Mitokondrial solunum zinciri kompleksleri kültürlü insan hücrelerinde mavi yerli Polyacrylamide Jel Elektroforez ve Immunoblotting kullanarak Analizi

Mavi yerli poliakrilamid jel elektroforez mitokondriyal oksidatif fosforilasyon sisteminin in-tact komplekslerinin analizini sağlar. Mitokondriyal oksidatif fosforilasyon sisteminin tüm komplekslerinin montajı için kullanılabilecek kullanışlı ve ucuz bir tekniktir. Mitokondriyal lysates hazırlamak için, ilk olarak hücreleri bir kez hafifçe yıkamak için buz gibi PBS çözeltisini kullanın.

Hücreleri kazıyın ve 10 dakika boyunca 800 G'de 4 derecede peletleyin. Daha sonra hücre peletini buz gibi PBS ile iki kez yıkayın ve 800 G'de dört derece santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin. Daha sonra, 20 mililitre PBS'ye 200 mikrolitre 100x proteaz inhibitörü ekleyin.

Mililitre başına beş miligram lık son protein konsantrasyonuna PBS proteaz inhibitörü karışımındaki hücreleri yeniden askıya alın. Proteaz inhibitörü ile PBS'de 3.3 milimolar digitonin hazırlamak için, hiçbir çökelti görülene kadar 100 santigrat derecede bir mililitrede dört miligram digitonin eritin. Hemen buz üzerinde soğutun ve digitonin çözeltisinin bir mililitresine 10 mikrolitre 100x proteaz inhibitörü ekleyin.

Sonra, 1.65 milimolar son konsantrasyonunda hücrelere digitonin proteaz inhibitörü karışımı ekleyin. İyibir şekilde karıştırın ve beş dakika boyunca buzda kuluçkaya yat. Daha sonra, 1.5 mililitre son hacmine hücrelere PBS proteaz inhibitör karışımı ekleyin.

10, 000 G'de 10 dakika 4 santigrat derecede santrifüj. Supernatant çıkarın ve mitokondriyal tampon mitokondriyal pelet yeniden askıya. PBS inhibitör çözeltisinde bir mililitre taze %10 loreal hazırlayın.

En az 15 dakika boyunca buz üzerinde% 1 incubate son konsantrasyonunda mitokondri monte% 10 loreal ekleyin. Santrifüj 20, 000 G'de 20 dakika 4 santigrat derecede. Yeni bir tüp içine supernatant toplamak ve örnek tampon ekleyin.

Degrade jeli mavi yerel sayfaya hazırlamak için, önce degrade üreticisini bir karıştırma plakasına yerleştirin ve peristaltik pompaya esnek bir boru ile bağlayın. Boruya iğne ile bir infüzyon seti takın. Degrade üreticisinin proksimal odasına manyetik bir karıştırıcı yerleştirin ve 10 dakika boyunca maksimum pompa hızında damıtılmış su ile tüp yıkayın.

Sonra, boruyu ve degradeyi boşaltın. Degrade üreticisinin odaları arasındaki kanalda kalan distile suyu çıkarmak için bir pipet kullanın. Vana ile kanalı ve boruyu kapatın.

Tutucuda iki cam plaka monte edin ve standın üzerine yerleştirin. Jel tutucunun altındaki deliği kullanarak, iğneyi cam plakalar arasındaki boruya bağlayın. 8.3 by 7.3 santimetre jel yapmak için, ilk hazırlamak 6%ve 15% jel çözümleri ve buz üzerinde tutmak.

Hava kabarcıkları yapmaönlemek için yavaşça karıştırın. Daha sonra, %6 jelin 2,6 mililitre ve %15'in 2,1 mililitre distal ucu ile degrade jel mikser boru haznesinin proksimal ucunu yükleyin. Daha sonra, manyetik karıştırıcıyı açın ve degrade vericinin odaları arasındaki boruyu ve kanalı açın.

Peristaltik pompayı hemen dakikada beş mililitreye çıkarın. Cam plakaları doldurun ve tüphiçbir jel olduğunda iğne çıkarın. Jeli distile suyla hafifçe örtün ve jeli en az bir saat oda sıcaklığında tutun.

Degrade odaları damıtılmış suyla doldurarak ve peristaltik pompayı maksimum hızda kullanarak boruyu hemen yıkayın. 1x jel tampon yapmak için 3x jel tampon üç mililitre distile su altı mililitre ekleyin. Bir filtre kağıdı ile, jel yüzeyinden yavaşça distile su çıkarın.

Jelin yüzeyini 1x jel arabellekile yıkayın ve filtre kağıdıyla tamponu nazikçe çıkarın. El yazmasına göre %4 istifleme jeli hazırlayın. Hava kabarcıkları yapma önlemek için hafifçe karıştırın.

Sonra, cam plakalar arasında tarak yerleştirin ve tarak altında istifleme jeli dökün. Taramayı tamamen batırın. Istifleme jeli en az 30 dakika polimerize edelim.

Sonra, tarak çıkarın ve 1x jel tampon ile kuyuları yıkamak için bir pipet kullanın. Mavi yerli jel elektroforez gerçekleştirmek için, ilk, jel kaset mavi katot tampon ekleyin. Yıkamak ve mavi katot tampon ile kuyudoldurmak için bir pipet kullanın.

Daha sonra, kuyulara 5-30 mikrogram protein örneği yükleyin. Jel kaseti mavi katot tamponu yla üste, tankı da anovar tamponuyla yavaşça doldurun. İlk olarak, 15 dakika boyunca 40 volt sabit bir voltajda jel çalıştırın.

Daha sonra voltajı 80 volta yükseltin. Boya jel uzunluğunun 2/3'üne ulaşana kadar jeli çalıştırın. Mavi katot tamponunu katot tamponuyla değiştirin ve boya ön jeli çalıştırana kadar elektroforezdevam edin.

Cam plakaları alın ve proteinleri yarı kuru blotlama ile PVDF membranına aktarın. 30 dakika boyunca 25 volt sabit voltaj ve bir amper ile sınırlı bir akım kullanın. İnsan nöroblastom hücrelerindeki solunum zinciri komplekslerinin montajı kloramfenikol tedavisi ile tedavi edilmeden kontrol hücrelerine karşı inhibe edildi.

Buna karşılık, nükleer genler tarafından kodlanmış kompleksler up-regüle edildi. Oksidatif fosforilasyon komplekslerinin bozulması birden fazla donma-çözülme döngüsünde gözlendi. Jel kalitesi oksidatif fosforilasyon komplekslerinin tespitini etkileyebilir.

Ayrıca, membran sıyırma sinyal-gürültü oranını düşürdü. Prosedürü gerçekleştirirken, soğuk koşullarda basit bir hazırlık ve jel elektroforez yapmak için in-tact OXPHOS kompleksleri korumak için hatırlamak önemlidir. Mavi yerel sayfanın ardından, solunum zinciri komplekslerinin protein alt birimlerini incelemek için ikinci bir boyut SDS sayfası uygulanabilir.

Mavi yerli sayfa araştırmacılar kompleksleri ve hatta oksidatif fosforilasyon sisteminin süper kompleksleri montaj çalışma sağlar.