Name: Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta oksijen tüketim oranlarını ölçerek mitokondriyal fonksiyonu canlı organizmalarda nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, mitokondri izolasyonuna gerek kalmadan daha doğru biyolojik veri sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar laboratuarda Seahorse XFp kurulmasında onun rehberlik için Dr. Kevin Bittman kabul etmek istiyorum. Ulusal Sağlık Enstitüleri GM088213 Bu eser desteklenen verin.

Not: Resim 2 tam protokolü, şematik bir genel bakış sağlar.
1. büyüme ve eşitleme nematodunun nüfus9,10
<ol><li>İstenen genetik arka L4 larva transferi (örneğin, N2 [vahşi türü] ve sel-12 hayvan) taze bir çim Escherichia coli (OP50)11numaralı seribaşı (bkz. Tablo 1 için reçete) nematodunun büyüme medya (NGM) plakalar üzerine. En az iki 100 mm veya üç 60 mm plakalar için her zor kullanın. Solucanlar (15-25 ° C arasında) uygun büyüme sıcaklıkta 3-4 gün ya da çok sayıda yumurta ve gravid solucanlar konsantre tabaklara kadar kuluçkaya.</li>
	<li>Yumurta ve solucanlar yaklaşık 6 mL M9 arabelleği kullanarak plakaları kapalı yıkayın (bkz. Tablo 1 için reçete) nematod ve transfer 100 mm plaka onlarla bireysel 15 mL santrifüj tüpleri her zorlanma için içine Pasteur Pipetler cam. Bu tüpler iyi spin aşağı 3 dk 6,180 x g ve aspiratı sadece hayvan ve yumurta Pelet istinat M9 arabellek dışarı az için.</li>
	<li>3-4 mL çamaşır suyu çözeltisi ekleyin (bkz. Tablo 1 için reçete) her tüp ve zaman zaman her tüpün doldurun ve 6,180 x g 1 dk. için de spin ve süpernatant Aspire edin 6 dk. eklemek M9 arabellek için girdap. Bu yıkama M9 ile üç kez tekrarlayın ve yumurta Pelet yaklaşık 9 mL M9 arabelleği içeren bir taze 15 mL tüp taşıyın.</li>
	<li>Taze taranmış solucanlar tarafından 16-48 h. Spin için 20 ° C'de nutating bu tüpler aşağı 6,180 x g 1.5 dakika, eşitleme ve taze OP50 çim ile seribaşı bireysel NGM plakalar üzerinde eşitlenmiş L1 hayvanlar indirdi (yaklaşık 100 mm plaka başına 6.000 – 10.000 hayvanlar) ve 20 ° C'de tutmak</li>
	<li>Bu hayvanlar L4 larva sahne ~ 42 h sonra ulaşacak. Şu anda, OP50 için Platin bir pick kullanarak L4 larva numaralı seribaşı NGM hareket 0,5 mg / mL 5-fluoro-2' içeren kaplamalar-deoxyuridine (FUdR) onları döl üreten önlemek için. Not: bir deney içinde benzer bir miktar için tüm suşların eşzamanlı olduğundan emin olun. FUdR tedavi hayvanlar sterilizes ve OCR etkileyen yumurta döşeme ve döl üretimi, engeller. Bu sterilize edilmiş hayvanlar tahlil için ertesi gün (gün 1 Yetişkin Hayvanlar ~ 66 h) analiz edilecek. FUdR fizyolojisi ve mutant bazı solucanlar ömrü çarpışmaya bildirilmiştir. Bu nedenle, ilaç sterilizasyon12,13,14için kullanıldığında bu dikkate alınmalıdır. Worms da mutasyonlar fem-1(hc17) veya fem-3(e2006) gibi feminizing yöntemle sterilize. Ancak, bu mutasyonlar mitokondriyal işlev etkisi olabilir.</li>
</ol>2. bileşikleri enjekte edilir ve sondalar hidrasyon hazırlanması
Not: çalıştırmak tahlil sırasında her iki Bazal ve maksimal solunum oranları nematodlar ölçülür. Maksimal solunum bir mitokondri zar potansiyel rahatsız ediyor uncoupling ionophore ve böylece proton taşıma tarafından ATP sentezi üzerine karbonil siyanür-4 (trifluormethoxy) phenylhydrazone (FCCP), ayrıca hayvanlarda tetiklenir Mitokondrial membran proton pompalama, izin verirken elektron taşıma ve oksijen tüketimi4,15 devam etmek için ATP sentezi (şekil 1) edilişi. Sodyum azid (NaN3), ek tahlil son adımında içerir kompleksleri IV ve V bir sigara mitokondrial solunum16 (şekil 1) belirlemek vererek vb engeller bir ilaç. Aşağıdaki adımları gerçek tahlil Çalıştır önceki gün gerçekleştirilebilir.
<ol><li>1 mL FCCP hisse senedi çözümler hazırlamak (Dimetil sülfoksit [DMSO] 10 mM: 1000 x son tahlil konsantrasyon) ve NaN3 (dH2O: 10 son tahlil konsantrasyonu x 400 mM) ve mağaza-20 ° C'de Not: FCCP konsantrasyonu optimize etmek için bir konsantrasyon eğrisi maksimal OCR yanıt her enstrüman ve laboratuvar ayarı için temin için gerekli çalıştırın.</li>
	<li>Sensör kartuş dH2O 200 µL plaka içinde her şey (ve çevresindeki rezervuar) probları dH2O ve oda sıcaklığında gecede store batık sensör sağlamak ekleyerek hidrat. Not: probları yaptı kartuşu en fazla 72 saat için batık ama uzun süreli bir hidrasyon söz konusu olduğunda, tabakları olmalı parafin filmde sarılmış ve 4 ° C'de depolanan Gecede hidrasyon mümkün değilse, sensör kartuşu en az 4 h önce tahlil için sulu.</li>
	<li>Respirometer arayüzü içinde ısıtma elemanı kapatmak ve enstrüman hayvanlar çalıştırmak tahlil sırasında ısınmasını engellemek için araç içinde alt ısısı için gecede 15 ° C İnkübatör içinde saklayın. Not: Respirometer bir ısıtma elemanı ile donatılmış ancak soğutmalı olamaz. 15 ° C İnkübatör içinde respirometer C. elegans bakım için sağlıklı bir sıcaklığı 18-22 ° C arasında istikrarlı bir sıcaklık vardır.</li>
</ol>3. ilaç yükleme ve kartuş denge
<ol><li>Pipet dışarı ve2sensör hidrat için kullanılan O probları ve her şey calibrant çözümün (pH 7,4) 200 µL onun yerine dH atın. 100 µM FCCP dH2O FCCP hisse senedi çözümü sulandırmak ve seyreltilmiş çözeltinin 20 µL sensör kartuş enjeksiyon bağlantı noktası A ekleyin. 400 mM sodyum azid 22 µL Senyor kartuş B noktasına ekleyin.</li>
	<li>Respirometer açmak ve ana ekran seçin başlatmak; şablonları sayfası görünür. Şablonları sayfasında, boş ya da önceden tasarlanmış şablon seçin; Gruplar sayfası görünür. Gruplar sayfasında, kuyu A ve H arka plan wells seçin ve kalan 6 kuyu deneysel planına göre uygun gruplara atayın.</li>
	<li>Protokolü sayfasına gitmek için alt sağ köşesindeki oku itin. Protokolü sayfasında Equilibrate, Bazal ve iğne 1 ve 2 düğmeleri seçili olduğuna emin olun. Bu sayfada, (sonra enjeksiyon 1 FCCP ile) Bazal OCR yanı sıra maksimal OCR Okunma Sayısı ve mitokondrial sigara ayarlamak OCR (sonra enjeksiyon 2 sodyum azid ile). Not: Bir karması göre her ölçüm öncesinde ve bekle adım ve bu parametrelerin zaman dilimlerini Tablo 2' de gösterilmiştir.</li>
	<li>Sağ alt köşesindeki oku seçin ve sensör kartuş plaka yüklemek için bir ileti kutusu gösterilir. Sensör kartuş plaka hatırlatma istemi ekrandaki yönergeleri izleyerek doğru yönde yüklü emin olun. Respirometer şimdi kartuş equilibrate. Not: Bu denge hayvanlar hücre plaka uygun kuyu denetlesinler yerleştirmek için yeterli zaman sağlar.</li>
</ol>4. solucan plaka ve çalıştırmak tahlil hazırlanması
<ol><li>M9 arabelleği 200 µL her hücre plaka 8 Wells ve kuyular çevreleyen rezervuar içine ekleyin.</li>
	<li>~ 100 solucanlar her zorlanma seribaşı NGM plakalar üzerine almak ve 2-3 dk. ıslak Platin çekme sonu M9 arabellek ile dinlenme ve 20 yaş senkronize hayvanlar B-G arka plan kuyu A ve H boş bırakmak, kuyu almak için izin. Not: yükledikten sonra her şey, yaklaşık 2 dak hayvanlar kuyu dibine yerleşmek izin için sabırsızlanıyorum. Bir solucan numara eğrisi solucan numarası her enstrüman ve laboratuvar ayarı için iyi başına en iyi duruma getirmek için çalıştırılması önerilir.</li>
	<li>Artık, respirometer kalibre ve yanında tıkırtı üstünde belgili tanımlık perde Tamam , kalibrasyon tampon içeren plaka çıkarılır ve sensör kartuş alet içinde kaldığı sürece respirometer--dan-ebilmek var olmak çıkarmak. Calibrant plaka hayvanları içeren plaka ile değiştirin. Plaka yüklemek ve devam basarak kapıyı kapat ve tahlil çalıştırmak izin verir.</li>
</ol>5. sonrası deneme veri analizi
<ol><li>Tahlil çalışma tamamlandıktan sonra ekrandaki yönergeleri izleyin ve hücre plaka ve sensör kartuşu çıkarın ve bir flash sürücü çalışma veri bırakılamayacak biçiminde kaydetmek için USB bağlantı noktasına takın. Sensör kartuşunu çıkarın ve yaklaşık 2 dk. yerleştirmek için hücre plakaları bir stereo diseksiyon mikroskop altında kuyu dibine halletmek ve hayvan başına iyi saymak hayvan izin.</li>
	<li>Analiz yazılımı bilgisayarda açın ve OCR hayvan sayıya normalleştirmek için normalleştirme sekmesini açın. Değiştir sekmesinin altındaki çeşitli grupları için uygun etiketleri uygulamak ve dosyayı daha ayrıntılı bir çözümleme için prizma dosyası olarak verin. Not: İlk beş ölçümlerin FCCP ilavesi FCCP ektir maksimal OCR sonra beş ölçümlerin ortalama süre Bazal OCR olmadan ortalama ve ortalama (en az iki ölçüm yapılmalıdır) son beş ölçümler Sodyum azid Ayrıca sigara mitokondrial solunum hızı sonra. Tahlil tekrarlanabilirlik emin olmak için üç kez yinelenmelidir.</li>
</ol>

<ol><li>Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNelson%2C+DL+%22Lehninger+Principles+of+Biochemistry%22">Lehninger Principles of Biochemistry</a>. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).</li>
<li>Marchi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+and+endoplasmic+reticulum+calcium+homeostasis+and+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death.</a> Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).</li>
<li>Sarasija, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+mutations+deregulate+mitochondrial+Ca%282%2B%29+homeostasis+and+metabolic+activity+causing+neurodegeneration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Luz, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Morphology+and+Fundamental+Parameters+of+the+Mitochondrial+Respiratory+Chain+Are+Altered+in+Caenorhabditis+elegans+Strains+Deficient+in+Mitochondrial+Dynamics+and+Homeostasis+Processes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes.</a> PLoS One. 10, e0130940(2015).</li>
<li>Ryu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urolithin+A+induces+mitophagy+and+prolongs+lifespan+in+C.+elegans+and+increases+muscle+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents.</a> Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).</li>
<li>Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+assessing+mitochondrial+function+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Methods for assessing mitochondrial function in diabetes.</a> Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).</li>
<li>Schulz, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+restriction+extends+Caenorhabditis+elegans+life+span+by+inducing+mitochondrial+respiration+and+increasing+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress.</a> Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).</li>
<li>Koopman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+screening-based+platform+for+the+assessment+of+cellular+respiration+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Mitochondrial+Structure+in+the+Body+Wall+Muscle+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+ROS+in+Caenorhabditis+elegans+Using+a+Reduced+Form+of+Fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein.</a> Bio-protocol. 8, (2018).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).</li>
<li>Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+FUdR+can+cause+prolonged+longevity+in+mutant+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+5%27-fluoro-2-deoxyuridine+on+mitochondrial+biology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Effects of 5'-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).</li>
<li>Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FUdR+causes+a+twofold+increase+in+the+lifespan+of+the+mitochondrial+mutant+gas-1%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).</li>
<li>Heytler, P. G., Prichard, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+uncoupling+agents--carbonyl+cyanide+phenylhydrazones%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new class of uncoupling agents--carbonyl cyanide phenylhydrazones.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).</li>
<li>Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+the+metabolic+inhibitor+sodium+azide+induces+stress+protein+expression+and+thermotolerance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stress+Chaperones%22%5BJournal%5D)">Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).</li>
<li>Levitan, D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+lin-12-mediated+signalling+by+sel-12%2C+a+Caenorhabditis+elegans+S182+Alzheimer%27s+disease+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer's disease gene.</a> Nature. 377, 351-354 (1995).</li>
<li>Sherrington, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+a+gene+bearing+missense+mutations+in+early-onset+familial+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer's disease.</a> Nature. 375, 754-760 (1995).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+mitochondrial+Ca2%2B+in+the+regulation+of+cellular+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics.</a> Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).</li>
<li>Sarasija, S., Norman, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gamma-Secretase+Independent+Role+for+Presenilin+in+Calcium+Homeostasis+Impacts+Mitochondrial+Function+and+Morphology+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 201, 1453-1466 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev anlayışlı bir göstergesidir; Bu nedenle, tüp bebek veya içinde vivo biyolojik bir sistemde, oksijen tüketim oranları ölçmek için güçlü olmak son derece değerlidir. Respirometers oksijen ya da oksijen basıncı için elektrikli bir geçerli orantılı nesil itimat amperometric oksijen sensörler yoluyla su porfirin tabanlı fosforun kullanarak oksijen düzeyleri hissediyorum. Clark elektrot ikinci kategoriye giriyor ve özellikle solunum C. elegansiçinde analiz edilirken literatürde...

Adenozin trifosfat (ATP), ana kaynağı hücresel enerjinin mitokondri içinde iç mitokondrial membran bulunan enzimler elektron taşıma zinciri (vb) tarafından üretilmektedir. Pyruvate, mitokondriyal ATP üretimi için kullanılan bir anahtar metaboliti Dekarboksile asetil koenzim A (CoA) üretmek için nerede mitokondrial matris alınır. Daha sonra asetil CoA, sitrik asit döngüsü Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH), bir anahtar elektron taşıyıcı molekül üretimi kaynaklanan girer. NADH elektron oksijen vb geçerken proton mitokondriyal intermembrane alanı olan bir elektrokimyasal gradyan üretimi membran arasında sonuçlar kurmak. Bu proton sonra intermembrane uzaydan bu elektrokimyasal degrade boyunca sürüş onun rotasyon ve ATP1 (şekil 1) sentezi ATP sentaz proton gözenek aracılığıyla mitokondrial matris içine geri akacaktır.
Mitokondriyal işlev enerji üretimi için sınırlı değildir ama aynı zamanda kalsiyum Homeostazı, Reaktif oksijen türleri (ROS) atma ve apoptosis, eleştirel onların işlevi organizmalar sağlık2' konumlandırma için çok önemlidir. Mitokondriyal işlev dahil ancak bunlarla sınırlı mitokondri zar potansiyel ölçmek analizleri, ATP ve ROS düzeyleri ve mitokondrial kalsiyum konsantrasyonları değil deneyleri, çeşitli kullanılarak değerlendirilebilir. Ancak, bu deneyleri mitokondriyal işlev tek bir görüntüsünü sağlar ve bu nedenle mitokondrial sağlık kapsamlı bir görünümünü sağlamayabilir. ATP üretimi sırasında oksijen tüketimi sıralı reaksiyonlar çok sayıda bağımlı olduğundan, mitokondriyal işlev üstün bir göstergesi olarak hizmet vermektedir. İlginçtir, oksijen tüketim oranları değişimler sonucunda mitokondrial disfonksiyon3,4,5gözlemledim.
Oksijen tüketim oranları (OCR) yaşayan örnekleri ölçülen genel olarak iki gruba ayrılabilir teknikleri kullanarak: amperometric oksijen sensörler ve oksijen6tarafından giderdikten porfirin tabanlı fosforun. Amperometric oksijen sensörler kapsamlı bir şekilde ölçmek OCR kültürlü hücreler, dokular ve C. elegansgibi modeli sistemlerinde kullanılmaktadır. Ancak, porfirin tabanlı fosforun respirometers içeren aşağıdaki avantajlara sahip: (1) onlar izin için bir yan yana karşılaştırma iki nüsha, örnekleri (2) onlar daha küçük örnek boyutu gerektirir (örneğin, 000 ~ 2, 000−5, karşı iyi başına 20 solucan solucanlar odası)7ve (3) respirometer adlı dört farklı bileşik enjeksiyon yapmak için programlanmış kez el ile uygulama ihtiyacını ortadan kaldırarak deneysel çalışma boyunca istenilen.
Bu protokol için bir porfirin tabanlı oksijen algılamalı respirometer ölçüde canlı, bozulmamış C. elegans OCR için kullanmakla ilgili adımlardır açıklanan. Geniş format, yüksek işlem hacmi respirometer8, kullanımı için yazılı bir protokol ise bu iletişim kuralı bir daha fazla bütçe dostu, erişilebilir ve daha küçük ölçekli aleti ile kullanmak için adapte edilmiştir. Bu iletişim kuralı OCR nerede yüksek üretilen iş tarama gerekli değildir ve kullanımı aşırı olurdu iki suşlar arasındaki farkı değerlendirmek için özellikle yararlıdır.

<table><tbody><tr><td>100 mm, 60 mm Petri kapları</td><td>Kord-Valmark Labware Ürünleri</td><td>2900, 2901</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL santrifüj tüpleri</td><td>Globe Scientific</td><td>6285</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>22 > 22 mm lamel</td><td>Globe Scientific</td><td>1404-10</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1423-2</td><td></td></tr><tr><td>Bacto pepton</td><td>BD, Bacto</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto tripton</td><td>BD, Bacto</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Bacto maya özü</td><td>BD, Bacto</td><td>212705</td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır suyu</td><td>Jenerik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür dihidrat (CaCl2 ve orta nokta; 2H < alt > 2 < / alt > O)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Karbonil siyanür 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP)</td> <td>Abcam</td><td>ab120081</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td>Fisher Scientific</td><td>C314-500</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize su (dH2O)</td> Dimetil sülfoksit (DMSO) <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thomas Scientific</td><td>C987Y85</td><td></td></tr><tr><td>Cam Pastör pipetleri</td><td>Krackeler Scientific</td><td>6-72050-900</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat (MgSO4 ve orta nokta; 7H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat dibazik (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP363-1</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat monobazik (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik susuz (Na2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP332-1</td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFp Analizörü</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denizatı XFp FluxPak</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Azid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr></tbody></table>

oksijen tüketimi oranlarında sağlam caenorhabditis elegans ölçümü

Measurement of Oxygen Consumption Rates in Intact Caenorhabditis elegans

En iyi mitokondriyal işlev özellikle yüksek enerji talepleri de sinir sistemi ve kas gibi olan hücrelerde sağlıklı hücresel hareketlilik için önemlidir. Tutarlı, mitokondrial disfonksiyon sayısız nörodejeneratif hastalıklar ve genel olarak yaşlanma ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. Caenorhabditis elegans mitokondriyal işlev birçok inceliklerini elucidating için bir güçlü modeli sistemi olmuştur. Mitokondrial solunum mitokondriyal işlev, güçlü bir göstergedir ve son zamanlarda geliştirilen respirometers solunum hücrelerdeki ölçmek için bir state-of--art platformu sunuyoruz. Bu protokol için biz canlı, bozulmamış C. elegansanaliz etmek için bir yöntem sağlar. Bu iletişim kuralı, ~ 7 gün yayılan ve (1) büyüyen ve senkronizasyon C. elegans, (2) hazırlık bileşikleri enjekte edilir ve hidrasyon probları, (3) uyuşturucu yükleme ve kartuş denge, (4) solucan tahlil hazırlanması için adımları içerir plaka ve tahlil çalıştırmak ve (5) sonrası deneme veri analizi.

İletişim kuralını kullanarak burada, OCR vahşi türü hayvan ve üç farklı sel-12 mutant suşları belirlenmiştir nitelendirdi. sel-12 presenilin17 C. elegans ortholog kodlar. İnsan presenilin mutasyonların ailesel Alzheimer hastalığı18gelişimi ile ilişkili en yaygın genetik sapma vardır. Çalışmalarımız yükseltilmiş mitokondrial kalsiyum düzeyleri sel-12 ' mutant hayvanlar vahşi türü hayvanlar...

Mitokondrial solunum organizmalar hayatta kalmak için önemlidir; Bu nedenle, oksijen tüketim oranını mitokondrial sağlık mükemmel bir göstergesidir. Bu iletişim kuralı, Bazal ölçmek için piyasada bulunan bir respirometer nasıl kullanılacağını açıklar ve maksimal oksijen tüketimi oranlarında yaşa, sağlam ve serbestçe hareketli Caenorhabditis elegans.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Optimal mitochondrial function is critical for healthy cellular activity, particularly in cells that have high energy demands like those in the nervous ...

Mitokondriyal fonksiyon hücresel homeostaz için önemlidir ve oksijen tüketim hızı mitokondriyal sağlığın belirleyici bir göstergesidir. Bu protokol, C.elegans'taki oksijen tüketim oranının analizine yönelik ayrıntılı talimatlar vermektedir. Bu protokol, mitokondriyal fonksiyonun yasal bir ölçümünü sağlayan canlı, mobil C.elegans'tan yararlanıyor.Mitokondriyi izole etme ihtiyacını arttırmak, bütünlüğü etkileyebilecek bir adım. Başlamak için, nematod büyüme medya veya NGM plakaları üzerinde Escherichia coli taze tohumlu çim üzerine istenilen genetik arka planlar L4 larvaları aktarın. Her suşu için en az iki adet 100 mm veya üç adet 60 mm plaka kullanın.Solucanları uygun büyüme sıcaklığında üç ila dört gün veya plakalar çok sayıda yumurta ve gravid solucanla yoğunlaşana kadar kuluçkaya yatırın. Yumurtaları ve solucanları 100 milimetrelik nematod tabakası başına yaklaşık 6 mililitre M9 tamponu kullanarak plakalardan yıkayın. Cam mera pipetleri kullanarak, her suşu için ayrı 15 mililitrelik santrifüj tüpler içine yumurta ve solucanlar aktarın.6, 180 g üç dakika boyunca aşağı tez tüpleri spin. Santrifüjden sonra, M9 tamponunu aspire edin ve sadece hayvan ve yumurta peletini koruyun. Her tüp ve aralıklı girdap altı dakika boyunca çamaşır suyu çözeltisi üç ila dört mililitre ekleyin.Sonra, her tüp doldurmak ve bir dakika için 6, 180 g spin M9 tampon ekleyin. Supernatant aspirate ve M9 ile bu yıkama tekrarlayın, üç kez. Yıkamadan sonra, yumurta peletini yaklaşık dokuz mililitre M9 tamponu içeren 15 mililitrelik taze bir tüpe taşıyın.Yeni yumurtadan çıkan solucanları 20 derecede 16 ila 48 saat boyunca somunlayarak senkronize edin. Bu tüpleri 6, 180 g'da 1,5 dakika eğdikten sonra, senkronize Edilmiş L-1 hayvanlarını tek tek NGM plakaları üzerinde yeni tohumlanmış OP50 çimlerine yerleştirin. Hayvanlar yaklaşık 42 saat sonra L-4 larva aşamasına ulaşana kadar plakaları 20 derecede tutun.Şu anda, L4 larvalarını mililitre başına 0,5 miligram FUdR içeren OP50 tohumlu NGM plakalarına taşımak için platin bir kazma kullanın. Sensör kartuşunu plakadaki her kuyuya 200 mikrolitre distile su ekleyerek nemlendirin ve sensör problarının batırılmasını sağlar. Tabakları gece boyunca oda sıcaklığında saklayın.Solunum arayüzündeki ısıtma elemanını kapatın. Makinenin 15 derecelik bir kuluçka makinesi içinde saklanması, makineiçindeki çekirdek sıcaklığını düşürür ve titre sırasında hayvanların aşırı ısınmasını önler. Bir gece kuluçkadan sonra, pipet dışarı ve sensör probları nemlendirmek için kullanılan distile su atmak ve her kuyuda kalibrant çözeltisi 200 mikrolitre ile değiştirin.FCCP stok çözeltisini distile suda 100 mikromolar FCCP'ye seyreltin. Ardından, sensör kartuşundaki enjeksiyon portu A'ya seyreltilmiş çözeltinin 20 mikrolitresini ekleyin. Sensör kartuşunun b enjeksiyon portuna 22 mikrolitre 400 milimolar sodyum azit ekleyin.Şimdi, solunum cihazını aç. Ana ekranda başlat'ı seçin ve şablon sayfaları görüntülenir. Şablonlar sayfasında boş"u veya önceden tasarlanmış bir şablonu seçin.Gruplar sayfası görüntülenir. Gruplar sayfasında, arka plan kuyuları olarak A ve H kuyularını seçin ve kalan altı kuyuyu deney planına göre uygun gruplara atayın. Sağ alttaki oku tıklatarak protokol sayfasına erişin ve bir ve iki düğmenin seçildiğinden emin olun.Bazal OCR okumalarının yanı sıra maksimum OCR ve mitokondriyal olmayan OCR okuma sayısını ayarlayın. Sağ alt köşedeki oku seçin. Sensör kartuş plakasını yüklemek için bir istem görüntülenir.Sensör kartuş plakasının, anımsatıcı ekranındaki talimatları izleyerek doğru yönde yüklendiğinden emin olun. Solunum cihazı artık kartuşun dengesini sağlayacaktır. Hücre plakasının sekiz kuyuve çevresindeki rezervuarların her birine 200 mikrolitre M9 tamponekleyin.Her bir suştan yaklaşık 100 solucanı tohumsuz NGM plakaları üzerine alın ve 2-3 dakika dinlendirin. Daha sonra, M9 tampon ile platin almak sonuna ıslak ve arka plan kuyuları A ve H boş bırakarak, G ile b kuyuları içine 20 yaş senkronize hayvanlar almak. Şimdi, kalibrasyon arabelleği içeren plakayı çıkarmak için solunum yazılımına Tamam'ı tıklayın.Sensörün kartuşunu cihazın içinde bırakarak plakayı solunum cihazından çıkarın. Kalibrant plakasını hayvanları içeren plakaile değiştirin. Plakaları yükleyin ve vurarak kapıyı kapatın devam edin ve tazyikin çalışmasına izin verin.Tdeneme çalışması tamamlandıktan sonra, hücre plakasını ve sensör kartuşu çıkarmak için ekrandaki istemleri izleyin. Çalışan veri savaş biçimini kaydetmek için USB bağlantı noktasına bir flash sürücü ekleyin. Sensör kartuşu çıkarın ve hayvanların yaklaşık iki dakika boyunca kuyuların dibine yerleşmesine izin verin.Hücre plakalarını stereo bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin ve her kuyudaki hayvan sayısını sayın. Oksijen tüketim oranlarını hayvan sayısına göre normalleştirmek için normalleştirme sekmesini izleyen analiz yazılımını açın. Değiştir sekmesi altındaki çeşitli gruplar için uygun düzeyleri uygulayın ve daha fazla analiz için dosyayı prizma dosyası olarak dışa aktarın.İlk beş ölçümün ortalaması bazal OCR'dir. FCCP ilavesi sonrası beş ölçümün ortalaması maksimal OCR'dir. Son olarak, sodyum azid ilavesi sonrası son beş ölçümün ortalaması mitokondriyal olmayan solunum oranıdır.Kalsiyum disregülasyonu mitokondriyal fonksiyonda değişikliğe neden olabileceğinden, sel-12 mutasyonlarının ve yabani tip hayvanlarda OCR ölçüldü ve sel-12 mutasyonlarının mitokondriyal fonksiyon ve sağlık üzerindeki etkisini incelemek için ölçüldü. Vahşi tip hayvanlar sürekli solucan başına, dakikada beş picomoles altında bazal OCR oranları gösterdi. Sel-12 mutantlarının üç suşları solucan başına dakikada yaklaşık yedi pikomoles, ocr önemli ölçüde yüksek gösterdi iken.FCCP eklenmesi üzerine, yabani tip OCR bir artış oldu, yanı sıra sel-12 mutantlar, beklendiği gibi. Yabani tip hayvanlar solucan başına dakikada yaklaşık yedi pikomoles maksimum OCR gösterdi. Sel-12 mutantları dakikada yaklaşık 10 pikomoles OCR iken, solucan başına.Bu teşrinde canlı, iyi beslenmiş ve senkronize edilmiş hayvanları kullanın ve yumurta veya leşlerin istinat kuyularına aktarılmasından kaçının. Ayrıca, cihazın iç sıcaklığı 25 santigrat dereceyi geçmemelidir. Çamaşır suyu, FCCP, FUdR ve sodyum azid toksiktir.Bu nedenle, stok çözümleri nin hazırlanması ve ilaç yüklemesi sırasında koruyucu eldiven takmaya özen verilmelidir.

measurement-oxygen-consumption-rates-intact-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

O tanımlanan konsantrasyonları ile atmosfer oluşturmak için sürekli akış hipoksi odalarına nasıl kullanılacağı Bu kağıdı...

Üzerine Hipoksi Etkileri Eğitim için tanımlı Gazlı ortamlar oluşturma<em&gt; C. elegans</em

Bu videoda, gelişimsel olarak senkronize bir steril yetişkin C. elegans popülasyonu üretme yöntemini gösteriyoruz. Örnek protokol, canlı hayvanlarda oksijen tüketim oranlarını incelemek için solucanları senkronize eder.

Nematod Senkronizasyonu: Aynı Gelişim Aşamalarında Solucan Popülasyonları Elde Etmek İçin Bir Yöntem

C. elegans davranış üzerindeki etanol etkilerini incelemek için yararlı bir modeldir. Bu davranış analizi, sürünen solucanların lokomesyon hızındaki etanol etkilerini nicel olarak belirler; bu analiz ile hem başlangıç hassasiyeti hem de etanol için akut fonksiyonel tolerans gelişimi ölçülebilir.

Locomotion Speed ​​Etanol Etkilerinin Ölçülmesi için bir Testi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

C. elegans, oksidatif stres direncinde yer alan sinyal iletim yolaklarını incelemek için çekici bir model organizmadır. Burada, 96 oyuklu plakada birkaç oksitleyici ajan kullanarak sıvı fazdaki C. elegans hayvanlarının oksidatif stres direncini ölçmek için bir protokol sunuyoruz.

Oksidatif Stres Direnci Ölçüm<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; 96 oyuklu mikrotiter plakalarında

Bu yazıda, oksijen tüketimi yüksek çözünürlüklü basınçlırespirometri Drosophila permeabilized thoraxes içinde kullanarak ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu teknik doku klasik mitokondrial yalıtım tekniği için karşılaştırıldığında çok az bir miktar gerektirir ve elde edilen sonuçlar daha fizyolojik ilgilidir.

Doku çok az miktarda kullanarak Drosophila Permeabilized liflerinin mitokondrial oksijen harcama ölçme noktalar

Metabolik oranları değişiklikler ölçme ilerleme çeşitli hastalıklar ve yaşlanma anlamak için merkezi bir noktada bulunuyor. Burada, daha yakından fizyolojik devlet benzer ve mitokondrial etkinliği değiştirmek roman uyuşturucu açığa yardımcı olabilir tüm baş oksijen tüketimi ölçmek için bir roman tekniği mevcut.

Ölçme ve oksijen Tüketim oranları tamamen yorumlama kafa kesimleri sinek

Bu çalışma, C. elegans complex I hastalığı gaz-1(fc21)solucanlarında, yani ZebraLab (orta verimli bir test) ve WormScan'da (yüksek verimli bir test) iki yarı otomatik lokomotor aktivite analizi yaklaşımı için protokoller sunar ve nematod davranışını ve entegre nöromüsküler işlevi ölçmek için çok çeşitli araştırma yöntemleri arasında karşılaştırmalı analiz sağlar.

Caenorhabditis elegans Mitokondriyal Hastalık Modellerinde Hayvan Aktivitesini Ölçmek için Deneysel Yöntemlerin Karşılaştırmalı Analizi

Caenorhabditis elegans, sağlık süresini, ömrünü ve strese karşı dayanıklılığı araştırmak için sağlam ve düşük maliyetli yöntemlerle mükemmel bir model sistem olarak hizmet eder.

Caenorhabditis elegans'ta Yaşam Süresini ve Sağlık Süresini Ölçmek için Düşük Maliyetli Yöntemlerin İncelenmesi

Kulometrik respirometri, küçük organizmaların metabolik hızını ölçmek için idealdir. Bu çalışmada Drosophila melanogaster için uyarlandığında, ölçülenO2 tüketimi, önceki çalışmalarda vahşi tip D. melanogaster için bildirilen aralık içindeydi. Daha küçük ve daha az aktif olan CASK mutantları tarafından sinek başınaO2 tüketimi, vahşi tipten önemli ölçüde daha düşüktü.

Kulometrik Mikrorespirometri Kullanılarak Drosophila melanogaster'de O2 Tüketiminin Ölçülmesi

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta oksijen tüketim oranlarını ölçerek mitokondriyal fonksiyonu canlı organizmalarda nasıl değerlendireceğinizi. Bu yöntem, mitokondri izolasyonuna gerek kalmadan daha doğru biyolojik veri sağlar.

Oksijen tüketimi oranlarında sağlam Caenorhabditis elegans ölçümü

Daha fazla video keşfet