Name: Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-02T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: Öğrenin, hipokampal nöronlardan dendritik filopodia-zengin kesir arıtma yöntemiyle immatür sinaps proteinlerini izole etmeyi. Bu teknik, sinaptik plastisite ve nöronal gelişim mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz hipokampal nöronların düşük yoğunluklu kültürü için Shigeo Okabe ve Hitomi Matsuno teşekkür, tlcn eksikliği fareler için Masayoshi Mishina, teknik yardım için Sachiko Mitsui ve Momoko Shiozaki ve yararlı tartışmalar için Yoshihara Laboratuvarı üyeleri . Bu çalışma JSPS KAKENHI Grant NOS tarafından desteklenmektedir. JP20700307, JP22700354 ve JP24500392 ve MEXT KAKENHI Grant Nos. JP23123525 için YF ve JP20022046, JP18H04683 ve JP18H05146 YY.

Burada açıklanan tüm yöntemler RıKEN Wako kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. hipokampal nöronların kültürü
<ol><li>Kültür ortamının hazırlanması
	<ol>
<li>200x Vitamin karışımı hazırlanması. Çözülür 100 mg D-pantothenic asit hemicalcium tuz, 100 Kolin klorür mg, 100 mg folik asit, 180 mg i-inositol, 100 mg Niacinamide, 100 mg piridoksal HCL, ve 100 mg Thiamin HCL içinde 500 ml Ultra saf su manyetik karıştırıcı kullanarak. Çözüm tamamen çözülür değil. 50 ml tüplerde dikkatle karıştırın, kısım ve-20 °c ' de saklayın.</li>
		<li>Riboflavin çözeltisi hazırlanması. Çözünür 100 manyetik karıştırıcı kullanarak 500 ml Ultra saf su içinde riboflavin mg. Çözüm tamamen çözülür değil. 50 ml tüplerde dikkatle karıştırın, kısım ve-20 °c ' de saklayın.</li>
		<li>1 M CaCl2hazırlanması. Çözünür 7,35 g CAcl2· 2H2O 50 ml 'de manyetik karıştırıcı kullanarak ultra saf su.</li>
		<li>Minimum temel Orta (MEM) hazırlanması. Çözülür 400 mg KCL, 6800 mg NaCl, 2.200 mg NaHCO3, 158 mg Nah2Po4· 2H2O, 7000 mg D-glikoz ve 200 mg MgSO4-7h2o içinde 950 ml Ultra saf su manyetik karıştırıcı kullanarak.</li>
		<li>Titrat 1,8 mL 1 M CaCl2 ' ye bir damla-by-Drop şekilde bir manyetik karıştırıcı üzerinde sabit bir ajitasyon Ile 1 ml pipet kullanarak. 1 mol/L HCl ile MEM için pH 7,25 pH değerini ayarlayın.</li>
		<li>Ekle 5 mL 200x Vitamin karışımı ve 200 Me riboflavin solüsyonu μL. Çözümün hacmini Ultra Saf suyla 1.000 ml 'ye ayarlayın. Solüsyonu 0,22 μm filtre sistemi kullanarak filtreleyin ve 4 °C ' de saklayın.</li>
		<li>10X DNase-ı stok çözümlerinin hazırlanması. 100 mg DNase-ı, Hanks ' dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 12,5 ml 'de çözülür, 0,22 μm filtre ile filtre, 1,5 ml tüplerde kısım ve tüpleri-20 °c ' de saklayın.</li>
		<li>Sitozin β-D-arabinofuranoside (ara-C) stok çözeltisi hazırlanması. 8,93 ml Ultra saf su (10 mm son konsantrasyonu), 0,22 μm filtre aracılığıyla filtre, 1,5 ml tüpler ve mağaza-20 °c ' de 25 mg ara-C çözülür.</li>
		<li>Kaplama orta hazırlanması. Mix 1 mL MEM amino asit çözeltisi, 750 μL 1 M HEPES, 1 mL B27, 125 μL 200 mM glutamin, 250 μL penisilin/streptomisin, 2,5 ml fetal sığır serumu (FBS), ve 44,375 ml, bir 50 mL tüpte MEM.</li>
		<li>Stop orta hazırlama. Mix 1 mL MEM amino asit çözeltisi, 750 μL 1 M HEPES, 5 mL FBS (son 10%), ve 43,25 mL MEM bir 50 mL tüp.</li>
	</ol></li>
	<li>Poly-L-Lysine kaplı yemeklerin hazırlanması
	<ol>
<li>Coat 35 mm plastik hücre kültürü yemekleri 0,2 mg/mL Poly-L-lizin hidrobromür ile 1 gün 25 °C ' de. Not: Poly-l-lizin, poli-L-lizin hidrobromür yerine kullanılmamalıdır.</li>
		<li>2 ml Ultra Saf suyla 3 kez yıkayın. Kullanım süresi 25 °C ' de 1,5 mL stop medyası ile yemekleri kulbe etme.</li>
	</ol></li>
	<li>Fare embriyo hipokampal nöronların diseksiyon
	<ol>
<li>Hipokampal nöronların doku kaynağı. Hippocampus vahşi tipi ve TLCN-eksikliği C57BL6/J fareler embriyonik günlerde 16-17 lu ve al.19yöntemine göre incelemek.</li>
		<li>15 mm HEPES içeren HBSS 'de% 0,25 tripsin ve 1x dnasei 'de disseke hipokampi, 37 °c ' de 15 dk, her 3 dakikada bir ajitasyon ile pH 7,2. çözümü çıkarın. 5 dakika boyunca 4 °C ' de tripsin inaktive etmek için 10 mL STOP medyası içinde hipokampi 'yi kulbe etmek.</li>
		<li>Hippocampi 'yi 10 mL taze STOP ortamına taşıyın ve 5 dakika boyunca 4 °C ' de Inküye yapın. hipokampi 'yi 10 mL taze STOP ortamına taşıyın ve 5 dakika daha 4 °C ' de Inküye yapın. hipokampi 'yi 900 μL STOP orta ve 100 μL 'lik 10X DNaseI 'ye 15 mL tüp. 1 mL pipet kullanarak 20 kez pipetleme yaparak Hippocampi 'yi izole nöronlar haline yerleştirin. Not: 1 mL pipet ucu, Hippocampi 'nin dağılma sırasında 15 mL tüpün altına hafifçe dokunur.</li>
		<li>9 mL kaplama orta ekleyin ve 70 μm hücre süzgeci ile 50 mL 'Lik bir tüpün içine filtre uygulayın. Bir hemokytometer kullanarak hücre sayısını saymak ve 3,5 x 104 hücreler/ml kaplama orta ayarlayın.</li>
		<li>Poly-L-Lysine kaplı yemeklerden aspirate STOP orta. Poly-L-Lysine kaplı yemeklerle ilgili hücreleri 7 x 104 hücreli/çanak (2 ml/çanak) olarak plakaya atın.</li>
		<li>37 °C ' de% 5 CO2 altında inkübasyon 60-64 h sonra, nöronlara 2 μL ara-C stok solüsyonu (son 10 μM) ekleyin ve yemeği yavaşça sallayın. 37 °C ' de% 5 CO2 ' nin altında kültür ortamını değiştirmeden, kültür yemeklerini nemlendirilmiş bir kutuda tutun.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Dendritic Filopodia arıtma-zengin kesir
<ol><li>13 gün içinde vitro (DıV) sonra, kültür nöronları içeren 20 yemeklere manyetik polistiren mikroboncuk (3 x 106 parçacıklar/çanak) ekleyin. 1 gün sonra, orta ve ilişkisiz mikroboncuk kaldırmak için 3 kez ajitasyon ile PBS 1 mL nöronlar yıkayın. PBS 'yi kaldırdıktan sonra 500 μL/Dish liziz tamponu (0,01% Triton X-100, EDTA-ücretsiz proteaz inhibitörü kokteyli ve fosfataz inhibitörü kokteyli) içeren nöronlar ile Lyse.</li>
	<li>Bir hücre kazıyıcı ile lysate toplamak ve düşük protein bağlayıcı mikrotüpler (10 tüpler) için lysate taşıyın. Bir mıknatıs ayırıcı üzerinde tüpler ayarlayın ve 1 dakika bekleyin. süpernatant toplamak ve gümüş boyama ve Batı leke analizi için ilişkisiz fraksiyonu olarak kullanın.</li>
	<li>Yeni bir düşük protein bağlayıcı mikrotüp için boncuklar aktarmak, bir manyetik ayırıcı ayarlamak, ve tamamen supernatant kaldırmak. 500 μL liziz tampon ekleyin ve 15 s için bir Vortex karıştırıcı kullanarak boncuklar yıkayın. bir mıknatıs ayırıcı üzerinde tüp ayarlayın, 1 dakika bekleyin, supernatant kaldırmak ve 500 μL liziz tampon ekleyin. Boncuklar 10 kez yıkamak ve supernatant kaldırmak tekrarlayın.</li>
	<li>50 μL 1x SDS örnek tampon (62,5 mM Tris HCl, pH 6,8,% 2,5 SDS ve% 10 gliserol) ilavesi ile boncuklar (bağlı fraksiyonu) bağlı elute proteinleri ve 5 dakika için 98 °C ' de tüp kaynatın. 10 s için 860 x g boru santrifüj ve tüp ayarlamak 1 dakika için bir manyetik ayırıcı üzerinde süpernatant toplamak ve bağlı fraksiyonu olarak kullanın. Not: Protokol burada duraklatılmış olabilir.</li>
	<li>BCA protein tahlil tarafından ilişkisiz ve bağlı fraksiyonları protein konsantrasyonları ölçmek. Protein çözümlerini bromophenol mavisi ile görselleştirin ve konsantrasyonu SDS-PAGE için 5 NG/μL olarak ayarlayın.</li>
</ol>3. gümüş boyama ve Batı Blot Analizi
<ol><li>Bağlı ve ilişkisiz kesirleri (50 ng) SDS-PAGE tarafından% 5-20 gradyan jeli kullanarak ayırın. Jel gümüş leke.</li>
	<li>Batı leke Anti-tlcn-C (1/3000) kullanarak, Anti-sığır vitronektin (1/5000), Anti-aksin (1/1000), ve anti-α-tubulin (1/1000) Primer antikorlar ve HRP-konjuze keçi Anti-tavşan IgG (1/5000) ikincil antikor olarak. Antijenleri chemiluminesans Batı blotting algılama Reakajına ve bir kemiluminesans görüntüleyiciler kullanarak görselleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>Fiala, J. C., Feinberg, M., Popov, V., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptogenesis+via+dendritic+filopodia+in+developing+hippocampal+area+CA1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptogenesis via dendritic filopodia in developing hippocampal area CA1.</a> Journal of Neuroscience. 18 (21), 8900-8911 (1998).</li>
<li>Portera-Cailliau, C., Pan, D. T., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-regulated+dynamic+behavior+of+early+dendritic+protrusions%3A+evidence+for+different+types+of+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Activity-regulated dynamic behavior of early dendritic protrusions: evidence for different types of dendritic filopodia.</a> Journal of Neuroscience. 23 (18), 7129-7142 (2003).</li>
<li>Ziv, N. E., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+a+role+of+dendritic+filopodia+in+synaptogenesis+and+spine+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Evidence for a role of dendritic filopodia in synaptogenesis and spine formation.</a> Neuron. 17 (1), 91-102 (1996).</li>
<li>Lohmann, C., Bonhoeffer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+local+calcium+signaling+in+rapid+synaptic+partner+selection+by+dendritic+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for local calcium signaling in rapid synaptic partner selection by dendritic filopodia.</a> Neuron. 59 (2), 253-260 (2008).</li>
<li>Yoshihara, Y., De Roo, M., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+formation+and+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine formation and stabilization.</a> Current Opinion in Neurobiology. 19 (2), 146-153 (2009).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+human+and+mouse+postsynaptic+proteomes+finds+high+compositional+conservation+and+abundance+differences+for+key+synaptic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative study of human and mouse postsynaptic proteomes finds high compositional conservation and abundance differences for key synaptic proteins.</a> PLoS One. 7 (10), e46683(2012).</li>
<li>Bayes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+proteome%2C+diseases+and+evolution+of+the+human+postsynaptic+density%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Characterization of the proteome, diseases and evolution of the human postsynaptic density.</a> Nature Neuroscience. 14 (1), 19-21 (2011).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+between+telencephalin+and+ERM+family+proteins+mediates+dendritic+filopodia+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Interaction between telencephalin and ERM family proteins mediates dendritic filopodia formation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (33), 8866-8876 (2007).</li>
<li>Mao, Y. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filopodia+Conduct+Target+Selection+in+Cortical+Neurons+Using+Differences+in+Signal+Kinetics+of+a+Single+Kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Filopodia Conduct Target Selection in Cortical Neurons Using Differences in Signal Kinetics of a Single Kinase.</a> Neuron. 98 (4), 767-782 (2018).</li>
<li>Matsuno, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin+slows+spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Telencephalin slows spine maturation.</a> Journal of Neuroscience. 26 (6), 1776-1786 (2006).</li>
<li>Raemaekers, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ARF6-mediated+endosomal+transport+of+Telencephalin+affects+dendritic+filopodia-to-spine+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">ARF6-mediated endosomal transport of Telencephalin affects dendritic filopodia-to-spine maturation.</a> The EMBO Journal. 31 (15), 3252-3269 (2012).</li>
<li>Mori, K., Fujita, S. C., Watanabe, Y., Obata, K., Hayaishi, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalon-specific+antigen+identified+by+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Telencephalon-specific antigen identified by monoclonal antibody.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (11), 3921-3925 (1987).</li>
<li>Yoshihara, Y., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telencephalin%3A+a+neuronal+area+code+molecule%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Telencephalin: a neuronal area code molecule?</a> Neuroscience Research. 21 (2), 119-124 (1994).</li>
<li>Annaert, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+telencephalin+and+the+amyloid+precursor+protein+predicts+a+ring+structure+for+presenilins%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Interaction with telencephalin and the amyloid precursor protein predicts a ring structure for presenilins.</a> Neuron. 32 (4), 579-589 (2001).</li>
<li>Furutani, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitronectin+induces+phosphorylation+of+ezrin%2Fradixin%2Fmoesin+actin-binding+proteins+through+binding+to+its+novel+neuronal+receptor+telencephalin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Vitronectin induces phosphorylation of ezrin/radixin/moesin actin-binding proteins through binding to its novel neuronal receptor telencephalin.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 39041-39049 (2012).</li>
<li>Nyman-Huttunen, H., Tian, L., Ning, L., Gahmberg, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((alpha-Actinin-dependent+cytoskeletal+anchorage+is+important+for+ICAM-5-mediated+neuritic+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">alpha-Actinin-dependent cytoskeletal anchorage is important for ICAM-5-mediated neuritic outgrowth.</a> Journal of Cell Biology. 119 (Pt 15), 3057-3066 (2006).</li>
<li>Esselens, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presenilin+1+mediates+the+turnover+of+telencephalin+in+hippocampal+neurons+via+an+autophagic+degradative+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Presenilin 1 mediates the turnover of telencephalin in hippocampal neurons via an autophagic degradative pathway.</a> Journal of Cell Biology. 166 (7), 1041-1054 (2004).</li>
<li>Furutani, Y., Yoshihara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Analysis+of+Dendritic+Filopodia-Rich+Fraction+Isolated+by+Telencephalin+and+Vitronectin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Proteomic Analysis of Dendritic Filopodia-Rich Fraction Isolated by Telencephalin and Vitronectin Interaction.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 10, 27(2018).</li>
<li>Lu, Z., Piechowicz, M., Qiu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Simplified+Method+for+Ultra-Low+Density%2C+Long-Term+Primary+Hippocampal+Neuron+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A Simplified Method for Ultra-Low Density, Long-Term Primary Hippocampal Neuron Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (109), (2016).</li>
<li>Okabe, S., Miwa, A., Okado, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+of+the+C-terminal+domain+regulates+cell+surface+expression+of+the+NMDA+receptor+NR1+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing of the C-terminal domain regulates cell surface expression of the NMDA receptor NR1 subunit.</a> The Journal of Neuroscience. 19 (18), 7781-7792 (1999).</li>
<li>Okabe, S., Vicario-Abejon, C., Segal, M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+and+synaptogenesis+of+hippocampal+neurons+without+NMDA+receptor+function+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Survival and synaptogenesis of hippocampal neurons without NMDA receptor function in culture.</a> European Journal of Neuroscience. 10 (6), 2192-2198 (1998).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Biz, hücre yapışma molekül TLCN ve ekstrasellüler matris protein vitronektin arasında benzeşimi kullanarak dendritik filopodia zengin fraksiyonu için bir arıtma yöntemi geliştirdi. PSD kesir ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia zengin fraksiyondan olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket sinaptik proteinlerin tanımlamak mümkün olabilir. Böylece, dendritik filopodia zengin fraksiyonu bileşenleri% 74 tarafından PSD kesir olandan farklıdır. PSD kesir farklı, biz aktif fagositik bardak oluşturmak için kültürlü hipokamp...

Dendritik filopodia, spines öncüleri olduğu düşünülmektedir. Dendritik filopodia içinde actin filamin uzatma ve retraksiyon1,2,3düzenler. Bir Axon ile temas ettikten sonra, seçilmiş dendritik filopodia, olgunlaşmasını spines içine başlar ve bir sinaps4,5oluşur. Dikenler bileşenleri postsinaptik yoğunluk kesirler6,7kapsamlı analizinden belirlendi, dendritik filopodia bileşenleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır süre. Bu, telencephalin (tlcn), erm, syngap, RAS, pıkinaz, AKT, mTOR, Polo benzeri kinaz 2, camkii, syndecan-2, paralemin-1, ARF6 ve ephb, dendritik filopodia oluşumu5,8,9 düzenleyen gösterildi ,10,11, bir yöntem ise dendritik filopodia mevcut moleküllerin kapsamlı analizi için geliştirilmiştir değil.
Tlcn (ICAM-5) özellikle en rostral beyin segmentinde dikenli nöronlar tarafından ifade edilir, telencephalon12. TLCN, hücre dışı bölgesinde 9 IG benzeri etki alanı, bir transmembran bölgesi ve sitoplazmik kuyruk13' ü vardır. Tlcn, hücre dışı bölgesinde vitronektin (VN) ve LFA-1 integrine, transmembran bölgesinde presenilin 'e, sitoplazmik bölgesinde fosho-ERM ve α-actinin 'e bağlar5,8,14,15 ,16. Tlcn, dikenler ve dendritik şaftlar içinde dendritik filopodia ve α-actinin iplerinde phospho-ERM yoluyla akin sitoiskelet bağlar8,16.
Biz tlcn gelişmiş dendritik filopodia oluşumu ekspresyonu gösterdi ve filopodia10için dikenler reversion indüklenmiş. Teknikerleriniz 'in kurucu aktif formu tlcn sitoplazmik bölgeye bağlı ve gelişmiş dendritik filopodia oluşumu8. Böylece TLCN, akin bağlayıcı proteinlerle dendritik filopodia oluşumunu düzenler. Esselens ve ark. mikroboncuklar kültürsüz nöronlar üzerinde TLCN birikimi kaynaklı gösterdi17. Fagositik fincan yapısının, VN kaplı mikroboncuk etrafında nöronal dendritler üzerinde, TLCN-bağımlı bir biçimde15' te oluştuğunu gösterdik. Dendritik filopodia bileşenleri fagositik kupalar benzer. Dendritik filopodia toplamak zordur, ama manyetik mikroboncuk kullanarak fagositik fincan toplamak nispeten daha kolaydır. Böylece, dendritik filopodia18yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Burada, dendritik filopodia zengin fraksiyonu için arıtma yöntemi açıklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>1 M HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mLl Düşük Bağlayıcı MCT</td><td>Sorenson BioScience</td><td>39640T</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>2530149</td><td></td></tr><tr><td>35 mm plastik hücre kültürü kapları</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Anti-aktin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-aktinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5044</td><td></td></tr><tr><td>Anti-alfa-tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9026</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ezrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>klonu3C12, SAB4200806</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Galphaq</td><td>Santacruz</td><td>sc-393</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MAP2</td><td>Chemicon</td><td>klonu AP20, MAB3418</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Moesin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>klonu 38/87, M7060</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PLCbeta1</td><td>Santacuz</td><td>sc-5291</td><td></td></tr><tr><td>Anti-PSD95</td><td>MA2</td><td>ABR</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Spectrin beta</td><td>Chemicon</td><td>MAB1622</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>0080085SA</td><td></td></tr><tr><td>BCA protein test kiti</td><td>Thermo</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Bromofenol mavisi</td><td>Merck</td><td>1.08122.0005</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum krolid, sulu</td><td>Wako</td><td>038-19735</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kazıyıcı</td><td>Falcon</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Kolin klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Komple EDTA içermeyen proteaz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>11873580001</td><td></td></tr><tr><td>Sitozin beta-D-arabinofuranosid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-6645</td><td></td></tr><tr><td>DNase-I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>D-Pantotenik asit hemikalsiyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5155</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıs</td><td>Termo</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Prime Western Blotting Tespit Reaktifi</td><td>GE</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>e-PAGEL %5-20 SDS-PAGE gradyan jel</td><td>ATTO</td><td>E-T520L</td><td></td></tr><tr><td>Folik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjuge anti-tavşan IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-035-144</td><td></td></tr><tr><td>i-Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7508</td><td></td></tr><tr><td>LAS-1000 mini</td><td>Fuji Film</td><td>LAS-1000 mini</td><td>WB membranından lüminesans tespiti için</td></tr><tr><td>Manyetik polistiren mikro boncuklar</td><td>Sperotech</td><td>PM-20-10</td><td></td></tr><tr><td>MEM amino asit çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>11130-051</td><td>30 mM L-Arginin hidroklorür, 5 mM L-Sistin, 10 mM L-Histidin hidroklorür-H2O, 20 mM L-İzolösin, 20 mM L-Lösin, 19.8 mM L-Lizin hidroklorür, 5.1 mM L-Metionin, 10 mM L-Fenilalanin, 20 mM L-Treonin, 2.5 mM L-Triptofan, 10 mM L-Tirozin ve 20 mM L-Valin</td></tr><tr><td>Mini döşeme boyutu elektroforez sistemi</td><td>ATTO</td><td>AE-6530</td><td></td></tr><tr><td>Niasinamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP fosfataz inhibitörü kokteyli</td><td>Roche</td><td>4906845001</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin hidrobromür</td><td>Nacali</td><td>28360-14</td><td></td></tr><tr><td>Piridoksal HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6155</td><td></td></tr><tr><td>Riboflavin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R9504</td><td></td></tr><tr><td>Gümüş Leke 2 Kit wako</td><td>Wako</td><td>291-5031</td><td></td></tr><tr><td>Tiamin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1270</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Yarı Kuru Transfer Hücresi</td><td>Bio-rad</td><td>1703940JA</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf su</td><td>MilliQ</td><td></td><td>Ultra saf su üretimi için</td></tr></tbody></table>

dendritic filopodia-zengin kesir arıtma

Purification of the Dendritic Filopodia-rich Fraction

Dendritik filopodia akinin filament dayalı ince ve uzun çıkıntılar, ve onlar uzatmak ve bir hedef Axon ararken gibi geri çekin. Dendritik filopodia bir hedef Akon ile temas kurduğunda, bir sinaps oluşumuna yol açan, spines içine olgunlaşmak başlar. Telencephalin (TLCN) oldukça dendritik filopodia lokalize ve yavaş yavaşça spines hariç tutulur. Kültürlü hipokampal nöronlar içinde TLCN aşırı ifade dendritik filopodia oluşumu indükler. Biz telencephalin güçlü bir hücre içi matris molekül, vitronektin bağlar gösterdi. Vitronectin kaplı mikrobilyeleri nöronal dendrites üzerinde fagositik fincan oluşumu kaynaklı. Phagositik kupada, TLCN, fosforilated ezrin/Radixin/Moesin (phospho-ERM) ve F-actin gibi TLCN-bağlayıcı proteinler birikir, bu da fagositik kupanın bileşenlerinin dendritik filopodia 'ya benzer olduğunu göstermektedir. Böylece, dendritik filopodia yerine fagositik kupayı arındırmak için bir yöntem geliştirdik. Manyetik polistiren boncuklar, hipokampal nöronların kültür ortamında bulunan ve nöronal dendrites üzerinde fagositik bardak oluşumunu tetikleyen vitronektin ile kaplanmıştır. 24 saat inkübasyon yapıldıktan sonra, fagositik bardak deterjan ile hafif bir şekilde çözünmeli ve mıknatıs ayırıcı kullanılarak toplanır. Boncukları yıkadıktan sonra, bağlayıcı proteinler gümüş boyama ve Batı bloplama ile incelenmiş ve analiz edilmiştir. Bağlayıcı fraksiyonda, tlcn ve aktin bol miktarda mevcut. Buna ek olarak, kesir tespit birçok protein dendritik filopodia lokalize edildi; Bu nedenle, biz dendritik filopodia-zengin fraksiyonu olarak bağlayıcı fraksiyonu adı. Bu makalede, dendritik filopodia zengin kesir için arıtma yöntemi ile ilgili ayrıntıları açıklar.

Kültürlü hipokampal nöronlar, TLCN oldukça dendritik filopodia, şaft lokalize ve Soma ve F-actin ile kolokalize (Şekil 1a, B). Kültürlü hipokampal nöronlara polistiren mikroboncuk eklendiğinde, boncuklar otomatik olarak kültür ortamında fetal sığır serumu (FBS) elde edilen vitronektin (VN) ile kaplanmıştır; temelde dendrites bağlı ve onlar fagositik bardak oluşumu indüklenen (Şekil 1B-E). Fagosit...

Bu protokolde, dendritik filopodial arasında belirli ve güçlü bir yakınlık yararlanarak kültürlü hipokampal nöronlar üzerinde fagositik fincan benzeri protrüzyon yapısı dendritik filopodia zengin fraksiyonu arındırmak için bir yöntem tanıtmak yapışma molekül, TLCN, ve bir ekstrasellüler matris molekül, vitronektin.

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Dendritic filopodia are thin and long protrusions based on the actin filament, and they extend and retract as if searching for a target axon. When the ...

PSD fraksiyonu ile karşılaştırıldığında, dendritik filopodia açısından zengin fraksiyonu etrafında olgunlaşmamış sinaps üzerinde hareket eden sinaptik proteini tanımlamak mümkün olabilir. Fagositik kapak oluşumunu tetiklemek için canlı nöron kullandık. Bu tekniğin en büyük avantajı, yapay yaratılıştaki aktif proteinin dendritik filopodia zengin fraksiyonundan saptanabildiğidir.Başlamak için, B5 vitamini 100 mg eriterek 200x Vitamin Mix hazırlamak, Kolin Klorür 100 mg, Folik Asit 100 mg, I-inositol 180 mg, B3 vitamini 100 mg, B6 vitamini hidroklorür 100 mg, ve 100 ultrasaf su 500 ml ultrasaf su 500 ml ultrasaf su kullanarak. Aliquot'u 50 ml'lik tüplerde dikkatlice karıştırın ve 20 santigrat derecede saklayın. Riboflavin çözeltisi hazırlamak için, manyetik bir karıştırıcı kullanarak ultrasaf su 500 mg riboflavin 100 mg çözünür.Aliquot'u 50 ml'lik tüplerde dikkatlice karıştırın ve 20 santigrat derecede saklayın. Bir azı kalsiyum diklorür hazırlamak için manyetik bir karıştırıcı kullanarak ultrasaf su 50 ml kalsiyum klorür dihidrat 7,35 gram çözünür. Minimum Esansiyel Orta hazırlık için 400 potasyum klorür mg 6, sodum klorür 800 mg, sodyum bikarbonat 200 mg, sodyum fosfat monobasic dih

purification-of-the-dendritic-filopodia-rich-fraction

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makalede, izolasyonu ve saflaştırılması için bir yöntem...

İzolasyon ve Arıtma Drosophila</emManyetik Boncuk Sıralama> Periferik Nöronlar

Bu aktif tam uzunlukta kinesin izole bir...

Kinesin İzolasyonu ve Saflaştırılması gelen Drosophila Embriyolar

Hücre kültüründen hücre içi, sitoplazmik tam uzunluklu protein DISC1 aggresomes ve bir etiketlenmiş, multimerik DISC1 rekombinant protein parçasının üretimi, saflaştırılması ve hücre...

Hücre-invaziv DISC1 Protein Türlerinin Üretimi, Saflaştırılması, ve Karakterizasyonu

Heterolog ifade ve kistik fibrozis transmembran iletkenlik regülatör (CFTR) saflaştırılması önemli sorunlar ve kistik fibrozis için ilaç tedavilerinin gelişiminde sınırlayıcı faktörler. Bu protokol, yapısal ve işlevsel çalışmalar için uygun CFTR miligram miktarları izolasyonu için iki yöntem açıklanır.

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Biz pDC fonksiyonel çalışmalar için, lupus-eğilimli farelerin kemik iliğinden, yüksek saflıkta plazmasitoid dendritik hücreleri (PDC) izole etmek için sıralama floresans ile aktive edilmiş hücre kullanarak bir protokol sunulmuştur.

Fare kemik iliğinden plazmasitoid dendritik hücreleri Saflaştırılması floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma

Bir yordam dCACHE periplasmic ligand bağlayıcı etki dahil organları ve protein miligram miktarlarda verim için arıtma Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3, refolding için sunulmaktadır.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Burada, verimli bir şekilde hücreleri mevcut Drosophila görsel sistemi aktif floresans hücreye (FACS) sıralama içinde düşük bereket, izole bir hücre ayrılma protokol mevcut.

Drosophila görsel sistem düşük bol hücrelerinin arıtma

Bu fraksiyonasyon protokolü, araştırmacıların sitoplazmik, nükleer, mitokondriyal ve membran proteinlerini memeli hücrelerinden izole etmelerini sağlayacaktır. Son iki hücre altı fraksiyon, izopiknik yoğunluk gradyanı ile daha da saflaştırılır.

U937 Hücrelerinin İzopiknik Yoğunluk Degrade Saflaştırması ile Hücre Fraksiyonasyonu

INAD protein kompleksinin montaj mekanizmasına dayanarak, bu protokolde, endojen Drosophila TRP kanalını saflaştırmak için modifiye edilmiş bir afinite saflaştırma artı rekabet stratejisi geliştirilmiştir.

Endojen Drosophila Geçici Reseptör Potansiyel Kanallarının Saflaştırılması

Hücre iskeleti proteinlerinin in vitro resusyonu, bu proteinlerin temel fonksiyonel özelliklerini anlamak için hayati bir araçtır. Bu yazıda, hücre bölünmesi ve göçünde merkezi bir rol oynayan rekombinant septin komplekslerinin saflaştırılması ve kalitesinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Hücresiz Sulandırma için Rekombinant Septin Komplekslerinin Saflaştırılması ve Kalite Kontrolü

Öğrenin, hipokampal nöronlardan dendritik filopodia-zengin kesir arıtma yöntemiyle immatür sinaps proteinlerini izole etmeyi. Bu teknik, sinaptik plastisite ve nöronal gelişim mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Dendritic Filopodia-zengin kesir arıtma

Daha fazla video keşfet