Hipoksi/SU5416 Modeli kullanılarak Farelerde Pulmoner Hipertansiyonun İndüksiyonu ve Karakterizasyonu
3 Haziran 2020
Bu protokol, hipoksiye maruz kalma ve VEGF reseptör antagonistinin enjeksiyonuna bağlı olarak farelerde pulmoner hipertansiyonun (PH) indüksiyonunu tanımlar. Hayvanlarda protokolün başlamasından 3 hafta sonra PH ve sağ ventrikül (RV) hipertrofisi gelişir. Modelin fonksiyonel ve morfometrik karakterizasyonu da sunulmuştur.
Bu protokol pulmoner hipertansiyonu indüklemek ve sağ ventrikülün fonksiyonel ölçümlerini yapmak için kullanılabilir. Sugen Hipoksi Modeli'nin uygulanması kolaydır ve indüksiyondan sonraki iki ila üç hafta içinde pulmoner hipertansiyonun bazı özelliklerini özetleyebilir. Bu modeli kullanarak, hastalığın gelişiminde rol oynayan yeni yolları belirleyebiliriz.
Yeni hedefleri belirleyebilir ve tedavi potansiyellerini test edebiliriz. İndüksiyon işlemine başlamadan önce, azot tanklarını hipoksik haznenin yakınına sabitler ve oksijen kontrol cihazını %10 oksijen noktasına ayarlayın. Daha sonra, taze hazırlanmış SU5416 çözeltisini 25 gauge iğneile donatılmış bir mililitreşşile rendelendirve enjekte edilecek ilk hayvanı el ile dizginler.
Fare tarafından olası bir ısırık yaralanmasını önlemek için sıkıca başın arka kavramak için emin olmak omurga paralel bir çadır oluşturmak için deri kavramak. İğneyi deri altı bir şekilde gevşek deri kıvrımına yan tarafa yerleştirin ve şırınga içeriğinin 100 mikrolitresini teslim edin. 10 saniye sonra iğneyi geri çekin ve hayvanı kafesine geri getirin.
Tüm hayvanlara enjekte edildiğinde, fareleri havalandırmalı bir hipoksi odasına yerleştirin. Hipoksiye maruz kalmak için, odaların oksijen seviyesini ölçmek için bir oksijen sensörü ile donatılmış olduğunu onaylayın ve temizlik ve yiyecek ve su eklemek için her üç günde en fazla 20 dakika için odaları açın. Stres belirtileri için günlük hayvanları inceleyin ve üç hafta üst üste SU5416 enjeksiyon haftalık tekrarlayın.
Basınç ölçüm işlemini başlatmadan önce Y tüp konektörünü hazırlayın ve ventilatörün işlevini kontrol etmek için manuel modda kullanın. Barotravmadan kaçınmak için inspiratuar basıncı bir santimetreden daha az suya ayarlayın ve solunum hızını dakikada 110 nefese ayarlayın. Bir endotrakeal tüp oluşturmak ve basınç hacmi kontrol ünitesi açmak için 20 gauge intravasküler kateter kesin.
Veri toplama yazılımını başlatın ve basınç hacmi kateterini 37 derece lik bir su banyosunda 15 mililitrelik bir PBS santrifüj tüpüne yerleştirin. Daha sonra kateteri üreticinin protokolüne göre kalibre edin. Fareyi bir ısıtma yastığına yerleştirin ve vücut ısısını izlemek için rektal bir prob yerleştirin.
Daha sonra, anestezili bir farede parmak kıskacına yanıt eksikliğini onaylayın ve boyun ve göğüs bölgelerini tıraş edin. Farenin uzuvlarını cerrahi bantla sabitleyin ve medial servikal deride bir santimetrelik kesi yapın. Bir pamuk uçlu aplikatör kullanarak, trakea altında yatan kasları ortaya çıkarmak için açık sözlü ve submandibular tükürük bezleri nizve.
Dikkatle trakea ortaya çıkarmak için kasları kesin ve trakeal kıkırdak arasında küçük bir kesi yapmak için makas kullanın. Hazırlanan endotrakeal tüpü takın ve intravasküler kateterin metal rehberini çıkarın. Daha sonra kateteri ventilatöre bağlayın ve akciğerleri elle hafifçe şişirerek trakeal tüp pozisyonunu doğrulayın.
Pozisyonu bantla sabitleyin. Sağ ventrikül basınç ölçümü için, ksifoid süreci ve üst karın üzerinde bir santimetre lik deri kesiyapmak ve orta çizgi distal ile xiphoid başlayan ve dikkatle her iki tarafta yanal hareket, göğüs ve karın duvarı üzerinde deri ayırın. Karın boşluğu açılması, dikkatle diyafram kesilmiş, atan kalp veya akciğerlerzarar değil dikkat.
Ve nazikçe perikard kaldırmak için bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Farenin yanına basınç kateteri getirin ve sağ ventriküla atipik distal kısmında bir bıçak yarası yapmak için bir iğne ile donatılmış bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. İğneyi basınç kateteri ile dikkatlice değiştirin, basınç kateterini sağ ventrikülyonuna paralel olarak pulmoner artere bakacak uçlatın.
Kateterin doğru konumlandırIlmesini sağlamak için basınç dalgasının izini izleyin. Basınç sinyali dengelendikten sonra solunumları duraklatın ve en az üç ölçüm alın. Tüm ölçümler kaydedildiğinde kateteri dikkatlice su banyosundaki PBS dolu santrifüj tüpüne geri döndürün.
Burada, gözlem periyodunun sonunda temsili basınç eğrileri ve sağ ventrikül basıncının nicel analizi gösterilmiştir. Hipoksi artı SU5416 tedavisinden sonra remodele pulmoner arterlerin histolojik analizi normoksik hayvanlara göre medial duvar kalınlığında bir artış olduğunu ortaya koymaktadır. Kardiyomiyosit hipertrofisi değerlendirmek için buğday germ agglutinin boyama hipoksi artı SU5416 maruziyetkardiyomiyosit boyutu ve sağ ventrikül hipertrofisi belirgin bir artış ile sonuç gösterir.
Ayrıca Fulton indeksi ölçümü ile sağ ventrikül hipertrofisinin morfometrik değerlendirilmesi hipoksik hayvanlarda sağ ventrikül hipertrofisinde bir artışı doğrular. Fonksiyonel ölçümlerin gerçekleştirilmesi kanamayı önlemek için önemlidir, çünkü bu çalışmanın sonuçlarını olumsuz etkileyebilir. Bu protokol aynı zamanda sadece hafif değişiklikler ile sıçanlarda pulmoner hipertansiyon indüklemek için kullanılabilir.
Özellikle, sıçanlarda sadece bir Sugen enjeksiyonu pulmoner hipertansiyon indüklemek için yeterlidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, hipoksi maruziyeti ve VEGF reseptör antagonisti enjeksiyonu yoluyla farelerde pulmoner hipertansiyon (PH) indüklemesini tanımlamaktadır. Bu model, üç hafta içinde PH ve sağ ventrikül hipertrofisinin fonksiyonel ve morfometrik karakterizasyonuna olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kardiyovasküler Biyoloji
- Patofizyoloji
Arka Plan
- Pulmoner hipertansiyon, kardiyovasküler sistemi etkileyen ciddi bir durumdur.
- PH'nin ardındaki mekanizmaların anlaşılması, yeni terapötik hedeflere yol açabilir.
- Sugen Hipoksi Modeli, farelerde PH'yi incelemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir.
- VEGF reseptör antagonistleri, PH gelişiminde rol oynar.
Çalışmanın Amacı
- Kontrollü bir fare modelinde pulmoner hipertansiyon indüklemek.
- Sağ ventrikülün fonksiyonel ölçümlerini gerçekleştirmek.
- PH için yeni yolaklar ve terapötik hedefler belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Oksijen seviyeleri %10'a ayarlanarak hipoksinin indüklenmesi.
- VEGF reseptörlerini bloke etmek için SU5416 enjeksiyonu.
- Sağ ventrikül fonksiyonunun ve morfolojisinin izlenmesi.
- Modelin üç haftalık süre boyunca karakterizasyonu.
Temel Sonuçlar
- Pulmoner hipertansiyon ve sağ ventrikül hipertrofisinin gelişimi.
- Fonksiyonel ölçümler, sağ ventrikül performansında anlamlı değişiklikler olduğunu göstermektedir.
- Pulmoner hipertansiyonla uyumlu morfolojik değişiklikler gözlemlenmiştir.
- Tedavi için potansiyel yeni terapötik hedeflerin belirlenmesi.
Sonuçlar
- Sugen Hipoksi Modeli, pulmoner hipertansiyonu etkili bir şekilde taklit eder.
- Bu model, PH ile ilişkili yeni yolakların araştırılmasında kullanılabilir.
- Gelecekteki çalışmalar, terapötik testler için bu modelden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörle İlgili Yönetici Özeti
Hipoksi/SU5416 fare modeli, pulmoner hipertansiyonda vasküler yeniden şekillenme ve sağ ventrikül disfonksiyonunun incelenmesi için hızlı ve maliyet etkin bir sistem sunarak, erken evre hedef doğrulama ve mekanistik risk azaltma işlemlerine olanak tanır. Yabani tip ve genetik olarak modifiye edilmiş farelerle uyumlu olması, üç haftalık bir zaman dilimi içerisinde yolak incelemesini ve terapötik hipotez testlerini destekler. Bu model, portföy önceliklendirmesini ve riske göre ayarlanmış karar verme süreçlerini bilgilendiren, ölçülebilir hemodinamik ve histolojik çıktılar sağlayarak keşif biyolojisi ile preklinik değerlendirme arasında bir köprü kurar.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: VEGF sinyal yollarının sorgulanmasına ve pulmoner vasküler yeniden yapılanmada rol oynayan yeni terapötik hedeflerin belirlenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış indüksiyon ve ölçüm prosedürleri kullanarak genetik veya farmakolojik müdahalelerin hızlı fenotipik taramasını destekler.
- Öngörücü Değer: Medial duvar kalınlaşması ve sağ ventrikül hipertrofisi dahil olmak üzere, insan Grup 1 pulmoner hipertansiyonunun temel histopatolojik özelliklerini modelleyerek biyolojik risk azaltmayı kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Kateterizasyon yoluyla sağ ventrikül basıncı ve hipertrofi değerlendirmesi için Fulton indeksi gibi kantitatif bağımlı değişken çıktıları üretir.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış hipoksi maruziyeti ve haftalık SU5416 dozlaması ile birleştirildiğinde tekrarlanabilir, düşük varyanslı ölçümler sağlar.
- Ölçeklenebilirlik: Cerrahi uzmanlık gerektirmeden yabanıl tip ve nakavt modelleri arasında platformun yeniden kullanımına olanak tanıyarak yüksek verimli hedef doğrulama kampanyalarını destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnsan pulmoner hipertansiyon patofizyolojisini taklit eden, hedef etkileşiminin ve yolak modülasyonunun değerlendirilmesine olanak tanıyan hastalıkla ilişkili bir sistem sunar.
- Operasyonel Değer: Normoksiye dönüş sonrası geri dönüşümlü fenotip aracılığıyla, yıkama (washout) ve yeniden zorlama (rechallenge) tasarımlarına imkan tanıyarak önleme ve tedavi çalışmalarını destekler.
- Translasyonel Süreklilik: Klinik biyobelirteçlerle uyumlu fonksiyonel (RV basıncı) ve yapısal (vasküler yeniden modelleme, kardiyomiyosit hipertrofisi) son noktalar sağlayarak, erken keşif sürecini preklinik doğrulamaya bağlar.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Model, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe uyum sağlayarak; öncü bileşik optimizasyonu öncesinde erken hedef belirleme, analiz validasyonu ve mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler.
- Keşif Biyolojisi: İndüklenebilir ve geri döndürülebilir vasküler hasar yoluyla, pulmoner hipertansiyonda VEGF bağımlı ve bağımsız yolakların hipotez testlerini mümkün kılar.
- Tarama: Standartlaştırılmış indüksiyon (%10 oksijen, haftalık SU5416) ve ölçülebilir çıktılar (RV basıncı, Fulton indeksi, histolojik kalınlaşma) ile analiz edilmeye hazır biyolojik sistemler sunar.
- Analitik: Hedef önceliklendirmesi için gruplar arası karşılaştırmaya ve etki büyüklüğü tahminine olanak tanıyan fonksiyonel hemodinamik ve morfometrik okumalar sağlar.
- Translasyonel Araştırma: Sağ ventrikül adaptasyonu ve pulmoner arter yeniden şekillenmesine dair mekanistik içgörüler sunarak, biyobelirteçlerle uyumlu devam/dur kararlarını destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla kemogenetik veya farmakolojik modalitede hedeflerin iteratif testleri için yeniden kullanılabilir bir fenotipik platform olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: İnsanla ilişkili vasküler ve kardiyak patofizyolojiyi modelleyerek hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış hipoksi kontrolü, enjeksiyon takvimi ve basınç/hacim kateterizasyon teknikleri aracılığıyla tekrarlanabilirliği sağlar.
- Stratejik Değer: Fonksiyonel ve yapısal hastalık modifikasyonuna dayalı olarak hedeflerin erken aşamada risk analizine olanak tanıyarak geç aşama başarısızlık riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Objektif hedef sıralaması için çok parametreli veriler (basınç, hipertrofi, fibrozis) sağlayarak riskle uyumlu ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Hipoksik oda yönetimi, SU5416 kullanımı ve sağ ventrikül kateterizasyon teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Hassas oksijen kontrolüne (%10) ve oda bakımı için nitrojen tanklarına erişime bağlıdır.
- Kohortlar arasında model tutarlılığını sağlamak için standartlaştırılmış hayvan kullanımı ve haftalık dozlama gerektirir.
- Hafif ila orta şiddetteki fenotip ağırılığı ile sınırlıdır; bu durum, ileri hastalık evrelerinin modellenmesini kısıtlayabilir.
- Normoksiye dönüldüğündeki geri dönüşlülük, kronik terapi çalışmaları için dikkatli bir deneysel tasarım gerektirir.
