Name: Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Öğrenin, S. aureus biyofilm kültürlerinde alkalin fosfataz aktivitesini renkölçer analizle ölçmek için yüksek verimli bir yöntem. Bu hassas teknik, biyofilm oluşumunda enzim fonksiyonunu anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

William Rainey Harper College ve University of Illinois Chicago bu deney tesis için teşekkür ederiz. Biz de onların cömert desteği McGraw Hill Vakfı teşekkür ederim.

1. orta hazırlık
<ol><li>1 L Tryptic soya suyu (TSB) hazırlamak: içine 1 L distile su, kazein, 5 gr soya yemek, 3 g sodyum klorür, dekstroz, 2.5 g ve dipotassium fosfat 2.5 g papaic özünü bir pankreas Özeti 15 g eklemek. Kullanmadan önce sterilize.</li>
	<li>Tryptic soya Agar (TSA) için agar 15 g ekleyin 1 litre TSB, basınçlı kap. Sonra aşağı oda sıcaklığına kadar soğumaya bırakın. Ardından, Petri kabına (100 mm x 15 mm) başına 20 ml oranında dökün.</li>
	<li>Biyofilm kültür orta: 10 g glikoz 1 litre autoclaved TSB ekleyin. 0.2 µm filtre kullanarak filtre tarafından sterilize.</li>
</ol>2. S. aureus biyofilm oluşumu 96 iyi doku kültürü plaka
Not: S. aureus biyofilm yukarıda açıklanan6,21kültürlü.
<ol><li>S. aureus TSA üzerinden bir bireysel koloni TSB 10 ml aşılamak ve 37 ° C'de gecede büyümek</li>
	<li>Tekerlekli sandalye Basketbolu/glikoz (10 g/L) 10 mL 1: 100 (v/v) oranında içine gecede kültür sulandırmak. Girdap karışımı yavaşça için tutarlı bir konsantrasyon.</li>
	<li>200 mL sulandırılmış kültürünün bir 96 iyi tabaktan Toplam 18 Wells (deneysel grupları, ALP etkinlik6arasında bir ilişki tavsiye ederim böyle bir biyofilm sigara denetim için daha fazla) içine aktarın. Üçüz her zaman noktası için kullanın: 0 dk, 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk. Adım 3.2 bakın.</li>
	<li>96 iyi plaka biyofilm oluşumu6,2124 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Süpernatant aspirasyon tarafından dikkatle boşaltmak.</li>
	<li>Her yıkama su kuyusu ile tamponlanmış fosfat çözüm (PBS, pH 7,4) x 1, santrifüj kapasitesi 15.000 x g de 5 min için ve süpernatant aspirasyon tarafından dikkatle boşaltmak.</li>
</ol>3. S. aureus biyofilm ALP etkinlik ölçümü
Not: ALP etkinlik açıklanan6,18ölçüldü.
<ol><li>Piyasada bulunan pNPP her şey--dan adım 2.6 oluşan tamponlu ALP substrat 75 mL ekleyin ve kayıt süresi başlar. Her zaman noktası nüsha kaydedin.</li>
	<li>Kuluçka çeşitli bir süre sonra: 0 dk (kontrol), 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk sırasıyla, reaksiyon durdurmak için 5 M NaOH 75 µL ekleyin.</li>
	<li>15.000 x gde 5 min için plaka santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>100 µL süpernatant, Renkölçer ölçüm için yeni bir 96 iyi tabak içine aktarın.</li>
	<li>Her Absorbans ölçmek de 405 nm kullanmada 96 de okuyucu plaka. Kullanma belgili tanımlık 0 dk zaman 405 nm arka plan gürültü için denetime işaret wells.</li>
	<li>Üç bireysel 96 iyi plakaları tüm denemeyi tekrarlamak.</li>
</ol>

<ol><li>Coleman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+mechanism+of+alkaline+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biophysics+and+Biomolecular+Structure%22%5BJournal%5D)">Structure and mechanism of alkaline phosphatase.</a> Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 21, 441-483 (1992).</li>
<li>Sharma, U., Pal, D., Prasad, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase%3A+An+Overview%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase: An Overview.</a> Indian Journal of Clinical Biochemistry. 29 (3), July-Sept 269-278 (2014).</li>
<li>Mitchell, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+elevated+alkaline+phosphatase+activity+and+rickets+exist+in+extremely+low+birth+weight+infants+despite+current+nutritional+support%5BTitle%5D)+AND+%22Boston+Medical+Center+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">High frequencies of elevated alkaline phosphatase activity and rickets exist in extremely low birth weight infants despite current nutritional support.</a> Boston Medical Center Pediatrics. 9, 47(2009).</li>
<li>Fawley, J., Gourlay, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+alkaline+phosphatase%3A+A+summary+of+its+role+in+clinical+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Intestinal alkaline phosphatase: A summary of its role in clinical disease.</a> Journal of Surgical Research. 202 (1), 225-234 (2016).</li>
<li>Derman, A. I., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+Alkaline+Phosphatase+Localized+to+the+Cytoplasm+Slowly+Acquires+Enzymatic+Activity+in+Cells+Whose+Growth+Has+Been+Suspended%3A+a+Caution+for+Gene+Fusion+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli Alkaline Phosphatase Localized to the Cytoplasm Slowly Acquires Enzymatic Activity in Cells Whose Growth Has Been Suspended: a Caution for Gene Fusion Studies.</a> Journal of Bacteriology. 177 (13), 3764-3770 (1995).</li>
<li>Danikowski, K. M., Cheng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Staphylococcus+aureus+grown+in+Biofilm+and+Suspension+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Staphylococcus aureus grown in Biofilm and Suspension Cultures.</a> Current Microbiology. 75, 1226-1230 (2018).</li>
<li>Okabayashi, K., Futai, M., Mizuno, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Acid+and+Alkaline+Phosphatases+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Japanese+Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Localization of Acid and Alkaline Phosphatases in Staphylococcus aureus.</a> Japanese Journal of Microbiology. 18 (4), 287-294 (1974).</li>
<li>Cheng, K. J., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkaline+Phosphatase+Activity+of+Rumen+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Alkaline Phosphatase Activity of Rumen Bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. , 586-590 (1997).</li>
<li>Berezhetskyy, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+conductometric+biosensor+for+heavy-metal+ions+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Innovation+and+Research+in+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Phosphatase conductometric biosensor for heavy-metal ions determination.</a> Innovation and Research in Biomedical Engineering. 29 (2-3), 136-140 (2008).</li>
<li>Park, E. J., Kang, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+bacterial+alkaline+phosphatase+assay+for+rapid+monitoring+of+bacterial+counts+on+spinach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">The use of bacterial alkaline phosphatase assay for rapid monitoring of bacterial counts on spinach.</a> Journal of Food Science. 73 (5), M236-M238 (2008).</li>
<li>Barber, M., Kuper, S. W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Staphylococcus+pyogenes+by+the+phosphatase+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pathology+and+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Identification of Staphylococcus pyogenes by the phosphatase reaction.</a> The Journal of Pathology and Bacteriology. 63, 65-68 (1951).</li>
<li>Wolf, P. L., Von der Muehll, E., Ludwick, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+test+to+differentiate+Serratia+from+Enterobacter%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A new test to differentiate Serratia from Enterobacter.</a> American Journal of Clinical Pathology. 56, 241-243 (1972).</li>
<li>Rangam, C. M., Katdare, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase+activity+of+Staphylococci+as+an+indication+of+their+pathogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Phosphatase activity of Staphylococci as an indication of their pathogenicity.</a> Indian Journal of Medical Science. 8, 610-613 (1954).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature Reviews Microbiology. 14, 563-575 (2016).</li>
<li>Hoiby, N., Bjarnsholt, T., Givskov, M., Molin, S., Ciofu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+of+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Antimicrobial+Agents%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance of bacterial biofilms.</a> International Journal of Antimicrobial Agents. 35, 322-332 (2010).</li>
<li>Ito, A., Taniuchi, A., May, T., Kawata, K., Okabe, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+antibiotic+resistance+of+Escherichia+coli+in+mature+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Increased antibiotic resistance of Escherichia coli in mature biofilms.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 4093-4100 (2009).</li>
<li>Witherow, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ten-Week+Biochemistry+Lab+Project+Studying+Wild-Type+and+Mutant+Bacterial+Alkaline+Phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+Education%22%5BJournal%5D)">A Ten-Week Biochemistry Lab Project Studying Wild-Type and Mutant Bacterial Alkaline Phosphatase.</a> Biochemistry and Molecular Biology Education. 44 (6), Nov/Dec (2016).</li>
<li>Henthorn, P., Zervos, P., Raducha, M., Harris, H., Kadesch, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+human+placental+alkaline+phosphatase+gene+in+transfected+cells%3A+Use+as+a+reporter+for+studies+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Expression of a human placental alkaline phosphatase gene in transfected cells: Use as a reporter for studies of gene expression.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 85, 6324-6346 (1988).</li>
<li>Horney, B. S., Farmer, A. J., Honor, D. J., MacKenzie, A., Burton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+of+alkaline+phosphatase+isoenzymes+in+the+serum+of+hyperthyroid+cats%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis of alkaline phosphatase isoenzymes in the serum of hyperthyroid cats.</a> Veterinary Clinical Pathology. 23 (3), 98-102 (1994).</li>
<li>Farley, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Skeletal+Alkaline+Phosphatase+in+Osteoporotic+Serum+by+Wheat+Germ+Agglutinin+Precipitation%2C+Heat+Inactivation%2C+and+a+Two-Site+Immunoradiometric+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantification of Skeletal Alkaline Phosphatase in Osteoporotic Serum by Wheat Germ Agglutinin Precipitation, Heat Inactivation, and a Two-Site Immunoradiometric Assay.</a> Clinical Chemistry. 40 (9), 1749-1756 (1994).</li>
<li>O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtiter+Dish+Biofilm+Formation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experience%22%5BJournal%5D)">Microtiter Dish Biofilm Formation Assay.</a> Journal of Visualized Experience. , (2011).</li>
<li>Nomoto, M., Ohsawa, M., Wang, H. L., Chen, C. C., Yeh, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Characterization+of+Extracellular+Alkaline+Phosphatase+from+an+Alkalophilic+Bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+and+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and Characterization of Extracellular Alkaline Phosphatase from an Alkalophilic Bacterium.</a> Agricultural and Biological Chemistry. 52 (7), 1643-1647 (1988).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bizim assay olarak, biz ALP substrat pNPP kullanılır. Bu bir çalışma çözüm ELISA için tasarlanmıştır ve hiçbir seyreltme gereklidir. Hidroliz ALP tarafından sonra sarı bir ürün geliştiren ve 405 ölçülebilir nm. Enzimatik reaksiyon sonunda kısa bir süre 96 iyi plaka centrifuged ve süpernatant Absorbans plaka okuyucu kullanarak ölçmek için bir taze 96 iyi tabağa aktarılır. 405 Absorbans tutarlılığını artırır bu yana bu ilave Santrifüjü adım kritik, bulduk nm muhtemelen sırasında enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan olası a...

Alkalen fosfataz (ALP) ubiquitously hem prokaryotik ve ökaryotik hücre1' ifade edilir. Monofosfattır nükleotit, proteinler, alkoloidler, fosfat esterleri ve anhidritler fosforik asit gibi farklı molekül gelen hidroliz katalizler. İnsanlarda, ökaryotik ALP karaciğer, kemik, bağırsak ve plasenta2de dahil olmak üzere birçok dokularda bulunur. Protein fosforilasyon, hücre büyümesi, Apoptozis, kök hücre işlemleri yanı sıra normal iskelet Qafqaz önemli rol oynar. Ökaryotik ALP kemik, karaciğer ve diğer dokuların/yüksek zaman organ hastalıklarında varlığı için bir anahtar serum gösterge mevcuttur3,4.
Prokaryotik ALP bakteri hücreleri, E. coli5, S. aureus6,7 ve ortak bazı Rum bakteriler toprak8' de dahil olmak üzere çeşitli algılandı. Bakteriyel ALP etkinliği bir Biyoalgılayıcı bulunması, pestisitler, heavy metal9 ve bakteriyel kontaminasyon10olarak kullanılmıştır. ALP kurucu ifade stafilokok11 tanımlamak ve Serratia Enterobakter12den ayırt etmek için kullanılmıştır. Bu daha da bünye ALP üretim patojenitesi stafilokok13ile ilişkilidir önerilmektedir. ALP farklı ayarlar3' te,4, okudu, ancak henüz az aktivite ve işlev biyofilmler kültürlerde bildirilmektedir.
Onun yaşayan bakteri hücre muadili14ile karşılaştırıldığında farklı şekilde işleyen bir bakteriyel yaşam bir biyofilm belgelenmiş oldu. S. aureusiçinde biyofilm oluşumu çeşitli klinik koşulları ve antibiyotik direnci ve kronik inflamasyon15,16saptanmıştır. Çok moleküller bir biyofilm matris polisakkaritler, proteinler, nükleik asitler ve yağlar gibi bulunabilir için rapor vardı ama biyofilm oluşumu mekanizması tam olarak anlaşılır14değil. ALP rolde biyofilm oluşumu anlamak için biz S. aureus biyofilmler 96 iyi doku kültürü tabak içinde kültürlü ve para-nitrophenylphosphate (pNPP) kullanarak ALP etkinliğini ölçülür.
Molekül pNPP ALP için kullanıma hazır substrat ve yaygın olarak ALP etkinlik6,17,18ölçmek için kullanılır. Bu Renkölçer tahlil para-nitrophenyl fosfat (pNPP) dönüşüm üzerinde para-nitrophenol 405, renkli bir ürün sonuçlanan dayanmaktadır nm. Diğer geleneksel ALP tahlil için özel Jel Elektroforez19, buğday tohumu agglutinin (WGA) yağış, ve WGA-HPLC20, bu tahlil çok özel gibi karşılaştırıldığında, duyarlı, yeniden oluşturma ve en kolay da önemlisi, yüksek için sağlar üretilen iş.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Santrifüj</td><td>Thomas Scientific</td><td>5810</td><td></td></tr><tr><td>Gluose</td><td>VWR</td><td>50-99-7</td><td></td></tr><tr><td>NaOH peletleri</td><td>VWR</td><td>SS0550-500GR</td><td></td></tr><tr><td>Para-nitrofenilfosfat (pNPP)&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7998-100ML</td><td>Genellikle enzime bağlı immünosorbent testlerinde (ELISA) kullanılan pNPP sıvı substratlarının tipik konsantrasyonları 10 ila 50 mM arasında değişir. Burada kullanılana benzer şekilde kullanıma hazır pNPP sıvı substratlarının çoğuna benzer şekilde, tescilli doğası nedeniyle tam pNPP konsantrasyonu açıklanmamıştır.</td></tr><tr><td>10x PBS, pH 7.4. 173 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO<> sub4, 2 mM KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P3288-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Plaka Okuyucu</td><td>Biotek</td><td>ELx808</td><td></td></tr><tr><td>S. aureus</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td></td></tr><tr><td>Triptik Soya Agar&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 15 g/L TSB</td><td>VWR</td><td>9002-18-0</td><td></td></tr><tr><td>Triptik Soya Suyu:&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; g/L Kazeinin Pankreas Sindirimi............ 15.0 Soya Yemeğinin Papalık Özeti......... 5.00 Sodyum klorür.............................. 3.00 Dekstroz........................................ &nbsp; 2.50 Dipotasyum fosfat.................. 2.50</td><td>VWR</td><td>90006-098</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyu doku kültürü plakaları</td><td>BD</td><td>6902D09</td><td>U şekilli alt</td></tr></tbody></table>

renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde s. aureus biyofilm

Colorimetric Analysis of Alkaline Phosphatase Activity in S. aureus Biofilm

Alkalen fosfataz (ALP) prokaryotik ve ökaryotik hücrelerde ifade ortak bir enzimdir. Fosfat monoesters temel pH çok moleküller gelen hidroliz tromboksan ve fosfat metabolizmasında vazgeçilmez bir rol oynar. İnsanlarda, ökaryotik ALP Histiositoz ve raşitizm gibi çeşitli hastalıkların teşhis en sık kullanılan enzimatik sinyalleri biridir. S. içinde aureus, ALP sadece hücre membran üzerinde algılanır; Ayrıca de salgı form olarak ifade edilir. Yine de, az onun işlevi biyofilm oluşumu hakkında bilinir.
Bu yazının amacı protein yalıtım gerektirmez S. aureus biyofilm ALP etkinliğini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir tahlil geliştirmektir. P-nitrophenyl fosfat (pNPP) bir substrat kullanarak, S. aureus biyofilm 96-iyi doku kültürü levha oluşmuş ALP etkinliğinde şiddetindeydi. Etkinlik 405 nm Absorbans tarafından ölçülen çözünür reaksiyon ürünü oluşumu dayanıyordu. 96 iyi doku kültürü plaka yöntemi yüksek üretilen iş doğası ALP etkinlik deneyleri için hassas ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Aynı deneysel kurmak da biyofilm oluşumu için ilgili ekstraselüler diğer moleküler işaretleyiciler ölçmek için genişletilebilir.

Şekil 1 S. aureus kültürleri biyofilm aktivitesinden ALP temsilcisi sonucu 96 iyi doku kültürü levha gösterir. Piyasada bulunan pNPP çözüm 75 μL her iyi ve oda sıcaklığında inkübe eklenmiştir. Kuluçka için farklı zamanlarda sonra (0 dk, 15 dk, 30 dk, 45 dk, 60 dk ve 75 dk, sırasıyla) 5 M NaOH 75 μL reaksiyonu durdurmak için eklendi. Ürün sonra 405, 96 iyi plaka okuyucu olarak ölçüldü nm. Her zaman noktası üçüz tek 96 iyi plaka içinde tekrar edilmiş v...

Bu makale, alkalen fosfataz aktivitesi S. aureus biyofilm kültür 96-iyi doku kültürü plaka ölçmek için bir yüksek aktarım yöntemi kurduk

Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm

Alkaline phosphatase (ALP) is a common enzyme expressed in both prokaryotic and eukaryotic cells. It catalyzes the hydrolysis of phosphate monoesters from ...

Bu protokol, S.aureus biyofilm kültüründe alkalize fosfataz aktivitesini ölçmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sunmuştur. ALP'in biyofilm oluşumundaki işlevini anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek iş bölümüdür.Çok hassas ve gerçekleştirmek kolaydır. Prosedürü gösteren Kevin Danikowski, Harper Koleji'nden eski bir öğrenci olacaktır. TSB hazırlamak için, kazein pankreas sindirimi ekleyin, soya küskülünün papaik özeti, sodyum klorür, dekstroz, ve dipotasyum fosfat distile suya.Alüminyum folyo ile şişe kapağı ve kullanmadan önce sterilize etmek için bir otoklav koymak. Bir TSA hazırlamak için, TSB agar ekleyin ve sterilizasyon için otoklav koymak. Sonra oda sıcaklığına soğumaya bırakın.Daha sonra, çanak başına 20 mililitre oranında Petri kabına dökün. Bir biyofilm kültür ortamı hazırlamak için, litre başına 10 gram konsantrasyon elde etmek için otoklavlı TSB glikoz ekleyin. Vakum filtrasyon kiti kullanarak, çözeltiyi 0,2 mikrometre gözenek boyutunda filtre ile dosyalayın.Aşılamak için, Petri kabından tek bir Staph aureus kolonisini seçmek ve 10 mililitre TSB ile dolu kültür tüpüne yerleştirmek için sterilize edilmiş bir aşılama döngüsü kullanın. Tüpü kuvöze koy up bir gecede 37 santigrat derecede büyüy. Bir mikropipet ile, bir gecede kültür 100 mikrolitre çizmek ve 1:100 hacim oranı seyreltme için glikoz ile TSB 10 mililitre dolu bir kültür tüpü aktarın.Girdap yavaşça tutarlı bir konsantrasyon için karıştırmak için. Bir 96 kuyu plakasından toplam 18 kuyuya 200 mikrolitre seyreltilmiş kültür aktarmak için bir mikropipet kullanın. Biyofilm oluşumu için 96 kuyu plakasını 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın.S.aureus en iyi biyofilm oluşumu için, düz veya yuvarlak alt 96 iyi plaka almak daha iyidir. Bundan sonra, her kuyunun kenarından aspirasyon ile supernatant decant için biraz plaka tilt. Her bir kuyuya 1X PBS ile yıkayın.Plakayı dakikada 8,000 devirde beş dakika döndürmek için santrifüje koyun ve aspirasyonla süpernatant'ı dekantlayın. Her kuyuya ticari olarak kullanılabilen PNPP'den oluşan 75 mikrolitre arabelleğe alan ALP substratı ekleyin ve her zaman noktasını triplicate olarak kaydetmek için bir zamanlayıcı kullanın. Her kuluçka zaman noktasından sonra, reaksiyonu durdurmak için üç kuyunun her birine beş molar sodyum hidroksit75 mikrolitre ekleyin.Dakikada 800 devirde tabağı beş dakika santrifüj edin. Kalorimetrik ölçüm için 100 mikrolitre supernatant'ı yeni bir 96 kuyu plakasına aktarmak için bir pipet kullanın. 405 nanometre de her kuyunun emiciliğini ölçmek için bir 96 iyi plaka okuyucu kullanın.Arka plan gürültüsünü kontrol etmek için 30 dakikalık zaman noktası kuyularını kullanın. Tüm deneyi üç 96 kuyu plakası halinde tekrarlayın. Bu protokol, protein izolasyonu gerektirmeyen S.aureus biyofilmdeki ALP aktivitesini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir test geliştirir.ALP aktivitesinin temsili sonucu 75 dakikaya kadar artış eğilimi gösterir. 75 dakika sonra ALP aktivitesinde bir artış gözlenmedi. İyi bir biyofilm kültürü oluşturmak çok önemlidir ve ustalaşmak için birkaç deneme gerekebilir.Daha önce bizim ve başkaları tarafından bildirilen kristal mor teşleyi yaparak biyofilm oluşumunu onaylayabilir ya da biyofilm oluşumunu kolaylaştırmak için plakayı insan plazması ile tedavi edebilirsiniz. Geliştirildikten sonra, biyofilm oluşumunu engelleyebilecek potansiyel ALP inhibitörlerini tarayabilirsiniz. Sonuç, tıp alanında biyofilm yönetimi ne kadar önemli bilgiler sağlayacaktır.Beş azı lı sodyum hidroksit temas halinde tehlikeli olabilir. Kullanım yaparken kişisel koruyucu ekipman taktığından emin olun.

colorimetric-analysis-alkaline-phosphatase-activity-s-aureus

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Diş yüzeylerinde oluşan Biyofilmler, son derece karmaşık ve kendi mimari modüle doğuştan sabit ve dışsal çevre sorunlarına, fizyoloji ve transcriptome maruz. Bileşimi, yapısal organizasyon ve oral biyofilmlerin biyofilm araştırmanın diğer alanlara adapte olabilen gen ekspresyonu, incelemek için bir araç kutusu geliştirdi.

Analitik Oral Biyofilmler Kapsamlı biyokimyasal, yapısal ve Transcriptome Değerlendirme Aracı-box mutans Streptokok tarafından aracılığı ile

Kaynak: Vidilaseris, K., ve diğerleri. Thermotoga maritima Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin taranması. J. Vis. Uzm. (2019)Bu video, ortofosfat salınımını ölçerek bakteriyel membrana bağlı pirofosfataz (mPPaz) inhibitörlerini taramak için kolorimetrik bir tahlil göstermektedir. Yöntem, potansiyel bir antimikrobiyal ilaç hedefi olan Thermotoga maritima'dan mPPaz'ı inhibe eden bileşiklerin tanımlanmasını sağlar.

Kolorimetrik Bir Test Kullanılarak Bakteriyel Membrana Bağlı Pirofosfataz İnhibitörlerinin Taranması 

Kaynak: Tay, S. B. ve diğerleri. Mühendislik Amaçlı Kuorum Söndüren Laktonazlar Kullanılarak Patojenik Biyofilmlerin Anti-Virülent Bozulması.  J. Vis. Exp. (2016)Video, patojenik bir bakteride biyofilm biyokütlesini nicelendirme yöntemini gösteriyor; tedavi edilmemiş kontroller ve yeterli güç söndürme enzimiyle işlenmiş örnekler karşılaştırılıyor. Bu enzim, erken kuluçka sırasında bakteriyel sinyalleri bozarak hücre yapışmasını azaltır. Yıkama ve daha fazla kuluçkadan sonra, kontrol kuyuları...

Patojenik Bakterilerde Enzim Kaynaklı Biyofilm Bastırmanın Nicelendirilmesi

Bu video, nötrofil-biyofilm etkileşimini incelemek için bir in vitro testi göstermektedir. Biyofilm ve izole nötrofillere gömülü patojenik bakteriler, floresan etiketler kullanılarak etiketlendi ve nötrofillerin immün yanıtı ve bakterilerin immün yanıtından kaçışı bir floresan mikroskobu kullanılarak değerlendirildi.

Nötrofiller ve Biyofilm Arasındaki Etkileşimi İncelemek İçin Bir İn Vitro Test

Ökaryotlar için görülenden farklı olarak, esas olarak, küçük boyutu olarak bakterilerde ayrıntılı membran depolarizasyon ve iyon konsantrasyonu değişiklikleri, ölçüm zor geleneksel yöntemler yapan çok az çalışma vardır. Burada, biz floresan teknikleri kullanılarak anlamlı Gram-pozitif bir patojen Streptococcus pneumoniae tür olayları izlemek için detay protokolleri.

Membran Kutup, Membran Dürüstlük ve Hücre içi İyon Konsantrasyonlarında İzleme değişiklikler<em&gt; Streptococcus pneumoniae</em&gt; Floresan boyalar kullanarak

Burada, antimikrobiyal aktivite için enzimleri hızlı bir şekilde taramak ve karakterize etmek için protokoller sunuyoruz. Mikroslayt difüzyon testi ve boya salım testi, kalitatif ve kantitatif enzimatik aktivite değerlendirmesi için hedef bakteri substratlarını kullanır.

Nitel ve Nicel Saptanması için Tahliller ve Protein Antimikrobiyal karakterizasyonu

Çoğu bakteriyel enfeksiyon bir biyofilm üretir. Çevreleri nedeniyle, biyofilm ile ilişkili bakteriler genellikle fenotipik olarak ilaca dirençlidir. Biyofilmlerdeki bakterileri öldüren yeni antibakteriyel moleküller bu nedenle yüksek bir önceliğe sahiptir. Biyofilmleri yok etmede etkili olan antimikrobiyal bileşikleri hızlı bir şekilde taramak için bir test oluşturuyoruz.

Biyofilm İlişkili Hedefleme<em&gt; Staphylococcus aureus</emKullanma&gt; Resazurin Tabanlı İlaç-duyarlılık Deneyi

Bu el yazması antimikrobiyal etkisi 5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi (ALA-PDT) Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya protokolünü açıklar. Bu iletişim kuralı bakteriyel biyofilmler PDT ile tedavisinde gelecekte çalışmaya bir vitro model geliştirmek için kullanılabilir.

5-Aminolevulinik asit-aracılı Fotodinamik Tedavi etkisi Staphylococcus aureus biyofilm çalışmaya bir In Vitro modeli

Protokol, Candida albicans ve Streptococcus mutans'tan oluşan krallıklar arası biyofilmlerin ekimini açıklar ve bu biyofilmlerin içinde hücre dışı pH'ın izlenmesi için konfokal mikroskopi tabanlı bir yöntem sunar.

Konfokal Mikroskopi Ile Krallık Lararası Biyofilmlerde Hücre Dışı pH'ın izlenmesi

Bu makalede, alkalen fosfataz konjuge ScFv D11 antikoru kullanılarak immünofloresan yoluyla dokulardaki izolevuglandinlerin ölçümü için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Hem farelerde hem de insanlarda hipertansiyon modelleri, doku örneklerinde izolevuglandin ölçümü ile ilişkili adım adım prosedürleri ve temel ilkeleri açıklamak için kullanılır.

D11 scFv-alkalen fosfataz füzyon proteini ve immünofloresan kullanılarak dokulardaki izolevuglandinlerin doğrudan tespiti

Mevcut protokol, nötrofil-biyofilm etkileşimlerinin incelenmesini açıklamaktadır. Staphylococcus aureus biyofilmleri in vitro olarak kurulur ve periferik kan kaynaklı insan nötrofilleri ile inkübe edilir. Nötrofillerden oksidatif patlama tepkisi ölçülür ve biyofilm içindeki nötrofil lokalizasyonu mikroskopi ile belirlenir.

İnsan Nötrofiller ve Staphylococcus aureus Biyofilmleri Arasındaki Etkileşimleri Görselleştirmek ve Ölçmek için Standartlaştırılmış In vitro Testler

Öğrenin, S. aureus biyofilm kültürlerinde alkalin fosfataz aktivitesini renkölçer analizle ölçmek için yüksek verimli bir yöntem. Bu hassas teknik, biyofilm oluşumunda enzim fonksiyonunu anlamaya yardımcı olur.

Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm

Daha fazla video keşfet