel Ca2 + yükseklik olayları algılamak için bir yararlı temel olur. Spontan Ca2 + çizimleri astrositik açışında, hücre gövdesi de değil görünür. Bu sonuç astrositik spontan Ca2 + sinyalleri diğer Turk görüntülenmeyecektir tüp bebek13 ve içinde vivo14tarafından önceki raporlarda ile tutarlıdır. Hipokampal ve kortikal astrocytes içinde Lck-RCaMP2 (üst) tarafından gösterilen Ca2 + yükselmeler daha sık sık--dan o OER-GCaMP6f tarafından gösterilen. Bu sonuç Ca2 + yükselmeler nedeniyle Lck-GCaMP6f astrocytes, daha sık bu OER-GCaMP6f7 nedeniyle daha tespit edildi bizim önceki gösteri ile tutarlı olacak ve bu kavramı da tarihinde geçerli olduğunu göstermektedir tek hücre düzeyi.
Spontan Ca2 + yükselmeler Lck-GCaMP6f tarafından olgunlaşmamış sıçan Hipokampal nöronlar (10 DIV) içinde 2 Hz (şekil 5A ve Video 6)'de görüldü. ΔF/F0 beş farklı ROIs içinde zaman içerisinde bu Ca2 + yükselmeler yerel olarak hücre altı etki alanlarıyla sınırlı öneririz. Şekil 5B (Video 7) OER-GCaMP6f-ifade AAV vektörleri ile enfekte Ca2 + yanıtları olgun fare Hipokampal nöronlar (30 DIV) gösterir. Nöronlar 100 µM Ca2 + yayın inducing agonist metabotropic Glutamat reseptörlerinin için olan DHPG ile teşvik. DHPG kaynaklı Ca2 + yayın OER-GCaMP6f nedeniyle tespit edildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig1.jpg"> Şekil 1: membran hedefli Turk gösteren diyagram. Plazma zarı hedefli Turk (Lck-GCaMP6f ve Lck-RCaMP2) ve dış ER şematik diyagramı membran hedefli GCaMP6f (OER-GCaMP6f).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig2.jpg"> Şekil 2: akış Hipokampal ve kortikal hücre hazırlık, plazmid transfection ve AAV enfeksiyon için. Mikroskobik görüntü temsilcisi, taze kaplama DIV-6 kortikal hücreleri (solda) ve dondurulmuş stok (sağda) hücrelerden canlandırdı. Ölçek çubuğu 100 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig3.jpg"> Şekil 3: eşzamanlı görüntüleme Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücreleri içinde örneği. (A)optik görüntü bölme ile sinyal ayrılık şematik gösterimi. Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f aynı görüş alanı aynı anda kamerayı öngörülmektedir. 10 Hz de CMOS kamera tarafından alınan bir temsilcisi kayıt Video 1' de sağlanan ve bir çerçeve bu kayıt Masası'nda A (doğru) gösterilir. (B) ΔF/F0 Lck-GCaMP2 (üst) ve OER-GCaMP6f (alt) için sözde renk görüntüler. Histamin (onun 1 µM) 0 s. (C) temsilcisi Lck-GCaMP2 (macenta) ve OER-GCaMP6f (yeşil) normalleştirilmiş ΔF/F0 saat ders eklendi. Veri her arsa için en yüksek ΔF/F0 değerine normalleştirilmiş. Gri çubuklar başvurusunu zamanlamasını gösterir. Veri bir ısmarlama yazılım TI tezgah15ile analiz edildi. Ölçek çubuğu 50 µm (mikroskobik görüntü) =.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig4.jpg"> Şekil 4: Spontan Ca2 + yükseklik Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f ifade için izlenen astrocytes. Hipokampal temsilcisi(a)ve (B) kortikal astrocytes Lck-RCaMP2 (üst) ve OER-GCaMP6f (alt) ile transfected. Kortikal hücreleri donmuş hisse senedi kültürler canlandırdı. LCK-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f görüntüleri sırayla aynı hücrede, 2 Hz değerinde, bir EM-CCD kamera ile elde. ΔF/Fbase zaman içerisinde ROIs içinde ölçülen sol gösteri araziler mikroskobik görüntü belirtti. Veri TI tezgah ile analiz edildi. Gerçek filmler Video 2, Video 3, Video 4ve Video 5temin edilmektedir. Ölçek çubuğu 20 µm (mikroskobik görüntü) =. Satır taban çizgisi kayması genel Ca2 + düzeyde hücre değişiklikleri öneriyor.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59246/59246fig5.jpg"> Şekil 5: Ca2 + nöronlar Lck-GCaMP6f ve OER-GCaMP6f ile görüntülemede örnekleri. (A)temsilcisi sıçan Hipokampal nöronlar LCK-GCaMP6f DIV 10 (solda) ve ΔF/F0 ROIs (sarı daireler) ölçülen derslerin belirtilmiş saatte resimde (sağda) gösterilen araziler ifade. Zaman ders sayıları görüntü ROI Sayılarda karşılık gelir. Ca2 + yükseklik zamansal desen ilgi çeşitli bölgeler arasında farklı olduğuna dikkat edin. Satır taban çizgisi kayması bu nöron küresel Ca2 + düzeyinde artış göstermektedir. (B) bir örnek (solda) OER-GCaMP6f ifade AAV vektörleri ile enfekte olgun fare Hipokampal nöronların (DIV 30). ΔF/F0 ölçülen sahası arsa Ca2 + yanıt-e doğru 100 µM gösterir zaman gri çubuğu tarafından gösterilen zamanlama, (RS) - 3,5 - dihydroxyphenylglycine (DHPG) uygulanır. Sarı Daire nerede zaman ders alındı ROIs konumunu göster. Görüntüleri 2 Hz de soğutmalı-CCD kamera (Masası'nda)veya bir EM-CCD kamera (Masası B) ile satın aldı ve TI tezgah ile analiz. Ölçek çubuğu 20 µm (mikroskobik görüntü) =. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/59246fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 1" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid1.jpg"> Video 1: örnek Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücreleri içinde aynı anda görüntüleme. Temsilci kayıt 10 Hz'de satın almış ve şekil 3' te sundu. Ölçek çubuğu 50 µm =.  <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video1.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 2" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid2.jpg"> Video 2: Spontan Ca2 + geçici Lck-RCaMP2 içinde gözlenen Hipokampal astrocyte. 2 Hz (şekil 4A), alınan temsilcisi kayıt kaydedilen Video 3olarak görüş aynı alan içinde. Ölçek çubuğu 20 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video2.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 3" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid3.jpg"> Video 3: Spontan Ca2 + geçici OER-GCaMP6f içinde gözlenen bir Hipokampal astrocyte. 2 Hz (şekil 4A), Video 2olarak görüş aynı alanı elde temsilcisi kayıt. Ölçek çubuğu 20 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video3.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 4" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid4.jpg"> Video 4: Spontan Ca2 + geçici Lck-RCaMP2 içinde bir kortikal astrocyte gözlenen temsilcisi kayıt 2 Hz (şekil 4B), alınan kaydedilen Video 5olarak görüş aynı alan içinde. Ölçek çubuğu 20 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video4.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 5" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid5.jpg"> Video 5: Spontan Ca2 + geçici OER-GCaMP6f içinde gözlenen bir kortikal astrocyte. 2 Hz (şekil 4B), Video 4olarak görüş aynı alanı elde temsilcisi kayıt. Ölçek çubuğu 20 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video5.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 6" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid6.jpg"> Video 6: Ca2 + Lck-GCaMP6f tarafından bir sıçan Hipokampal nöron (sayı 10) görüntülemede örneği. Nöronal Ca2 + örnek sinyalleri kaydedilen 2 Hz (şekil 5A). Ölçek çubuğu 20 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video6.mov" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Video 7" src="/files/ftp_upload/59246/59246vid7.jpg"> Video 7: Ca2 + sürümde OER-GCaMP6f ifade bir fare Hipokampal nöron (DIV 30). Nöronal Ca2 + sinyalleri örneği OER-GCaMP6f ifade AAV vektörler (şekil 5B) ile enfekte bir fare Hipokampal nöron kaydedildi. Nöron 30'uygulanan 100 µM dihydroxyphenylglycine (DHPG) ile uyarılmış Ca2 + ER yayınlamasını uyandırmak için s. Ölçek çubuğu 20 µm. = <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59246/Video7.mov" target="_blank">Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Burada bir iletişim kuralı için Ca2 + sinyaller hücre altı çözünürlükte diseksiyon sağlayan Ca2 + düşsel nöronlar ve gliyal hücreler, mevcut. Bu işleme genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri ifade izin tüm hücre tipleri için geçerlidir.

Yerel Ca2 + sinyalleri membran hedefli Ca2 + göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

Kalsiyum sinyallerinin hücre altı çözünürlükte diseksiyonu, çıkış biyolojik fenomenini belirleyen hücre içi kalsiyum sinyallerinin çözülmesi için en önemli adımlardan biridir. Bu protokol, kalsiyum akını ve kalsiyum salınımı anının izlenmesini sağlayan yeni bir kalsiyum görüntüleme yöntemini tanımlar. Bu protokol, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerinin ifade sini sağlayan tüm hücre tipleri için geçerlidir.Yöntemimizin laboratuvar kültüründe yaşayan hayvanlarda hücre altı çözünürlüğünde kalsiyum sinyallerinin diseksiyonuna kadar genişletilme potansiyeline sahip olduğuna inanıyoruz. Prosedürü niçin göstermek için yardımcı Matsumi Hirose, bizim laboratuvar bir teknisyen olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, 12 kuyu plakasının her kuyunun içine 18 milimetre çapında cam kapak fişi yerleştirin.Steril su kullanın ve kullanılan her 12 kuyu plakası için %0,4 PEI çözeltisi için 12,5 mililitre hazırlayın. Her kuyuya bir mililitre PEI çözeltisi ekleyin ve kapak fişlerinin altında kabarcık olmadığından emin olun. 37 santigrat derecede karbondioksit kuvözde gece boyunca kuluçkaya yat.Ertesi gün, PEI çözeltisini çıkarmak için bir aspiratör kullanın. Her kuyuya bir mililitre steril su ekleyin ve plakayı sallayın, böylece kapak ve plaka arasındaki PEI çözeltisi iyice yıkanır. Bu yıkama işlemini taze sterilize su ile iki kez daha tekrarlayın.Son yıkamadan sonra, her kuyudan tamamen su aspire. Kaputun içinde, kapak fişlerini en az 15 dakika boyunca kurutmak ve sterilize etmek için ultraviyole Bir ışık kullanın. PEI kaplı çanak iki aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir.Devam etmeye hazır olduğunuzda, kullanımdan hemen önce, 15 dakika boyunca ultraviyole ışık ile yemekleri aydınlatın. Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için kuyular arasındaki boşluğa beş mililitre steril distile su ekleyin. İlk olarak, inkübasyon tuzlu ile korteksleri yıkayın.Daha sonra, 37 santigrat derece beş dakika kuluçka tuzlu Trypsin ve DNae ile korteksler inkübün. Daha sonra kortikülleri buz gibi kuluçka tuzlu suyla üç kez yıkayın. Supernatant çıkarın ve dnase I stok 150 mikrolitre ile takviye kaplama orta iki mililitre ekleyin.Yirmi kez veya daha az boru lama hücreleri ayrıştırın ve 70 mikrometre gözenek boyutu ile bir hücre süzgeci ile hücreleri filtre. Daha sonra hücre süzgecini 20 mililitre kaplama aracıyla yıkayın. Dondurulmuş hücre stokunun hazırlanması için, yıkama ortamının 20 mililitre ile hücreleri yıkayın.Mililitre başına 140 000 canlı hücre yoğunluğuna kaplama orta ile kortikal hücreleri seyreltin. Daha sonra, 12 kuyu kültür plakaları PEI kaplı kapak fişleri seyreltilmiş hücre süspansiyon bir mililitre ekleyin. Hücreleri karbondioksit kuvözde 37 derecede 2-3 gün saklar.Hücreler kararlı olduğunda, kaplamadan 2-3 gün sonra, kültür ortamını bakım ortamına çevirin. Dondurulmuş hücre stokunun hazırlanması için, hücreleri üç dakika boyunca 187 kez G'de santrifüj etmek için bir salıncak rotoru kullanarak hücreyi aşağı doğru döndürün. Süpernatant aspirate ve kriyopreservation orta ekleyin, dört santigrat derecede tutulan, mililitre başına 10 milyon hücre yoğunluğu elde etmek için.Aliquot kriyojenik tüpler içine hücre süspansiyon bir mililitre. Tüpleri, eksi 80 santigrat derecelik bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar dakikada eksi bir santigrat derece donma hızına sahip bir hücre dondurma kabına yerleştirin. Dondurucu kabı eksi 80 derecede bir dondurucuya aktarın.Dondurulmuş hücreleri canlandırmak için, önceden yıkama ortamı ve dondurulmuş kortikal hücreler için bakım ortamı ısıtın. Sonra, 37 santigrat derece bir su banyosunda hızla dondurulmuş hücreleri eritin. Hücreleri önceden ısıtılmış yıkama ortamı ve santrifüj ile 187 kez G'de üç dakika hafifçe seyreltin.Bir mililitre yıkama ortamında peleti yeniden askıya alın ve canlı hücre yoğunluğunu ölçün. Daha sonra, mililitre başına 300 000 hücre yoğunluğu verim, dondurulmuş kortikal hücreler için bakım ortamı ile hücreleri seyreltmek. PEI kaplı 12 kuyu plakaları kuyularına bu hücre süspansiyon bir mililitre cede.Kaplamadan 3-8 gün sonra transfeksiyon için, biri plazma DNA'sı diğeri transfeksiyon reaktifi için olmak üzere iki tüp etiketleyin. Her tüpe her kuyu başına 50 mikrolitre azaltılmış serum ortamı ekleyin. Kapak kayma başına plazma DNA 0.5 mikrogram ve nöronlar için transfeksiyon reaktif eşliğinde ek bir mikrolitre ekleyin, plazma DNA tüpü başına iyi başına.Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f'ın eş transfeksiyonu için, her plazmidin 0,5 mikrogramını ve bir mikrolitre ekini 50 mikrolitrelik azaltılmış serum ortamını iyi karıştırın. Daha sonra, transfeksiyon reaktif tüpüne her kuyu başına bir mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin. Girdap her iki tüpü de bir iki saniyeliğine.Sonra, DNA karışımına transfeksiyon reaktif karışımı ekleyin. Yavaşça pipet karışımı ve beş dakika oda sıcaklığında kuluçka. Bu karışımı damla gibi hücrelere yükleyin.Marker proteinler ifade edilene kadar 2-3 gün boyunca karbondioksit inkübatör de kuluçka. AAC enfeksiyonu yapmak için L ve O'yu karıştırın. Karışık nöron-astrosit kültürüne her kuyu başına üç mikrolitre AAC ekleyin.Yavaşça karıştırmak için çanak kaya. GECIs ifade edilene kadar bir ila iki hafta boyunca kültür devam ettirin. Lck-RCaMP2 ve OER-CaMPG6f ile transfected hücreleri içeren kapak fişini ilk olarak mikroskobun kayıt odasına monte edin.Görüntüleme ortamının 400 mikrolitresini ekleyin ve odanın üzerine bir kapak yerleştirin. GCaMP6f ve ışık kaynağı için filtre kümesini seçin. OER-GCaMP6f ifade astrositleri bulun.Ardından, RCaMP2 için bir filtre seti ve ışık kaynağı seçin ve Lck-RCaMP2'nin aynı astrositlerle ifade edilip edilmeyeceğini doğrulayın. Lck-RCaMP2'nin iki Hertz'de iki dakika boyunca zaman atlamalı görüntülerini kaydedin ve görüntüleme verilerini kaydedin. Bundan sonra, GCaMP6f için filtre kümesini bu şekilde değiştirin.OER-GCaMP6f'ın zaman atlamalı görüntülerini iki dakikada iki Hertz'de kaydedin ve görüntüleme verilerini kaydedin. Bu çalışmada, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f HeLa hücrelerinde ifade edilmiş ve her iki sinyal transfeksiyondan 24 saat sonra görüntü bölme optikkullanılarak eş zamanlı olarak kaydedilmiştir. Histamin ilavesi üzerine, Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f sinyal yoğunluğu arttı.Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f tarafından bildirilen kalsiyum iyon yüksekliği nin zaman kursları aynı ilgi bölgelerinde karşılaştırılmaktadır. Her iki sensör de salınım benzeri kalsiyum iyon yüksekliği rapor ediyor. Ve her ikisi de incelenen beş hücreden ikisinde aynı zaman rotasını gösteriyor.Ancak, Lck-RCaMP2 tarafından gösterilen kalsiyum iyon yükseklikleri diğer hücrelerde OER-GCaMP6f daha yüksek düzeyde kalır. Bu sonuçlar, kalsiyum iyon yüksekliğinin plazma zarının çevresinde uzadığını, histamin stimülasyonunun neden olduğu bu kalsiyum iyon sinyalinin kaynağı olan ACIL'in çevresinde daha erken sonlandırıldığını göstermektedir. Sıçan hipokampi ve kortekslerden nöron-astrosit karışık kültür astrositlerden spontan kalsiyum iyon sinyalleri Lck-RCaMP2 ve OER-GCaMP6f tarafından gösterilmiştir.Spontan kalsiyum iyon yükseklikleri sadece astrositik süreçte görülebilir, önceki raporlarla tutarlı olan hücre vücudunda değil. Olgunlaşmamış sıçan hipokampal nöronlarda Lck-GCaMP6f tarafından spontan kalsiyum iyon yükseklikleri iki Hertz görülür. Beş farklı ilgi alanının zaman kursları, bu yükselmelerin yerel olarak alt hücresel etki alanlarıyla sınırlı olduğunu göstermektedir.OER-GCaMP6f ekspresyonu AAV vektörleri ile enfekte olgun fare hipokampal nöronlar DHPG eklenmesine yanıt olarak kalsiyum iyon yanıtları göstermektedir. Kalsiyum görüntüleme için uyarma ışıklandırma gücü en kritik faktördür. Fotoğraf beyazlatma ve foto-toksisite önlemek için mümkün olduğunca düşük uyarma ışığı tutun.Kalsiyum sinyallerinin kaynağı daha da Kalsiyum kanallarına özel inhibitörleri kullanılarak Pomakorzi tarafından teyit edilebilir. Belirli bir çıktı uyandırmak için kalsiyum sinyalleri decoding temel bir biyolojik soru olmuştur. Bu kalsiyum görüntüleme tekniği hücre içi kalsiyum sinyallerinin çeşitliliğini tanımlamanın yolunu açar.

dissection-local-ca2-signals-cultured-cells-membrane-targeted-ca2

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Endoplazmik retikulum, protein biyogenezi ve kalsiyum homeostazında önemli bir rol oynar. Biz, bize Ca2 + kaçak kanal rolü ele almak ve kendi varsayılan düzenleyici mekanizmaların karakterize sağlayan deneysel bir sistem kurduk. Bu sistem siRNA aracılı gen susturulması ve canlı hücre Ca2 + görüntüleme içerir.

Canlı Hücre Kalsiyum Görüntüleme siRNA aracılığı ile gen susturma ile birlikte Ca tanımlar 2 + ER Membran Kaçak Kanallar ve Düzenleme Mekanizmaları

Lipofilik boya FM1-43 maruz kalan hücrelerin canlı görüntüleme gözenek oluşturucu toksinler plazma membran kaldırılır hangi kinetiği tam belirlenmesini sağlar. Bu Ca 2 + gereksinimleri, sfingomiyelinaz ve plazma membranı onarım diğer faktörler değerlendirmek için kullanılabilecek bir hassas bir deneydir.

Ca Rolleri değerlendirilmesi için Görüntüleme Testi Canlı<sup&gt; 2 +</supGözenek oluşturucu Toksin yaraların tamiri&gt; ve sfingomiyelinaz

Ca 2 + sinyalizasyon tesislerinde çeşitli biyolojik süreçleri düzenler. Burada mekansal ve zamansal Ca kaynaklı abiyotik stres izlemek için yaklaşımlar sunmak Arabidopsis hücre ve genetik olarak kodlanmış Ca 2 + göstergeleri Aequorin veya Case12 kullanarak dokularda 2+ sinyaller.

Ölçme Mekansal ve zamansal Ca 2+ Sinyalleri

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Burada, insan miyoblastlarının saf bir popülasyonunu yetişkin kas dokusundan elde etmek için bir metodoloji tarif ederiz. Bu hücreler, in vitro iskelet kası diferansiasyonunu incelemek ve özellikle Ca 2+ sinyallemeyle ilgili proteinleri incelemek için kullanılırlar.

İnsan Myoblastlarının İzolasyonu, Miyojenik Farklılaşmanın Değerlendirilmesi ve Mağazada Kullanılan Kalsiyum Giriş Ölçümü

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Burada bir protokol için tek tek hücre tiplerinin fare nöromusküler kavşakta nüfus sinyal görüntü kalsiyum mevcut.

Ex Vivo Hücre özgü kalsiyum fare diyafram Üçlü sinaps sinyal görüntüleme

Genetik olarak kodlanmış Ca2 + göstergeleri (turk) nasıl yerinde Ca2 + görüntüleme gerçekleştirilir kökten değişti. Veri kurtarma gibi kayıtları en üst düzeye çıkarmak için Ca2 + sinyal uygun analiz gereklidir. Bu kağıt Protokoller'de Ca sinyalleri2 + yerinde kronolojik zamanmekansal haritalama ve analiz parçacık tabanlı kullanarak kaydedilen miktar kolaylaştırmak.

Kendisinin geçici eşleme ve parçacık analiz teknikleri intrasellüler Ca sinyal2 + in Situ ölçmek için uygulamaları

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Burada, floresan mikroskobu kullanarak birincil murin ve insan T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları olarak bilinen ilk yerel Ca 2+ sinyallerini çözmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, bağışıklık hücreleri içindeki Ca2+ sinyal yolaklarını inceleyen ve işlevlerini daha da çözen araştırmacılar için değerli bir kaynak görevi görür.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Öğrenin, genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri kullanarak hücrelerdeki yerel Ca²⁺ sinyallerini ayırmayı. Bu yöntem, sinirbilim ve hücre biyolojisi araştırmalarında alt hücresel çözünürlükte gerçek zamanlı izleme sağlar.

Yerel Ca^{2 +} sinyalleri membran hedefli Ca^{2 +} göstergeleri tarafından kültürlü hücrelerdeki diseksiyon

Daha fazla video keşfet