Çift oküler sulkus görselleştirme Danio rerio embriyogenez sırasında

Bu standart protokoller kümesi, gelişmekte olan gözün yakın zamanda keşfedilen yapısı olan üstün oküler sulkus veya SOS'a yeni bir bakış açısı sunmak için kullanılabilir. Bu protokoller, dünyanın dört bir yanındaki herhangi bir deneycinin zebra balığı göz gelişimi sırasında SOS'u net bir şekilde görselleştirmesini sağlayacaktır. Heterozigot büyüme farklılaşma faktörü altı Bir erkek ve dişi zebra balıklarını, eşleştirmelerinden önceki akşam klorsuz su tankına bölücünün ayrı kenarlarına yerleştirerek başlayın.

Ertesi sabah, bölücü kaldırın ve en fazla 30 dakika boyunca balık üremek için izin verin. Üreme döneminin sonunda, 28,5 derece kuluçka kuluçka onların kuluçka için E3 orta içeren Petri yemekleri içine embriyotoplamak. 20 saat sonra döllenme sonrası, pigment üretimini önlemek için e3 orta takviyeli 0.004%1-Fenil-2-tiourea ile supernatant değiştirin ve uygun gelişim aşamasında olduklarını doğrulamak için ışık mikroskobu ile embriyoları incelemek.

Örnekleri bir kesme mikroskobu altına yerleştirin. Herhangi bir gelişimsel olgunlaşmamış embriyoatın ve yavaşça chorions çekmek için ince çalgılar kullanın. Gözün dorsal kenar boşluğunda bir girintinasyon veya çizgi olarak görünebilecek SOS'u görselleştirin.

Daha sonra, SOS kapatma gecikmesi gösteren embriyoları olmayanlardan sıralayın. Bir diseksiyon mikroskop kullanarak bu embriyoların fotoğraflamak için, E3 ortamda% 1 agarose içeren bir Petri çanak hazırlamak ve hafifçe embriyo sarısı yerleştirilebilir sığ bir delik oluşturmak için agarose merkezi dikmek. Sonra, agarose üzerine yanal bir anestezi embriyo yerleştirin.

Bir bileşik veya konfokal mikroskop kullanarak embriyogörüntü için, olmayan jellenmiş olmayan% 1 düşük erime noktası agarose küçük bir bolus içeren 35 milimetre petri çanak içine bir embriyo transferi ve hızlı bir şekilde yanal pozisyonda embriyo konumlandırmak için ince balıkçılık hattı kullanın. Agarose soğuduğunda, agarose'u örtecek kadar E3 ortasını tabağa dökün ve SOS'u görselleştirmek için 20 x su daldırma objektiflenskullanın. Görüntülemeden sonra, yavaşça embriyo dan agarose çekin ve% 4 paraformaldehit doku düzeltmek veya zebra balığı gelişimini devam etmesine izin.

Floresan mRNA ekspresyonu ile SOS'u görselleştirmek için, tek hücreli aşamada embriyolara 300 pikogram geliştirilmiş GFP-CAX mRNA enjekte etmek için bir mikroenjeksiyon cihazı kullanın. Daha sonra, parlak gelişmiş GFP ifadesi ile embriyolar için ekran ve gösterildiği gibi görüntüleme yöntemlerinden biri ile embriyoların görüntüleri elde etmek için bir floresan stereoskop kullanın. Embriyonik zebra balığı laminasının tam monte immünororesan boyama için, gösterildiği gibi embriyolar dekorionate ve taze hazırlanmış bir mikrosantrifüj tüp embriyolar düzeltmek 4% paraformaldehit bir oda sıcaklığında shaker iki saat boyunca.

Fiksasyon sonunda, embriyoları pbs artı Tween veya PBST'de dört kez yıkayın, yıkama başına beş dakika boyunca mililitre başına 10 mikrogram permeabilizasyon veya oda sıcaklığında Proteinase K beş dakika boyunca permeabilizasyon. Permeabilize embriyoları PBST'de gösterildiği gibi dört kez yıkayın ve embriyoları %5 keçi serumunda ve PBST'de mililitrebaşına iki miligramlık büyükbaş serum albumini oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca bloke edin. Bloke kuluçka sonunda, bir shaker bir gecede dört derece santigrat ilgi birincil anti-laminin antikor embriyolar kuluçka.

Ertesi sabah, embriyoları PBST'da beş kez yıkayın ve dokuları bir gecede ışıktan korunan sarsıcıda dört derece santigrat derecede uygun bir ikincil antikorla etiketleyin. Ertesi sabah, embriyoları PBST'de dört kez yıkayın ve embriyoları taze PBST içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin. Ince forceps kullanarak, yavaşça sarısı bozabilir ve sarısı keseleri hafif kazıma yoluyla sarısı hücreleri çıkarın.

Deyolked embriyolar yeni hazırlanmış içine transfer 30% PBS gliserol, çözeltinin üstüne embriyolar yerleştirmek için emin olun ve mümkün olduğunca önceki çözeltinin çok az transfer ve tüplerin altına batmak için embriyolar için bekleyin. Embriyolar konteynerin altına ulaştığınızda, sıralı transfer 50%ve 70% PBS çözümleri, sadece gösterildiği gibi. Embriyolar% 70 gliserol konteyner altına battı sonra, diseksiyon için küçük bir plastik çanak örnekleri transfer ve arka beyinlere embriyolar arka sever.

İnce diseksiyon araçları kullanarak, mümkün olduğunca az gliserol ile cam bir slayt için bir baş hareket ve yavaşça iç ön beyin ventrikül içine ince bir minutien pin takın, aşağı doğru birbirinden başın sağ ve sol yarısı ayırmak için iterek. Kafa tamamen orta hattan aşağı filetolanmış olduğunda, başın her iki tarafını da aşağı, göz tarafı yukarı doğru monte edin. SOS, döllenme sonrası 20 ila 23 saat döllenme sonrası diseksiyon mikroskobu ve gelişmekte olan retinanın burun ve temporal yarılarını ayıran dorsal gözde ince bir çizgi olarak diferansiyel girişim kontrast görüntüleme yoluyla gözlemlenebilir.

Buna ek olarak, ince bir girintisi gözün dorsal sınırında görülebilir. Laminin immünofloresan boyama sonra, ince çizgi bazal membran olarak teyit edilebilir. SOS kapanması geciktiğinde, uzun süreli varlığı, diseksiyon mikroskobu altında gözün dorsal tarafında belirgin bir yarık olarak görülebilir.

Diferansiyel girişim kontrast görüntüleme kullanılarak bileşik mikroskop altında gözlendiğinde, bu özellik, gözün burun ve temporal yanları SOS ile ayrılmış, dorsal gözde bir çizgi olarak açıkça görülebilen ile daha da belirgindir. Yabani zebra balıklarında gübreleme sonrası 28 saat ile laminin boyama, SOS'un tamamen kapalı olduğunu açıkça göstererek, çatlak kapatmadaki gecikmeleri izlemek için ideal bir aşama dır. Gelişmiş GFP-CAX mRNA enjeksiyonu, SOS'un kapanmasına yol açan hücrelerin morfolojisindeki değişiklikleri izlemek için canlı veya sabit embriyonun hücre zarlarının görüntülenmesine olanak tanır.

SOS'u görselleştirmek, dar ve geçici olduğu için zor olabilir. Ancak, kapatma gecikmelerini daha sonraki zaman noktalarında değerlendirirken tutarlı bir puanlama yöntemi ni korumanız zorunludur. Bu teknikler, uygun SOS oluşumunu ve kapanmasını etkileyen genetik faktörleri veya farmakolojik ajanları belirlemek için deneysel manipülasyonlarla birleştirilebilir.