Renkölçer analiz, alkalin fosfataz etkinliğinde S. aureus biyofilm
12 Nisan 2019
Bu makale, alkalen fosfataz aktivitesi S. aureus biyofilm kültür 96-iyi doku kültürü plaka ölçmek için bir yüksek aktarım yöntemi kurduk
Bu protokol, S.aureus biyofilm kültüründe alkalize fosfataz aktivitesini ölçmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sunmuştur. ALP'in biyofilm oluşumundaki işlevini anlamamıza yardımcı olacaktır. Bu tekniğin en büyük avantajı yüksek iş bölümüdür.
Çok hassas ve gerçekleştirmek kolaydır. Prosedürü gösteren Kevin Danikowski, Harper Koleji'nden eski bir öğrenci olacaktır. TSB hazırlamak için, kazein pankreas sindirimi ekleyin, soya küskülünün papaik özeti, sodyum klorür, dekstroz, ve dipotasyum fosfat distile suya.
Alüminyum folyo ile şişe kapağı ve kullanmadan önce sterilize etmek için bir otoklav koymak. Bir TSA hazırlamak için, TSB agar ekleyin ve sterilizasyon için otoklav koymak. Sonra oda sıcaklığına soğumaya bırakın.
Daha sonra, çanak başına 20 mililitre oranında Petri kabına dökün. Bir biyofilm kültür ortamı hazırlamak için, litre başına 10 gram konsantrasyon elde etmek için otoklavlı TSB glikoz ekleyin. Vakum filtrasyon kiti kullanarak, çözeltiyi 0,2 mikrometre gözenek boyutunda filtre ile dosyalayın.
Aşılamak için, Petri kabından tek bir Staph aureus kolonisini seçmek ve 10 mililitre TSB ile dolu kültür tüpüne yerleştirmek için sterilize edilmiş bir aşılama döngüsü kullanın. Tüpü kuvöze koy up bir gecede 37 santigrat derecede büyüy. Bir mikropipet ile, bir gecede kültür 100 mikrolitre çizmek ve 1:100 hacim oranı seyreltme için glikoz ile TSB 10 mililitre dolu bir kültür tüpü aktarın.
Girdap yavaşça tutarlı bir konsantrasyon için karıştırmak için. Bir 96 kuyu plakasından toplam 18 kuyuya 200 mikrolitre seyreltilmiş kültür aktarmak için bir mikropipet kullanın. Biyofilm oluşumu için 96 kuyu plakasını 37 derecede 24 saat kuluçkaya yatırın.
S.aureus en iyi biyofilm oluşumu için, düz veya yuvarlak alt 96 iyi plaka almak daha iyidir. Bundan sonra, her kuyunun kenarından aspirasyon ile supernatant decant için biraz plaka tilt. Her bir kuyuya 1X PBS ile yıkayın.
Plakayı dakikada 8,000 devirde beş dakika döndürmek için santrifüje koyun ve aspirasyonla süpernatant'ı dekantlayın. Her kuyuya ticari olarak kullanılabilen PNPP'den oluşan 75 mikrolitre arabelleğe alan ALP substratı ekleyin ve her zaman noktasını triplicate olarak kaydetmek için bir zamanlayıcı kullanın. Her kuluçka zaman noktasından sonra, reaksiyonu durdurmak için üç kuyunun her birine beş molar sodyum hidroksit75 mikrolitre ekleyin.
Dakikada 800 devirde tabağı beş dakika santrifüj edin. Kalorimetrik ölçüm için 100 mikrolitre supernatant'ı yeni bir 96 kuyu plakasına aktarmak için bir pipet kullanın. 405 nanometre de her kuyunun emiciliğini ölçmek için bir 96 iyi plaka okuyucu kullanın.
Arka plan gürültüsünü kontrol etmek için 30 dakikalık zaman noktası kuyularını kullanın. Tüm deneyi üç 96 kuyu plakası halinde tekrarlayın. Bu protokol, protein izolasyonu gerektirmeyen S.aureus biyofilmdeki ALP aktivitesini ölçmek için hızlı ve güvenilir bir test geliştirir.
ALP aktivitesinin temsili sonucu 75 dakikaya kadar artış eğilimi gösterir. 75 dakika sonra ALP aktivitesinde bir artış gözlenmedi. İyi bir biyofilm kültürü oluşturmak çok önemlidir ve ustalaşmak için birkaç deneme gerekebilir.
Daha önce bizim ve başkaları tarafından bildirilen kristal mor teşleyi yaparak biyofilm oluşumunu onaylayabilir ya da biyofilm oluşumunu kolaylaştırmak için plakayı insan plazması ile tedavi edebilirsiniz. Geliştirildikten sonra, biyofilm oluşumunu engelleyebilecek potansiyel ALP inhibitörlerini tarayabilirsiniz. Sonuç, tıp alanında biyofilm yönetimi ne kadar önemli bilgiler sağlayacaktır.
Beş azı lı sodyum hidroksit temas halinde tehlikeli olabilir. Kullanım yaparken kişisel koruyucu ekipman taktığından emin olun.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, 96 kuyucuklu doku kültürü plakası kullanarak S. aureus biyofilm kültürlerindeki alkalin fosfataz aktivitesini nicelendirmek için yüksek verimli bir yöntem sunmaktadır. Yöntem, hassas ve uygulanması kolay olacak şekilde tasarlanmış olup, alkalin fosfatazın biyofilm oluşumundaki rolüne yönelik araştırmaları kolaylaştırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Mikrobiyoloji
- Biyofilm Araştırmaları
- Enzimoloji
Arka Plan
- Alkalin fosfataz (ALP), çeşitli biyolojik süreçlerde yer alan bir enzimdir.
- ALP'nin biyofilm oluşumundaki rolünün anlaşılması, mikrobiyolojik çalışmalar için kritik öneme sahiptir.
- Araştırmalarda verimli veri toplama işlemi için yüksek kapasiteli yöntemler gereklidir.
- Biyofilmler, sağlık ve endüstriyi etkileyebilen karmaşık mikroorganizma topluluklarıdır.
Çalışmanın Amacı
- Biyofilmlerde ALP aktivitesini ölçmek için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- ALP'nin biyofilm oluşumundaki işlevine dair anlayışı geliştirmek.
- Araştırmacılar tarafından kolayca benimsenebilecek bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kazeinin pankreatik sindirimi, soya küspesinin papainle sindirimi, sodyum klorür, dekstroz ve dipotasium fosfat kullanılarak TSB hazırlanması.
- Yüksek verimli analiz için 96 kuyucuklu doku kültürü plakası kullanımı.
- S. aureus biyofilm kültürlerinde alkalin fosfataz aktivitesinin ölçümü.
- Prosedürün, Harper College'dan eski bir öğrenci olan Kevin Danikowski tarafından gösterimi.
Ana Sonuçlar
- Yöntem, biyofilm kültürlerindeki ALP aktivitesini başarıyla nicelleştirir.
- Tekniğin yüksek hassasiyeti, doğru ölçümler yapılmasına olanak tanır.
- Protokol basit olup çeşitli laboratuvarlarda kolayca uygulanabilir.
- Bu çalışmadan elde edilen bilgiler, gelecekteki biyofilm araştırmalarına yön verebilir.
Sonuçlar
- Yerleşik yöntem, biyofilmlerde ALP'nin incelenmesinde etkilidir.
- Bu araştırma, biyofilm dinamiklerinin anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
- Gelecekteki çalışmalar, biyofilm biyolojisinin diğer yönlerini keşfetmek için bu protokolü temel alabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Uygunluk
Bu yöntem, protein izolasyonu gerektirmeden S. aureus biyofilmindeki alkalin fosfataz aktivitesinin hızlı ve yüksek kapasiteli kantifikasyonunu sağlayarak, antimikrobiyal keşiflerdeki erken aşama hedef doğrulama çalışmalarını destekler. Hücre dışı enzim aktivitesine dair hassas ve tekrarlanabilir bir okuma sunması sayesinde, biyofilmle ilişkili terapötik hipotezlerin mekanistik risk analizini kolaylaştırır. Analizin 96 kuyucuklu plaka formatlarıyla uyumluluğu, öncü bileşik belirleme ve öngörüsel güven artırma süreçleri için tarama basamaklarına sorunsuz entegrasyonuna olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'sindeki Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Alkalen fosfatazın biyofilm oluşumuna ve kalıcılığına katkıda bulunduğu yönündeki terapötik hipotezi sorgular.
- Operasyonel Değer: Bozulmamış biyofilm sistemlerinde enzim aktivitesinin kantitatif ölçümü yoluyla fonksiyonel hedef doğrulama imkanı sağlar.
- Öngörücü Değer: ALP modülasyonunu biyofilm inhibisyon fenotipleriyle ilişkilendirerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Bileşiklerin hücre dışı enzimatik belirteçler üzerindeki etkilerini değerlendirmek için standartlaştırılmış, yüksek kapasiteli bir format hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Doz-yanıt analizine ve hit doğrulamasına olanak tanıyan 405 nm'de absorbans tabanlı ölçümler üretir.
- Ölçeklenebilirlik: İnhibitör kütüphanelerinin orta kapasiteli taramasını desteklemek için 96 kuyucuklu plaka formatı kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: ALP aktivitesini, cihazla ilişkili ve kronik enfeksiyonlarda temel bir virülans faktörü olan S. aureus biyofilmi ile ilişkilendirir.
- Translasyonel Süreklilik: Keşif aşaması ile preklinik etkinlik testleri arasında köprü kuran, biyobelirteç uyumlu bir okuma sağlar.
- Riskten Arındırılmış Kararlar: Biyofilm modellerindeki hedef etkileşimi ve fenotipik etkiye dayalı olarak devam/durdur (go/no-go) kriterlerini bilgilendirir.
Hat ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu analiz, hedef doğrulamanın öncü bileşik belirlemesine ve anti-biofilm stratejilerinin preklinik değerlendirmesine temel oluşturmasını sağlayarak erken keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: ALP'yi biyofilm metabolizmasının fonksiyonel bir çıktısı olarak ölçerek hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Mikrotitre plakalarında bileşik kütüphanesi taramasına uygun, tekrarlanabilir ve kantitatif okumalar sağlar.
- Analitik: İşlem görmüş koşulların kontrol koşullarıyla istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanıyan kinetik ve uç nokta ölçümleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Enzim aktivitesini biyofilm oluşumu ve potansiyel terapötik müdahale ile ilişkilendirerek biyobelirteç geliştirme süreçleriyle uyumlu hale getirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla proje genelinde mikrobiyal biyofilmlerdeki hücre dışı enzimlerin incelenmesi için yeniden kullanılabilir bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: ALP'nin biyofilme etkisindeki mekanistik belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Basit bir kolorimetrik okuma yoluyla standardizasyon, hassasiyet ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Biyofilm ile net fenotipik bağlantıları olan ALP modülatörlerinin hızlı taranmasına olanak tanıyarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Hedef modülasyonunu anti-biyofilm etkinliği ile ilişkilendirerek riskten arındırılmış geliştirme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Steril biyofilm kültürü ve S. aureus kullanımı için temel mikrobiyoloji uzmanlığı gerektirir.
- 405 nm absorbans ölçümü yapabilen 96 kuyucuklu plaka okuyucuya erişime bağlıdır.
- Güvenilir karşılaştırmalar için kuyucuklar ve plakalar arasında biyofilm oluşum koşullarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Diğer bakteri türlerine veya hücre dışı belirteçlere genişletildiğinde optimizasyon değerlendirmeleri içerir.
- Arkaplan absorbansının kontrol edilmesi ve NaOH ile reaksiyonun uygun şekilde durdurulması gerekliliği gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
