Name: Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: Öğrenin, genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanarak fukozillenmiş insan sütü oligosakkaritlerinin yüksek verimli tespit ve nicelendirme yöntemini. Bu yaklaşım, HMO analizini basitleştirir ve hızlandırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Iowa State Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir. Fe kısmen NSF Trinect Bursu ve Manley Hoppe profesörlük tarafından finanse edildi. T.J.M. kısmen Karen ve Denny Vaughn öğretim bursu tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Floresans ve LC-MS çalışmaları ile Iowa State Üniversitesi Akış Sitometresi tesis ve incelemelerinden Keck Metabolomics araştırma laboratuvarı yardım için teşekkür ederiz.

1. hücre kültür ve indüksiyon koşulları
Not: aşağıdaki deneyler üç suşlar kullanılır: E. coli BL21 (DE3) boş bir vektör, E. coli BL21 ile (DE3) plazmid pAfcA14 ve pET28:green floresan protein (GFP) ve E. coli BL21 ile (DE3) Plasmid'ler ile pAfcB14 ve pET28:GFP. Tüm suşların Luria-Bertani suyu (LB) veya en az medya uygun antibiyotikler ile yetiştirilen. 1000 x sefaloridin (50 mg/mL) ve carbenicillin (100 mg/mL) hisse senedi çözümleri deiyonize (DI) su hazırlamak.
<ol><li>
Medyası hazırlama
	<ol>
<li>LB medya LB toz stokunun 25 g 1 litre DI su ekleyerek hazırlayın. Otoklav sterilize etmek 20 dk için 121 ° C'de çözüm. Steril LB ortam sıcaklığı her 1 mL LB medya için antibiyotik stokunun 1 µL eklenmesi önce 60 ° C'den tamamlanana kadar bekleyin.</li>
		<li>LB tabak hazırlamak önce sterilizasyon LB basına 15 g agar ekleyin. Steril LB agar sıcaklık antibiyotik eklenmesi önce 60 ° C'den tamamlanana kadar bekleyin.</li>
		<li>1.1.3 biosensing hücreler için medya veya ikili antibiyotik, sefaloridin ve carbenicillin ile plakalar hazırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Karbonhidrat indükleyicileri
	<ol>
<li>Karbonhidrat indükleyicileri 20 g/L laktoz molar eşdeğerleri, hisse senedi çözümler hazırlamak: 29 g/L 2'-FL ve 3-FL Not: Her 200 µL hücre 2'-FL veya 3-FL 20 µL gerektirecektir</li>
		<li>Hücreleri 200 µL 2.0 g/M son 2'-FL/3-FL Incubate 37 ° C'de sürekli sallayarak ile laktoz veya 2.9 g/L son konsantrasyonu konsantrasyonu ile neden ve bir gecede büyümek kültürler izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hücre kültürü
	<ol>
<li>Bir gün önce deney tohum LB orta sefaloridin ve taze bir bakteriyel colony, steril tekniği kullanarak üzerinden carbenicillin ile takıma 5 mL.</li>
		<li>Tüm kültürler ajitasyon ile 37 ° C'de kuluçkaya ve kültürleri bir gecede büyümek.</li>
		<li>Gecede kültür 50 µL 5 mL taze LB/M9 medya sefaloridin ve carbenicillin de içine aktarın. 37 ° C'de sürekli sallayarak ile kuluçkaya ve kültür 600 optik yoğunluk ulaşmıştır kadar büyümek nm (OD600) 0.5-0.7. Bu orta günlük aşamada hücreleri bağlı olmak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Floresans ve algılama sınırlarının ölçümü
<ol><li>
Akış Sitometresi hücreleri hazırlanması
	<ol>
<li>Gecede kültür 1,5 mL tüpler ve 1 dk. için 12.500 x g , santrifüj aktarın.</li>
		<li>Süpernatant atmak ve Pelet 500 µL 1 x fosfat tamponlu tuz (PBS; 6 mM Na2HPO4, 1.8 mM NaH2PO4, 145 mM NaCl DI su, pH 7.2) bir tek hücre süspansiyon hazırlamak ve tek hücre aktarmak için yeniden askıya yılında süspansiyon 5 mL Akış Sitometresi tüpler için.</li>
		<li>Hücreleri üzerinde bir Akış Sitometresi örnekleri çalışan kadar 4 ° C'de karanlıkta bırakın. En iyi sonuçlar için en kısa zamanda hücreleri analiz.</li>
		<li>GFP heyecanlandırmak için 488 nm lazer seçin. Floresein isothiocyanate (FITC) floresan düzeyleri (20,000-40,000 olaylar, ön ve yan dağılım için toplanan hücre ve enkaz önlemek geçişli) 525/50 nm bant filtre ile toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Biyoalgılayıcı ayarlama
	<ol>
<li>Bir kalibrasyon eğrisi yapmak, 8-10 dilutions Standart 2'-FL aralığı 0 – 2.500 mg yapmak/L.</li>
		<li>(PAfcA ve pET28:GFP içeren) 2'-FL biosensing hücreler kültür ve onları daha önce 1.3 bölümünde açıklandığı gibi standart dilutions ile teşvik. Her seyreltme için üç biyolojik çoğaltır yerine getirir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. algılama ve miktar 2'-FL bir yapımcı yük içinde
<ol><li>
Ekimi yapımcı baskı
	<ol>
<li>En az medya yapmak için 1 M K2HPO4, FeSO4·7H2O, sodyum sitrat ve 1 M tiamin ayrı çözümler hazırlamak-HCl. Sterilize 0,22 µm filtre kullanarak çözümler. M9 medya suyu tozu 1 litre DI su ile karıştırın. Otoklav 121 ° C'de 15 dakika süreyle M9 çözüm çözüm 50 ° c kadar serin MgSO4, CaCl2, K2HPO4, FeSO4·7H2O, sodyum sitrat ve tiamin son konsantrasyonları 2 mM, 0.1 mM, 12 g/L, 11 mg/L, 75 mg/L ve 7,5 µg/L, sırasıyla ekleyin.</li>
		<li>2'-zorlanma, örneğin, JM109 gwBC-F2, 5 ml LB medya üreten ve gecede 37 ° C'de Baumgartner vd.12' açıklandığı gibi büyümesine izin FL kültürünü başlatın.</li>
		<li>Alt kültür adım 1.3.3 250 mL 3.1.1. adımda hazırlanan en az medya daha önce açıklandığı gibi % 1. Gliserol 10 g/L son bir konsantrasyon ekleyin ve 37 ° C'de kültür kuluçkaya</li>
		<li>Kültür 0.5-0.7 OD600 ulaştığında, 0,5 mM ve laktoz 2 g/L. son bir konsantrasyon için son bir konsantrasyon izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) eklemek</li>
		<li>37 ° C'de sürekli sallayarak ile kuluçkaya ve kültürler için 24 h büyümeye izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2'-FL çıkarımı
	<ol>
<li>Gecede kültür steril 50 mL tüpler ve 15 dakika 900 x g , santrifüj aktarın.</li>
		<li>3.2.2 süpernatant atın ve Pelet DI su yeniden askıya alma. Yıkama adım kalan laktoz kaldırmak ve sonunda 5 mL DI su yeniden askıya almak için üç kez tekrarlayın.</li>
		<li>Hücre süspansiyon koşullar için 30 s darbeleri % 30 güçte bir sonicator kullanın. Buzda hücreler her zaman tutmak.</li>
		<li>Lysed hücreler için 2.000 x gde 25 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant kaldırmak, steril geçmek (örneğin, 0,22 µm) filtre ve analiz kadar 4 ° C'de saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Miktar ile Biyoalgılayıcı
	<ol>
<li>2'-FL biosensing hücre ve orta log fazı, bir kültürü aşılamak, hücre lysate eşdeğer tahmini 2'-FL kalibrasyon eğrisi 2.2 bölümünde açıklandığı gibi yapmak için kullanılan konsantrasyonları ile ikna etmek. Kalibrasyon çözümlenmesi için örnek olarak aynı ortamında gerçekleştirmek (örneğin, lysate hücre) dilutions 2'-FL denetimine ekleyerek (yani, Sigara-yapımcı) filtre uygulanan hücre Biyoalgılayıcı hücreleri inducing daha önce lysate.</li>
		<li>Örnekleri üzerinde bir Akış Sitometresi çalıştırın. Bir doz-yanıt eğrisi Floresans çıkış oligosakkarit konsantrasyon karşı komplo tarafından oluşturmak. Standartları yanıt hücreye lysate karşılaştırın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. seçici laktoz kaldırılması
Not: Biosensing hücreleri için laktoz duyarlıdır ve HMOs üzerinde laktoz seçmeli olarak algılamaya Biyoalgılayıcı için arzu edilir. Bir strateji çamaşır hücre 3.2 bölümünde anlatıldığı gibi yer alıyor. Üç diğer stratejileri aşağıda açıklanmıştır.
<ol><li>
Ticari saf β-galaktozidaz ile tedavi
	<ol>
<li>Liyofilize β-galaktozidaz 1000 (FCC laktaz) adet/ml, 1 mm MgCl2 dağıtılması veya ticari β-galaktozidaz çözüm kullanın.</li>
		<li>Gerekli enzim optimum konsantrasyonu belirlemek için bir inoculum 2'-FL biosensing hücrelerinin büyümesine ve 2 g/L laktoz ve 2.9 g / L 2' ile teşvik-orta log fazı Utirmek.</li>
		<li>100 µL kültürleri, β-galaktozidaz, en fazla 12 adet, değişken miktarda eklemek ve 37 ° C'de sürekli sallayarak ile bir gecede büyümek kültürler.</li>
		<li>Floresans 2.1 bölümünde açıklandığı gibi ölçmek ve en az enzim konsantrasyon belirlenerek sinyal istenilen zayıflama sağlanması için gerekli enzim optimum birimleri hesaplamak.</li>
		<li>24 h için yetiştirilen 2'-FL üreten hücrelere β-galaktozidaz optimum birimleri ekleyin ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya 3.3 bölümünde açıklandığı gibi 2'-FL titresi belirlemek için iletişim kuralı ile devam edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
LacZ + zorlanma ile ön arıtma
	<ol>
<li>Bir 25 mL kültür 2'-FL üreten baskı ve orta log fazı indüklenen bir kez başlatmak, 24 h 37 ° C'de kültür kuluçkaya.</li>
		<li>Bir E. coli BL21 aşılamak LB, kültürde (DE3) orta log fazı 37 ° C'de büyümeye ve kültür (2:1) 50 mL 24 h kültür ekleyin.</li>
		<li>37 ° C'de 3 h. devam et için 3,3 bölümünde açıklandığı gibi 2'-FL titresi belirlemek için iletişim kuralı ile kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Etanol ile laktoz Yağış Not: Bu bölümde Matsuki vd.12' den uyarlanmıştır.<ol>
<li>Bir 25 mL kültür 2'-FL üreten baskı ve orta log fazı indüklenen bir kez başlatmak, 24 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>% 100 etanol kültürüne, iki cilt Iyice çalkalayınız ve 4 h için 37 ° C'de kuluçkaya ekleyin.</li>
		<li>Süspansiyon 900 x g 15 dk. toplamak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve gecede 4 ° C, hangi laktoz precipitates kuluçkaya.</li>
		<li>Çöktürülmüş laktoz filtre kağıdı (11 µm) ile çözüme geçirerek kaldırın. Hücre 2'-hangi ile aşağıdaki bölüm 3.3 sayısal FL, içeren lysate filtrate toplamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ninonuevo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+strategy+for+annotating+the+human+milk+glycome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A strategy for annotating the human milk glycome.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 54 (20), 7471-7480 (2006).</li>
<li>Kailemia, M. J., Ruhaak, L. R., Lebrilla, C. B., Amster, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligosaccharide+analysis+by+mass+spectrometry%3A+a+review+of+recent+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Oligosaccharide analysis by mass spectrometry: a review of recent developments.</a> Analytical Chemistry. 86 (1), 196-212 (2014).</li>
<li>Royle, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+8+-+Glycans+and+Monosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Liquid+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Chapter 8 - Glycans and Monosaccharides.</a> Liquid Chromatography. , 185-202 (2013).</li>
<li>Shubhakar, A., Reiding, K. R., Gardner, R. A., Spencer, D. I. R., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Analysis+and+Automation+for+Glycomics+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chromatographia%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Analysis and Automation for Glycomics Studies.</a> Chromatographia. 78 (5-6), 321-333 (2015).</li>
<li>Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysaccharide+analysis+using+carbohydrate+gel+electrophoresis%3A+a+method+to+study+plant+cell+wall+polysaccharides+and+polysaccharide+hydrolases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: a method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases.</a> Analytical Biochemistry. 300 (1), 53-68 (2002).</li>
<li>Evangelista, R. A., Liu, M. -S., Chen, F. -T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+9-Aminopyrene-1%2C4%2C6-trisulfonate+Derivatized+Sugars+by+Capillary+Electrophoresis+with+Laser-Induced+Fluorescence+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of 9-Aminopyrene-1,4,6-trisulfonate Derivatized Sugars by Capillary Electrophoresis with Laser-Induced Fluorescence Detection.</a> Analytical Chemistry. 67 (13), 2239-2245 (1995).</li>
<li>Jiao, J., Zhang, H., Reinhold, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Performance+IT-MS+Sequencing+of+Glycans+%28Spatial+Resolution+of+Ovalbumin+Isomers%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">High Performance IT-MS Sequencing of Glycans (Spatial Resolution of Ovalbumin Isomers).</a> International Journal of Mass Spectrometry. 303 (2-3), 109-117 (2011).</li>
<li>Doherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+robotic+platform+for+rapid+profiling+oligosaccharide+analysis+of+monoclonal+antibodies+directly+from+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">An automated robotic platform for rapid profiling oligosaccharide analysis of monoclonal antibodies directly from cell culture.</a> Analytical Biochemistry. 442 (1), 10-18 (2013).</li>
<li>Hsu, H. C., Liew, C. Y., Huang, S. -P., Tsai, S. -T., Ni, C. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Method+for+De+Novo+Structural+Determination+of+Underivatised+Glucose+Oligosaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simple Method for De Novo Structural Determination of Underivatised Glucose Oligosaccharides.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5562(2018).</li>
<li>Mank, M., Welsch, P., Heck, A. J. R., Stahl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+targeted+LC-ESI-MS2+analysis+of+human+milk+oligosaccharides+%28HMOs%29+and+related+human+milk+groups+with+enhanced+structural+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Label-free targeted LC-ESI-MS2 analysis of human milk oligosaccharides (HMOs) and related human milk groups with enhanced structural selectivity.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 231-250 (2019).</li>
<li>Chai, W., Piskarev, V. E., Zhang, Y., Lawson, A. M., Kogelberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+determination+of+novel+lacto-N-decaose+and+its+monofucosylated+analogue+from+human+milk+by+electrospray+tandem+mass+spectrometry+and+1H+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Structural determination of novel lacto-N-decaose and its monofucosylated analogue from human milk by electrospray tandem mass spectrometry and 1H NMR spectroscopy.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 434 (1), 116-127 (2005).</li>
<li>Baumgärtner, F., Seitz, L., Sprenger, G. A., Albermann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Escherichia+coli+strains+with+chromosomally+integrated+expression+cassettes+for+the+synthesis+of+2%E2%80%99-fucosyllactose%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Construction of Escherichia coli strains with chromosomally integrated expression cassettes for the synthesis of 2’-fucosyllactose.</a> Microbial Cell Factories. 12 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Matsuki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+key+genetic+factor+for+fucosyllactose+utilization+affects+infant+gut+microbiota+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A key genetic factor for fucosyllactose utilization affects infant gut microbiota development.</a> Nature Communications. 7, 11939(2016).</li>
<li>Enam, F., Mansell, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linkage-Specific+Detection+and+Metabolism+of+Human+Milk+Oligosaccharides+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Linkage-Specific Detection and Metabolism of Human Milk Oligosaccharides in Escherichia coli.</a> Cell Chemical Biology. 25 (10), 1292-1303 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Biz insan sütü oligosakkaritler yüksek üretilen iş stratejisi fucosylated bağlantı özgü tespiti için mevcut. Bu genetik olarak E. coli , indüksiyon belirli glukanlardir ile floresan bir sinyal ile yanıt mühendislik tarafından tüm cep telefonu biyosensörler yapı tarafından gerçekleştirilmiştir. İletişim kuralı da nasıl Biyoalgılayıcı algılamak ve metabolik olarak tasarlanmış bir bakteriyel yük HMOs ölçmek için kullanılabilir Tarih ayrıntıları.
Bizim iletişim kuralı ek olarak kendi bağl...

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) genellikle 3-8 şeker monomerleri oluşan oligosakkaritler, laktoz kaynaklı vardır. Onlar bir Laktoz (Gal-β1, 4-Glc) sona azaltmak ve daha fazla glycosidic bağlantılarıyla uzamıştır (β-1,3 - veya β-1,6-) (Glc) glikoz, galaktoz (Gal) veya N-peptidoglikan (GlcNAc). Buna ek olarak, fucose (Fuc, α-1, 2 veya α 1,3-) veya sialik asit (SIA veya NeuAc, α-2, 3 veya α 2,6-) artıkları kez1eklendi.
Geçerli analiz oligosakkaritler ve diğer karbonhidratlar Kromatografik/kütle spektrometrik (MS) teknolojisi2,3,4,5, için ihtiyaç ile üretilen iş ve kapsam içinde sınırlıdır 6 , hangi-ebilmek almak kabaca 7, pahalı donanımları, özel sütun ve saptırma ajanlar ve uzmanlık Bu ekipman8operasyonunda bahsetmiyorum örnek başına bir saat. Oligosakkarit bağlantıları gerektiren Gelişmiş MS9,10 ya da Nükleer manyetik rezonans (NMR) teknikleri11belirlemek, özellikle zordur. Bu oligosakkaritler sentezi hızlı optimizasyonu böylece bu yavaş analitik adım işlem hacmi ile sınırlıdır.
Bu çalışmada, biz fucosylated trisaccharide tespiti bağlantı özgü göstermek laktoz tabanlı HMOs 2'-insan sütte en bol HMO olan fucosyllactose (2'-FL) odaklanan, genetik olarak kodlanmış kullanarak Escherichia coli tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı bir sınırı olan 4 mg/l, algılama Bu Biyoalgılayıcı önemli bir özelliği isomeric trisaccharides arasında ayırt etmek için onun yetenek var. Tasarım prensibi varlığı hangi sırayla bir floresan sinyali üretir lac operon tarafından algılanır laktoz HMOs, üzerinden kurtarmak belirli fucosidases E. coli olarak ifade temel alır. Biz bunu bir bağlantı özgü fucosidase ve diğer bir floresan muhabir protein barındıran bir iki-plazmid sistemi kurarak başarmak. Bu Biyoalgılayıcı platform yüksek üretilen iş tarama Akış Sitometresi veya mikro-plaka okuyucu için uygundur. Biz de 2'-FL bir mühendislik zorlanma12tarafından üretilen miktarının içinde Biyoalgılayıcı kullanımını göstermektedir. Verilen bu mühendislik yapımcı zorlanma laktoz üzerinde yetiştirilen bu çalışma içinde biz da üç stratejileri Biyoalgılayıcı yanlış olumlu sinyal sonuçlanabilir laktoz seçici kaldırılması üzerinde mevcut.
Birlikte ele alındığında, genetik olarak kodlanmış biyosensörler algılamak ve HMOs bile zor bir bağlantı özgü şekilde ölçmek için bize izin Kromatografik, MS veya NMR teknikleri. Onun yüksek işlem hacmi ve kullanım kolaylığı nedeniyle, bu yöntem yaygın uygulamalar metabolik Mühendisliği ve HMOs sentezi olmalıdır.

<table><tbody><tr><td>2'-Fukosillaktoz&nbsp;</td><td>Karbosynth&nbsp;</td><td>41263-94-9</td><td></td></tr><tr><td>3-Fukosillaktoz&nbsp;</td><td>Karbosynth&nbsp;</td><td>41312-47-4</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9744500</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür, Dihidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Karbenisilin ve nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP26481</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz (D-Glikoz), Susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometresi</td><td>BD</td><td></td><td>FACSCanto Plus RUO</td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>1100 Serisi HPLC sistemi</td></tr><tr><td>HPLC Kolonu</td><td>Luna</td><td></td><td>C18 ters faz kolonu</td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>11815024</tr><tr><td>LB Et Suyu, Değirmenci&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-795-027</td><td></td></tr><tr><td>Laktoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>64044-51-5</td><td></td></tr><tr><td>M9, Minimimal Tuzlar, 5x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6030</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum Sülfat, Susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td></td></tr><tr><td>MS</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Kütle Seçici Tuzak SL dedektörü</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr></tbody></table>

fucosylated insan süt trisaccharides genetik olarak kullanarak biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış

Analysis of Fucosylated Human Milk Trisaccharides in Biotechnological Context Using Genetically Encoded Biosensors

İnsan sütü oligosakkaritler (HMOs) bebek sağlığı üzerinde bol yararları sorun oluşturan kompleks karbonhidrat bileşenleri insan anne sütü vardır. Ancak, onların Biyoteknolojik sentez duruma getirilmesi nispeten düşük akış verimi, algılama ve miktar yaşam ve bağlantıları sınırlıdır. Glycan analiz geleneksel teknikleri ile geçerek örnekleri otomasyon olmadan günde yüzlerce sırasına Kromatografik/kütle-spektrometrik yöntemleri içerir. Biz burada, yüksek işlem hacmi, bağlantı özel algılama ve miktar fucosylated HMO yapıları, 2'-fucosyllactose ve 3-fucosyllactose, biz Contegra yoluyla elde için genetik olarak kodlanmış bir bakteriyel Biyoalgılayıcı göstermek fucosidases ifadesidir. Laktoz süt veya Biyoteknolojik süreçler varlığı için yanlış pozitif neden olabilir gibi aynı zamanda farklı stratejiler kullanarak laktoz sinyal azalma göstermektedir. Bu teknik en yüksek üretimi nedeniyle, birçok reaksiyon koşulları veya biyoreaktör parametrelerini paralel HMO üretim optimizasyonu için izin saatlik bir konuda denetlesinler.

Biz tüm cep telefonu Biyoalgılayıcı 2'-oligosakkarit Biyoteknolojik üretimi ile birlikte kullanılan FL için özel tasarlanmış. Bu terminal şekerler laktoz üreten değiştirmenin belirli enzimatik bölünme üzerinde dayanır ve böylece proportion için ifade bir Laktoz indüklenebilir organizatörü altında bir muhabir floresan proteinin önde gelen lac operon aktivasyonu 2'-FL miktarı Onun bağlantı özgüllük, 3-fucosyllactose (3-FL), bir izomer göstermek için de test edildi. Genetik devre ik...

Burada yüksek üretilen iş algılama ve fucosylated insan sütü oligosakkaritler (HMOs), tüm hücreli Biyoalgılayıcı kullanarak miktar açıklayın. Biz de burada, bu platform HMO üretim suşları, analizini doğru uyarlaması gürültü oranı sinyal geliştirmeye odaklanan göstermek.

Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış

Human milk oligosaccharides (HMOs) are complex carbohydrate components of human breast milk that exhibit plentiful benefits on infant health. However, ...

Bu yöntem insan sütü oligosakkaritüretimi ile ilgili birkaç anahtar soruların cevap yardımcı olabilir. İlk olarak, ürünün ne kadarı var? Ve ikincisi, spesifik karbonhidrat bağlantısı nedir?Burada amaç basitleştirmek ve bu insan sütü oligosakkaritler ölçme ve karakterize sürecini hızlandırmaktır. Bu yöntemin, geçerli son duruma göre iki avantajı vardır. İlk olarak, yüksek iş itimat taraması için uygun.Yani, binlerce farklı durumu ya da belki de bir sentez enzimleri kütüphanesini bir günde bu tekniği kullanarak test ettiğinizi hayal edebilirsiniz. Ayrıca, doğanın enzimlerde evrimleştiği eşsiz substrat özgüllüğünü kullanır ve bize bu oligosakkaritlerin karbonhidrat bağlantısı hakkında bilgi verir. Bu yöntemin insan sütü oligosakkaritüretimini artırabileceğine inanıyoruz, bu da insan anne sütünü daha yakından taklit eden ve anne sütüyle beslenen ve formülle beslenen bebekler arasındaki boşluğu kapatmaya yardımcı olan daha kaliteli bebek formülüne yol açabilir.Maliyet, iş maliyeti ve ekipman kullanılabilirliğine bağlı olarak laktoz giderme için hangi yöntemin kullanılacağına karar verirken kullanıcı takdiri önerilir. En iyi laktoz giderilmesini sağlamaya özen dilmelidir. Deneyden bir gü

analysis-fucosylated-human-milk-trisaccharides-biotechnological

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Bir ortamda askıya alınmış bakteriyel biyosensör kültürü ile başlayın.Bu mühendislik yapımı bakteriler, belirli bir fekal metabolite bağlandığında, floresan bir raporlayıcı geniyle ilişkili bir promotor aktifini aktive eden bir transkripsiyon faktörü üretir.Bu kültüre, konak-mikrobiyom etkileşimlerinde yer alan laktat gibi metabolitleri içeren filtrelenmiş bir insan dışkısı örneği eklenir.Bu karışımı taze bir ortamla seyrelterek optimal reaksiyon hacmini koruyun.İnsan bağırsak ortamını taklit...

Bakteriyel Biyosensör Kullanılarak İnsan Dışkı Metabolitlerinin Tespiti

In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.

Noninvaziv metabolik profil FIBS etkin

Küçük ölçekte mikrobiyal ekzopolisakkaritlerin tanımlanması ve karakterizasyonu için otomatikleştirilmiş modüler yüksek verimli bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, yeni izole edilen bakteri suşlarının veya tüm suş koleksiyonlarının hızlı bir şekilde taranmasını sağlamak için salgılanan polisakkaritlerin toplam miktarını ayrıntılı bir karbonhidrat parmak izi ile analiz etmek için hızlı bir ön seçimi birleştirir.

Otomatik Modüler Yüksek Verimli Ekzopolisakkarit Tarama Platformu Oldukça hassas Karbonhidrat Parmak İzi Analizi ile birleştiğinde

Bu protokol, ısmarlama bir taşınabilir FRET analizörü kullanarak Förster rezonans enerji transferi (FRET) sensörü verilerinin hızlı ve son derece hassas ölçümü açıklanır. Cihaz şeker içeriğinin pratik ve etkili bir değerlendirme sağlayan saptama hassasiyetini maksimuma kritik sıcaklık aralığında maltoz tespit etmek için kullanıldı.

Taşınabilir FRET Analyzer ile son derece hassas ve hızlı Floresan Algılama

Sialik asit glycoconjugates içinde bulunan tipik bir yaşam ünitesi var. Moleküler ve hücresel etkileşimlerin bir bolluk ilgilenmektedir. Burada hücre yüzey sialik asit ifadesi N- acetylmannosamine türevleri ile metabolik glycoengineering kullanarak değiştirmek için bir yöntem mevcut.

Sialik asit Nkullanarak metabolik Glycoengineering-asil-Mannosamines modifiye

Otomatik microbioreactors hasat hücre kültürü sıvı (HCCF) bir monoklonal antikor arıtma ve sonraki analizi için ayrıntılı bir protokol açıklanmıştır. Kritik kalite niteliklerini (CQAs) belirlemek ve önemli bilgileri ayıklamak için sınırlı numune hacmini maksimize etmek için analitiklerin kullanılması da sunulmaktadır.

Otomatik bir Mikrobioreactor sistemi kullanılarak Çin hamster yumurtlama hücrelerinden bir monoklonal antikor arıtma ve analitik

Daha önce glikanların proteinler üzerinde otomatik ve hızlı analizi için bir sistem geliştirilmiştir. Bu makale, biyofarmasötikler ve diğer glikokonjugat malzemelerdeki glikan yapılarını analiz etmekle uğraşanlar gibi geniş bir kullanıcı yelpazesi için optimize edilmiş "gliko-kalitatif analiz" protokolünü sunmaktadır.

Tam Otomatik Bir Sistem Kullanılarak Rekombinant Proteinlerin Hızlı Gliko-Kalitatif Değerlendirmesi

Son çalışmalar, insan bağırsak mikrobiyota enzimlerinin C-glikozitleri metabolize etmedeki rolünü vurgulamaktadır. Burada, bu C-glikozit metabolize edici enzimlerin yapısal ve enzimatik reaksiyon zincirlerini sistematik olarak karakterize etmek için analitik kimya tekniklerini (LC-MS/MS ve NMR) yapısal biyoloji yaklaşımlarıyla entegre eden kapsamlı bir metodoloji sunuyoruz.

İnsan Bağırsak Mikrobiyotasında C-Glikozit Metabolik Enzimlerinin Karakterizasyonu için Yapısal Biyoloji ve Analitik Kimya Yaklaşımları

Bu protokol, endüstriyel mikroorganizmalar için standart yüksek verimli tarama iş akışı sunar. ARTP mutagenezi yoluyla mutant bir kütüphane oluşturmayı, otomatik mikrofluidiklerle pozitif damla taraması yapılmasını ve ardından sonuçların doğrulanmasını içerir. İş akışının güvenilirliği, yüksek verimli B. coagulans suşlarının taramasıyla doğrulandı.

L-laktik asit aşırı üreten Bacillus coagulans mutantlarının yüksek verimli taraması otomatik damla mikrofluidik platform kullanılarak

Öğrenin, genetik olarak kodlanmış biyosensörler kullanarak fukozillenmiş insan sütü oligosakkaritlerinin yüksek verimli tespit ve nicelendirme yöntemini. Bu yaklaşım, HMO analizini basitleştirir ve hızlandırır.

Fucosylated insan süt Trisaccharides genetik olarak kullanarak Biyoteknolojik bağlamda analizini biyosensörler kodlanmış

Daha fazla video keşfet