Name: Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Öğrenin, iyonize radyasyonun tümör hücre çekimini nasıl etkilediğini fare meme bezlerinden elde edilen organoidler kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem, kanser nüks mekanizmalarını anlamak için önemli bilgiler sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz GFP ve dTomato etiketli RAW 264,7 macrofajlar sağlamak için Dr Laura L. Bronsart teşekkür ederiz. Bu araştırma NıH Grant #R00CA201304 tarafından mali olarak destekleniyordu.

Hayvan çalışmaları, Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanan kurumsal yönergeler ve protokollere uygun olarak yapılmıştır.
1. fareler ve hücre alımı hazırlanması (Nguyen-Ngoc ve al.11uyarlanmıştır)
<ol><li>Co2 boğulma kullanarak atymic Nu/nu fareler (8-10 hafta eski) kurban servikal dislocation takip. 70% etanol kullanarak cildi temizleyin.</li>
	<li>Ön sterilize makas ve forseps kullanarak farelerden karın ve inguinal meme bezlerini RESECT. Rezeksiyondan önce lenf nodları çıkarın. Steril 1x fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde durulayın (Şekil 1a).</li>
	<li>15 mL borular ile yerleştirin 10 mL Dulbecco 's modifiye kartal medya/besin karışımı F12 (DMEM/F12) taşıma için. Numuneler gece 4 °C ' de muhafaza edilebilir veya hemen işlenir. Buzdan devam et.</li>
	<li>Bir sezyum kaynağı kullanarak 20 GY 'de radyasyon örnekleri (Şekil 1B).</li>
	<li>45 min ışınladıktan sonra, 35 mm Steril hücre plakasında meme bezlerini yerleştirin ve neşter ile kıyma (Şekil 1C, D). Yaklaşık 40 strok ile Mince doku rahatlatır ve parçalar yaklaşık 1 mm2 alanda daha büyük olan elde edilir kadar.</li>
	<li>50 ml santrifüj tüpünde kolajenaz çözüme aktarın. Kolajenaz çözeltisi oluşur 2 mg/ml kolajenaz (bkz. malzeme tablosu), 2 mg/ml tripsin, 5% v/v fetal Sığır serum (FBS), 5 μg/ml insülin, ve 50 μg/ml gentaminisin dmem/F12 medya. Fare başına 10 ml kolajenaz çözümünü kullanın.</li>
	<li>37 °c ' de bir su banyosuna yerleştirin, her 10 dakikada bir 30-60 dk için vortekslenir. kolajenaz çözeltisi bulutlu olduğunda sindirim tamamlanır (Şekil 1E, F).</li>
	<li>450 x g 'de, Oda SıCAKLıĞıNDA (RT) 10 dakika boyunca sindirilmiş solüsyonu aşağı döndürün. Üç katman gözlenir. Süpernatant yağ oluşur, orta tabaka sulu bir çözümdür, ve alt bir Pelet olduğunu. Bu epitelyal hücrelerin bir karışımı olduğu gibi Pelet kırmızı görünecektir, bireysel stromal hücreler, ve kırmızı kan hücreleri (Şekil 1G).</li>
	<li>Tüm Pipetler, pipet uçları ve Santrifüjlü tüpleri, temas etmeden önce Sığır serum albümin (BSA) çözeltisi ile önkat. BSA çözeltisi, Dulbecco fosfat tampon tuzlu (DPBS) 2,5 w/v% BSA oluşur. Ön kaplama için, sadece sonra pipet ucu ve tüpler içine BSA solüsyonu kaldırmak ekleyin. Her denemede steril olmalıdır, ancak BSA çözüm yeniden kullanılabilir.</li>
	<li>Ek iyileşme için, süpernatant taze bir BSA kaplı 15 ml tüp aktarın. Pipet yukarı ve aşağı şiddetle yağ tabakası dağıtmak için. 450 x g 'de santrifüjler, RT 'de 10 dk. supernatant aspirate, hücre Pelet duman çekiş önlemek için tüp medya küçük bir miktar bırakarak.</li>
	<li>Orijinal Pellet ile tüpten sulu tabaka aspirate.</li>
	<li>Orijinal Pelet ile tüp için dmem/F12 10 ml ekleyin ve ikinci tüp transfer. Pipette, iki Pelet birleştirmek ve yeniden pelletini için şiddetle.</li>
	<li>450 x g 'de santrifüjte 10 dk. süpernatant aspirate ve tüp 4 ml dmem/F12 ekleyin.</li>
	<li>40 μL deoksiribonükleaz (DNase) için süspansiyona ekleyin ve RT. DNase çözeltisi içinde 2-5 dk için yavaşça elle sallamak dmem/F12 4 U/ml DNase oluşur.</li>
	<li>6 mL DMEM/F12 ve pipet iyice ekleyin. Tüp Santrifüjü 450 x g 'de 10 dakıka boyunca RT.</li>
	<li>0,5 ml işaretine süpernatant aspirate. Resuspend 10 mL DMEM/F12 ve pipet iyice.</li>
	<li>Nabız 450 x g ve stop 4 s bu hıza ulaştıktan sonra.</li>
	<li>Adım 1.16-1.17 üç kez daha santrifüj farklılaşma yoluyla organoidleri arındırmak için yineleyin. Pelet artık sadece epitelyal organoidlerden oluşan kapalı-beyaz bir renk olmalıdır (Şekil 1s). Not: Organoids Ayrıca steril Mesh 40 μm filtreleri kullanılarak filtrelenebilir. Adım 1,16 sonra, bir santrifüj tüpüne bir filtre aracılığıyla organoids içeren pipet medya ve sonra 5 ila 10 mL DMEM/F12 medya ile durulayın. Yeni 50 mL santrifüj tüpünün üzerine filtreyi çevirin. Pass 10 mL DMEM/F12 medya üzerinden, herhangi bir retentate durulamak için ters şekilde gidiyor. Retentat organoidler oluşmalıdır, ve filtrat özellikle atılabilir veya istenirse tutulan stromal hücrelerin, oluşmalıdır.</li>
</ol>2. yoğunluk ve kaplama organoidlerin belirlenmesi
<ol><li>10 ml dmem/F12 resuspend Pelet. Homojen bir çözüm oluşturmak için pipet iyice.</li>
	<li>50 μL 'ye transfer 30 mm Petri tabağı ve 20X 'de faz kontrast mikroskobu altında görüntüleyin. Bir sayım sayacı ile organoids sayısını saymak. Not: burada pipet uçları, en az 457 μm çap ile tutarlı bir şekilde kullanılmıştır ve bu da tohum organoidlerin 5-10 kat çapıdır. 2 mL veya daha büyük hacimleri aktarmak için (örn. 1,16 ve 2,1 basamakları), 1.500 μm den fazla uç çapıyla serolojik pipetler kullanın.</li>
	<li>Aşağıdaki denklemini kullanarak nevuslardır yoğunluğunu hesaplayın: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/59293/59293eq1.jpg"> İstenen yoğunluk 1.000 daha fazla seyreltme basitleştirmek için organoids/mL olduğunu. Yoğunluk çok düşükse, 5 dk ve Aspire medya için 450 x g Santrifüjü. 1.000 organoids/mL ulaşmak için gerekli medya ekleyin ve homojen bir karışım oluşturmak için iyice pipet.<ol>
<li>Bir protein matrisinde organoidler büyümek için, 1 organoid/L kollajen tip 1 konsantrasyonunda tohum organoidler% 87 veya Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomu çıkarılan Bodrum membranda seyreltilmiş. Örneklerle çalışırken buz üzerinde tutun.</li>
		<li>Organoidleri dondurmak için, istenilen hacmi ayrı bir santrifüj tüpüne aktarın. 5 dk. Aspirate medya için 450 x g aşağı spin ve sonra aynı hacim eklemek 90% FBS/10% DMSO. Organoids yeniden resuspend, ve sonra cryotubes içine kısım. -80 °C ' ye transfer ve sonra bir hafta içinde sıvı nitrojen.</li>
		<li>Bir dakika için 37 °c ' lik su banyosunda ısıtmak için bir dk. 5 dakika için 450 x g Santrifüjü ve sonra donma ortamını Aspire. Steril DPBS ile durulayın ve sonra tekrar santrifüjün. Dpbs aspirate ve nevuslardır medya ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pipet 50 μL (50 organoids) düşük yapışma plakasının her bir kuyusu içine (Şekil 1I).</li>
	<li>Toplam çalışma hacmini 200 μL 'ye getirmek için 150 μL nevuslardır medya ekleyin. nevuslardır medya 1% penisilin-streptomisin ve 1% insülin-transferrin-selenyum (onun) dmem/F12 medyada oluşur.</li>
	<li>Her 2 günde bir medyayı dikkatlice değiştirin. Not: düşük yapışma plakaları tedavi doku kültürü değildir; Bu nedenle, hücreler kolaylıkla ayrılabilir. Plakayı eğerek ve her bir kuyu kenarına Pipet ucunu takarak medyayı yavaşça aspirate. Kuyu altında medya küçük bir miktar bırakın. Organoidlere gereksiz kesme güçleri uygulamadan kaçınmak için yavaşça yeni medya ekleyin.</li>
</ol>3. makrofajlar ile birlikte kültür
<ol><li>% 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin ile desteklenen DMEM medyada GFP veya dTomato etiketli RAW 264,7 macrofajlar koruyun. Tohum 1 x 104, 5 x 104, veya 1 x 105 hücreler/ml nevuslardır medya içine.</li>
	<li>Zaman içinde makrophaj infiltrasyonu izlemek için canlı hücre faz kontrastı ve floresan görüntüleme kullanın.</li>
</ol>4. organoids immünofluorescence boyama
Not: Organoids düşük yapışma kuyuları içinde lekelenmiş olabilir veya oda slaytlarına transfer edilebilir. Transfer etmek için, organoidler plakalardan ayrılıncaya kadar yavaşça yukarı ve aşağı pipet çıkarın. Oda kaydıraklarına transfer ve 4-8 h için inkük, organoidlerin plaka yüzeyine uymasına izin verir.
<ol><li>Dikkatle aspirating tarafından kuyulardan nevuslardır orta çıkarın. RT 'de 15 dakika boyunca% 10 nötr tampon formalin ile örnekleri düzeltin.</li>
	<li>1x PBS 'de 3x 5 dk yıkayın. İstenirse, sabit numuneler daha fazla boyama için bir hafta boyunca 4 °C ' de depolanabilir.</li>
	<li>5 dakika boyunca 0,1% 4-(1, 1, 3, 3-Tetramethylbutyl) fenil-Polietilen glikol ile geçirgen. Not: F-actin için leke Için, phalloidin seyreltilmiş 1:1000 ve 1,67 nM bisbenzimid nükleer boya 1% PBS/BSA içinde RT 1 h için numuneleri inkük. Ardından, 4,8 adıma geçin.</li>
	<li>0.5 PBS ile bermeabilize. Örnekler 4opy görüntülerinde ve immünofluorescent görüntülerde depolanabilir. 0,1% PBS/Polietilen glikol Sorbitan monolaurat (PBST) içinde% 5 normal keçi serumu ile CTC RLOCK 'a katkıda bulunan mekanizmalar, RT 'de 1 h. yıkama 3x 5 dk</li>
	<li>Anti-Siteratin ile inküye 14 seyreltilmiş 1:1000, E-cadherin seyreltilmiş 1:200, veya sıkı kavşak proteini bir seyreltilmiş 1:100 1% NGS içinde PBST 1 h için RT. yıkama 3x 5 dakika PBST.</li>
	<li>Keçi karşıtı ikinci seyreltilmiş 1:200, RT 'de 1 h için 1% NGS/PBST ile kulkaylar. ışık maruz kalma önlemek için folyo ile kapak.</li>
	<li>PBS 'de 3x 5 dakika yıkayın. Çekirdekleri leke için nükleer boya ( malzeme tablosunabakın) kullanın.</li>
	<li>PBS 'de 3x 5 dakika yıkayın. Eğer oda kaydırağı kullanıyorsanız, bir coverslip ile monte edin. 2 haftaya kadar 4 °C ' de folyoyla sarılmış mağaza.</li>
</ol>

<ol><li>Lautner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disparities+in+the+Use+of+Breast-Conserving+Therapy+Among+Patients+With+Early-Stage+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Medical+Association+Surgery%22%5BJournal%5D)">Disparities in the Use of Breast-Conserving Therapy Among Patients With Early-Stage Breast Cancer.</a> Journal of the American Medical Association Surgery. 150 (8), 778-786 (2015).</li>
<li>Lowery, A., Kell, M., Glynn, R., Kerin, M., Sweeney, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locoregional+recurrence+after+breast+cancer+surgery+a+systematic+review+by+receptor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">Locoregional recurrence after breast cancer surgery a systematic review by receptor phenotype.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 133, 831-841 (2012).</li>
<li>Kim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+Self-Seeding+by+Circulating+Cancer+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor Self-Seeding by Circulating Cancer Cells.</a> Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).</li>
<li>Vilalta, M., Rafat, M., Giaccia, A. J., Graves, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+Circulating+Breast+Cancer+Cells+Is+Stimulated+by+Radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Recruitment of Circulating Breast Cancer Cells Is Stimulated by Radiotherapy.</a> Cell Reports. 8 (2), 402-409 (2014).</li>
<li>Rafat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+Promote+Circulating+Tumor+Cell-Mediated+Local+Recurrence+following+Radiotherapy+in+Immunosuppressed+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Macrophages Promote Circulating Tumor Cell-Mediated Local Recurrence following Radiotherapy in Immunosuppressed Patients.</a> Cancer Research. 78 (15), 4241-4252 (2018).</li>
<li>Shamir, E. R., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+organotypic+culture%3A+Experimental+models+of+mammalian+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).</li>
<li>Simian, M., Hirai, Y., Navre, M., Werb, Z., Lochter, A., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interplay+of+matrix+metalloproteinases%2C+morphogens+and+growth+factors+is+necessary+for+branching+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The interplay of matrix metalloproteinases, morphogens and growth factors is necessary for branching of mammary epithelial cells.</a> Development. 128, Cambridge, England. 3117-3131 (2001).</li>
<li>Shamir, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Twist1-induced+dissemination+preserves+epithelial+identity+and+requires+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Twist1-induced dissemination preserves epithelial identity and requires E-cadherin.</a> Journal of Cell Biology. 204 (5), 839-856 (2014).</li>
<li>Ewald, A. J., Brenot, A., Duong, M., Chan, B. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+Epithelial+Migration+and+Cell+Rearrangements+Drive+Mammary+Branching+Morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Collective Epithelial Migration and Cell Rearrangements Drive Mammary Branching Morphogenesis.</a> Developmental Cell. 14, 570-581 (2008).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ECM+microenvironment+regulates+collective+migration+and+local+dissemination+in+normal+and+malignant+mammary+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">ECM microenvironment regulates collective migration and local dissemination in normal and malignant mammary epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 89 (19), E2595-E2604 (2012).</li>
<li>Nguyen-Ngoc, K. -V., Shamir, E. R., Huebner, R. J., Beck, J. N., Cheung, K. J., Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+Culture+Assays+of+Murine+Mammary+Branching+Morphogenesis+and+Epithelial+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Morphogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D Culture Assays of Murine Mammary Branching Morphogenesis and Epithelial Invasion.</a> Tissue Morphogenesis: Methods and Protocols. 1189, 135-162 (2015).</li>
<li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+mammary+organoids+for+long-term+time-lapse+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse mammary organoids for long-term time-lapse imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8 (2), 130-133 (2013).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%22%5BJournal%5D)">Organoids in cancer research.</a> Nature Reviews. , (2018).</li>
<li>DeNardo, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD4%2BT+Cells+Regulate+Pulmonary+Metastasis+of+Mammary+Carcinomas+by+Enhancing+Protumor+Properties+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">CD4+T Cells Regulate Pulmonary Metastasis of Mammary Carcinomas by Enhancing Protumor Properties of Macrophages.</a> Cancer Cell. 16 (2), 91-102 (2009).</li>
<li>Plaks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+Immune+Regulation+of+Mammary+Postnatal+Organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Adaptive Immune Regulation of Mammary Postnatal Organogenesis.</a> Developmental Cell. 34 (5), 493-504 (2015).</li>
<li>Mandl, I., McLennan, J. D., Howes, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Proteinase+and+Collagenase+Fromcl.+Histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Proteinase and Collagenase Fromcl. Histolyticum.</a> The Journal of Clinical Investigation. 32, 1323-1329 (1953).</li>
<li>Mandl, I., Zaffuto, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serological+Evidence+for+a+Specific+Clostridium+histolyticum+Geltinase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Serological Evidence for a Specific Clostridium histolyticum Geltinase.</a> The Journal of General Microbiology. 18, 13-15 (1958).</li>
<li>Bond, M. D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Individual+Collagenases+from+Clostridium+histolyticum%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Individual Collagenases from Clostridium histolyticum.</a> Biochemistry. 23 (13), 3085-3091 (1984).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+estrogen-responsive+mouse+mammary+organoids+from+single+Lgr5%2Bcells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">Establishing estrogen-responsive mouse mammary organoids from single Lgr5+cells.</a> Cellular Signalling. 29, 41-51 (2016).</li>
<li>Sokol, E. S., Miller, D. H., Breggia, A., Spencer, K. C., Arendt, L. M., Gupta, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+breast+tissues+from+patient+cells+in+3D+hydrogel+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds.</a> Breast Cancer Research. 18 (1), 1-13 (2016).</li>
<li>Richert, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atlas+of+mouse+mammary+gland+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">An atlas of mouse mammary gland development.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 5 (2), 227-241 (2000).</li>
<li>Maier, P., Hartmann, L., Wenz, F., Herskind, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+pathways+in+response+to+ionizing+radiation+and+their+targetability+for+tumor+radiosensitization%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cellular pathways in response to ionizing radiation and their targetability for tumor radiosensitization.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), (2016).</li>
<li>LaBarge, M. A., Garbe, J. C., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Human+Reduction+Mammoplasty+and+Mastectomy+Tissues+for+Cell+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture.</a> Journal of Visualized Experiments. (71), (2013).</li>
<li>Campbell, J. J., Botos, L. A., Sargeant, T. J., Davidenko, N., Cameron, R. E., Watson, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3-D+in+vitro+co-culture+model+of+mammary+gland+involution%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology+%28United+Kingdom%29%22%5BJournal%5D)">A 3-D in vitro co-culture model of mammary gland involution.</a> Integrative Biology (United Kingdom). 6, 618-626 (2014).</li>
<li>Chanson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+is+a+dynamic+and+lineage-intrinsic+property+of+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Self-organization is a dynamic and lineage-intrinsic property of mammary epithelial cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 14 (7), 2293-2306 (2011).</li>
<li>Chua, A. C. L., Hodson, L. J., Moldenhauer, L. M., Robertson, S. A., Ingman, W. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+for+macrophages+in+ovarian+cycle-associated+development+and+remodelling+of+the+mammary+gland+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles for macrophages in ovarian cycle-associated development and remodelling of the mammary gland epithelium.</a> Development. 137, Cambridge, England. 4229-4238 (2010).</li>
<li>Ingber, D., Folkman, J. Mechanochemical switching between growth and differentiation during fibroblast growth factor-stimulated angiogenesis in vitro: role of extracellular matrix. The Journal of Cell Biology. 109 (July), Available from:
 <a target="_blank" href="http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract">http://jcb.rupress.org/content/109/1/317.abstract</a> (1989).</li>
<li>Gregoire, F. M., Smas, C. M., Sul, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+Adipocyte+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Understanding Adipocyte Differentiation.</a> Physiological Reviews. 78 (3), 783-809 (1998).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Methods+of+Adipogenic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current Methods of Adipogenic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Gabryś, D., Greco, O., Patel, G., Prise, K. M., Tozer, G. M., Kanthou, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+Effects+on+the+Cytoskeleton+of+Endothelial+Cells+and+Endothelial+Monolayer+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology%2C+Biology%2C+Physics%22%5BJournal%5D)">Radiation Effects on the Cytoskeleton of Endothelial Cells and Endothelial Monolayer Permeability.</a> International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 69 (5), 1553-1562 (2007).</li>
<li>Ewald, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+for+long-term+time-lapse+imaging+of+epithelial+morphogenesis+in+three-dimensional+organotypic+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Practical considerations for long-term time-lapse imaging of epithelial morphogenesis in three-dimensional organotypic cultures.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 8, 100-117 (2013).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high+M1%2FM2+ratio+of+tumor-associated+macrophages+is+associated+with+extended+survival+in+ovarian+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ovarian+Research%22%5BJournal%5D)">A high M1/M2 ratio of tumor-associated macrophages is associated with extended survival in ovarian cancer patients.</a> Journal of Ovarian Research. 7 (1), 1-16 (2014).</li>
<li>Ma, J., Liu, L., Che, G., Yu, N., Dai, F., You, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+form+of+tumor-associated+macrophages+in+non-small+cell+lung+cancer+is+positively+associated+with+survival+time%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Central+Cancer%22%5BJournal%5D)">The M1 form of tumor-associated macrophages in non-small cell lung cancer is positively associated with survival time.</a> BioMed Central Cancer. 10, 112(2010).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Bu protokolde, ışınlanmış meme organoidlerin tekrarlanabilir büyümesi ve karakterize edilmesi için bir yöntem geliştirdik (Şekil 1). Tümör hücresi işe alma5' in vivo modellerinin önceki yansımaları Için 20 GY ışınlama dozu uygulandı. Meme bezlerinin ışınlanması ex vivo önce nevuslardır oluşumu bağışıklık hücrelerinin karşılık gelen infiltrasyon olmadan radyasyon hasar etkileri yalıtım için izin. Bir in vitro ışınlanmış normal doku modeli gelişimi radyasyon indüklenen ...

Üçlü negatif meme kanseri (TNBC) hastalarının yaklaşık% 60 ' i meme arıtma terapisi (BCT) tedavi formu olarak seçilir1. Bu tedavi modalitesi, meme dokusunun bir kısmını içeren tümör kaldırılır, ve çevredeki normal doku herhangi bir kalıntı tümör hücrelerini öldürmek için iyonlaştırıcı radyasyona maruz kalır. Tedavi meme kanseri nüfusunun çoğunu tekrarı azaltır; Ancak TNBC ile tedavi edilen hastaların yaklaşık% 13,5 ' si, bölgesel nüks2. Bu nedenle, radyasyonun nasıl dolaşabilir tümör hücrelerini (ctcs) araştırarak yerel nüks3,4içine önemli anlayışlar yol açacaktır.
Önceki çalışma normal doku radyasyonun çeşitli hücre türleri işe artırdığını göstermiştir5. TNBC 'nin klinik öncesi modellerinde, normal dokuların ışınlanması makrophaj ve sonra tümör hücresi alımı normal dokulara5' e yükseldi. İmmün durum bağışıklık sistemi etkilenen konularda gözlenen tümör hücre göç ile, ışınlanmış sitelere tümör hücre işe etkilediği. Meme bezlerinden elde edilen organoidleri kullanarak bu etkileşimlerin reapitasyonu, hücre göçü ve hücre-stromal etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak mikroskopi ve canlı hücre görüntüleme ile gözlemlemek, radyasyon hasarının rolünü belirlemek için tümör hücre davranışı.
Fare meme organoids Meme bezinin gelişiminde önemli adımlar aydınlatmak yardımcı oldu. Bir meme nevuslardır, 50 μm6,7,8,9,10' dan daha büyük olan yalıtılmış meme epitelin bir çok hücreli, üç boyutlu yapısıdır. Primer epitelyal organoidleri kullanarak, Simian ve al. meme bezinde dallanma için gerekli faktörler değerlendirildi7. Shamir ve ark. yaygınlaştırma, epitelyal geçiş için epitel olmadan ortaya çıkabilir, metastaz Cascade8içine anlayış sağlayan keşfetti. Meme bezi dokusundan organoidlerin oluşturulması ve karakterize edilmesi için yöntemler iyi kurulmuştur6,11,12,13. Ancak, bilgimize, meme bezlerinden ışınlanmış organoidlerin büyüyen yöntemleri bildirilmemiştir. Radyasyon kaynaklı bağışıklık ve tümör hücresi işe alma reapitulating için bir protokol büyüyen ve ışınlanmış organoids karakterize için kritik bir adım olacaktır.
Bu yazıda, küre oluşumunu destekleyen bir hidrofilik polimer ile kaplı düşük yapışkanlık mikroplaklarda ışınlanmış meme epitelyal organoidleri büyüyen ve karakterize etmek için bir yöntem bildiriyoruz. Bu organoidler, immün hücre infiltrasyonu kinetiği incelemek için makrofajlar ile birlikte Kültürlenmiş. Bu çalışma, meme özellikleri, göğüs kanseri hücrelerinin tümör hücre işe alma görselleştirmek için adipoz hücreleri ile Co-kültürü organoids dahil etmek için genişletilebilir ve tümör-immün hücre etkileşimlerini incelemek için CD8 + T hücreleri. Daha önce kurulan protokoller ışınlanmış organoidleri değerlendirmek için kullanılabilir. Önceki modeller meme organoidleri ve bağışıklık hücrelerinin ortak kültür metastaz ve yayma mekanizmaları ışık dökmeye. DeNardo ve al. bu CD4 + T hücre yönetmeliğinin ilişkili makrofajlar meme adenokarsinomların metastatik phenoype geliştirilmiş bulundu14. Co-kültür modelleri de biyolojik gelişim mekanizmaları aydınlatmak için kullanılmıştır. Plaks ve ark., meme organogenezi15' in aşağı regülatörleri olarak CD4 + T hücrelerinin rolünü açıklığa kavuşturuldu. Ancak, grubumuz normal doku ışınlarının bağışıklık hücresi davranışlarını nasıl etkilediğini görselleştirerek ilk kez bir prosedür oluşturmaktır. Çünkü normal doku ışınlama tümör hücre işe alma geliştirmek için gösterilmiştir5, bu protokol daha büyük bir anlayış önde gelen, normal doku ve hücrelerin radyasyon ile nasıl değişmiş tümör hücre davranışını analiz etmek için geliştirilmiş olabilir Kanser nüks.

<table><tbody><tr><td>% 10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>Anti-sitokeratin 14</td><td>abcam</td><td>ab181595</td><td>Lot: GR3200524-3</td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini</td><td>Sigma</td><td>A1933-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen Tip I</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Clostridium Histolyticum, Tip VIII</td><td>Sigma</td><td>C2139'dan</td><td></td></tr> <tr><td>KollajenazKollajenaz I</td><td>Gibco</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Thermofisher</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>E-Kaderin</td><td>Hücre Sinyali</td><td>24E10</td><td>Lot: 13</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>F0926</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Gibco</td><td>15750</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan ikincil</td><td>abcam</td><td>ab150077</td><td>yeşil Lot: GR3203000-1</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan ikincil</td><td>abcam</td><td>ab150080</td><td>kırmızı Lot: GR3192711-1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Fisher</td><td>62249</td><td>Lot: TG2611041</td></tr><tr><td>İnsülin (10 mg/mL)</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin-Transferrin-Selenyum, 100x</td><td>Gibco</td><td>51500-056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel Bodrum Membranı (Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkomundan ekstrakte edilen bazal membran)</td><td>Corning</td><td>356237</td><td></td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nuclon Sphera 96 kuyulu plakalar</td><td>Thermo</td><td>174927</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR</td><td>10128-856</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/strep</td><td>Fisher</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Phalloidin</td><td>abcam</td><td>ab176757</td><td>Lot: GR3214582-16</td></tr><tr><td>Sıkı Bağlantı Proteini 1</td><td>Novus</td><td>NBP1-85047</td><td>Lot: C115428</td></tr><tr><td>Triton X-100 (4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol)</td> <td>Sigma</td><td>X100-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>Gibco</td><td>27250-018</td><td></td></tr><tr><td>Ara-20 (Polietilen glikol sorbitan monolaurat)</td><td>Sigma</td><td>P1379-100ML</td><td></td></tr></tbody></table> Serisi

mammary bezlerinden ışınlanmış organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Sindirilmiş dokudan elde edilen organoidler çok hücreli üç boyutlu (3D) daha iyi hücre monolayerlere kıyasla vivo koşullarda özetlemek yapıları vardır. Tamamen içinde vivo karmaşıklık modeli olamaz rağmen, onlar orijinal organ bazı işlevselliği korumak. Kanser modellerinde, organoids yaygın tümör hücre istilası çalışmak için kullanılır. Bu protokol, normal dokularda radyasyon tepkisi değerlendirmek için normal ve ışınlanmış fare meme bezi dokusu organoids geliştirmek ve karakterize amaçlamaktadır. Bu organoidler, radyasyonlu organoidlerle tümör hücresi etkileşimlerini değerlendirmek için gelecekteki in vitro kanser çalışmalarına uygulanabilir. Mammary bezleri, 20 GY 'ye ışınlanmış ve kolajenaz VIII çözeltisi içinde sindirilmiş, rezeke edildi. Epitelyal organoidler Santrifüjlü farklılaşma yoluyla ayrıldı ve 96-iyi düşük yapışkanlık mikroplaklarda 3D organoidler geliştirilmiştir. Organoids karakteristik epitelyal Marker Sito 14 ifade. Ortak kültür deneylerinde organoidlerle makrophaj etkileşimi gözlenmiştir. Bu model tümör-stromal etkileşimleri, bağışıklık hücrelerinin infiltrasyonu ve radyasyonlu bir mikroçevre içinde makrophaj polarizasyon okumak için yararlı olabilir.

Radyasyonlu epitelyal meme organoidler, fare meme bezlerinden başarıyla elde edildi, işlenmiş ve düşük yapışkanlık plaklarda kültürlü (Şekil 1). Organoid verim farklı büyüme ortamlarında tohumlama ile test edildi (Şekil 2a-G). 10 cm hücreli plakalı tedavi edilen doku kültürünü doğrudan tohumlama hücreleri fibroblast hücrelerinin bir aşırı büyümesini sağladı. Fibroblastlar, organoidler olarak aynı odak düzleminde veya yakın faz kontrast mikroskobu altında tespit edildi ve hız...

Fare meme bezlerinden geliştirilen organoidler ışınlanmış ve epitelyal özellikleri ve immün hücrelerle etkileşimleri değerlendirmek için karakterize edilmiştir. Işınlanmış organoids daha iyi radyal normal dokuda tümör hücre işe neden olabilir hücre hücre etkileşimleri değerlendirmek için kullanılabilir.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Bu protokol, iyonlaştırıcı radyasyonun tümör hücre alımını nasıl etkilediğini analiz etmek için kullanılabilir ve geliştirilebilir ve kanser nüksünün daha iyi anlaşılmasına yol açabilmektedir. Meme organoidleri güçlü modellerdir. Temel in vivo özelliklerini taklit ederler, ancak biyolojik değişkenlerin kolayca izole edilmesine izin verirler.Düşük yapışma plakalarının kullanımı protein matrisleri ile ilişkili iş akışı zorluklarını inkâr eder. Üçlü negatif meme kanseri hastaları tedavi sonrası daha yüksek oranlarda lokal bölgesel nüks yaşarlar. Radyasyonun tümör ve bağışıklık hücresi davranışını nasıl etkilediğinin araştırılması nüks mekanizmalarına ilişkin önemli içgörülere yol açacaktır.Organoidlerin konfokal mikroskopisini gösteren Javier Gomez, Silvera Batista laboratuvarında yüksek lisans öğrencisi. Bu prosedüre, metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği şekilde kurban edilen farelerden karın ve inguinal meme bezlerinin çıkarılması ile başlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi örneklerin ışınlama sonra 45 dakika, 35 milimetrelik steril hücre plakası ve neşter ile kıyma meme bezleri yerleştirin.Doku rahatlayana kadar yaklaşık 40 vuruş ile kıyma ve alan yaklaşık bir milimetre den büyük parçalar elde edilir. Şimdi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde kollajenaz çözeltisine doku aktarın. Fare başına 10 mililitre kollajenaz çözeltisi kullanın.Örnek tüpleri 37 santigrat derecede 30 ila 60 dakika su banyosuna yerleştirin ve her 10 dakikada bir beş saniye girdap layın. Kollajenaz çözeltisi bulutlu olduğunda sindirim tamamlanır. Sindirilmiş çözeltiyi oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 450-g'de aşağı doğru çevirin.Şimdi üç katman gözlenmektedir. Supernatant yağ oluşur, orta tabaka sulu bir çözümdür, ve alt bir pelet olduğunu. Pellet kırmızı görünür, epitel hücreleri bir karışımı olarak, bireysel stromal hücreler, ve kırmızı kan hücreleri.BSA çözeltisinin eklenmesi ve çıkarılması ile temas tan önce tüm pipetleri, pipet uçlarını ve Santrifüj tüplerini BSA solüsyonu ile ön katlayın. BSA çözümü yeniden kullanılabilir, ancak her denemeden önce steril filtreuygulanmalıdır. Ek kurtarma için, yeni bir BSA kaplı 15 mililitrelik tüp supernatant aktarın.Pipet yukarı ve aşağı şiddetle yağ tabakası dağıtmak için. Numuneyi 450-0-G'de oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj edin. Süpernatant aspire, hücre pelet aspire önlemek için tüp içinde medya küçük bir miktar bırakarak.Şimdi orijinal pelet ile tüpten sulu tabaka aspire. Orijinal peletle tüpe 10 mililitre DMEM/F12 ekleyin ve ikinci tüpe aktarın. Pipet şiddetle birleştirmek ve iki pelet yeniden askıya almak.Oda sıcaklığında 10 dakika 450-kat-G santrifüj ettikten sonra, supernatant aspire ve tüp emme/F12 dört mililitre ekleyin. Süspansiyona 40 mikrolitre deoksiribonükle azmverin ve oda sıcaklığında 2-5 dakika hafifçe elle titretin. Altı mililitre DMEM/F12 ve pipeti iyice ekleyin.Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika 450-kat-G'de santrifüj ettikten sonra, süpernatant'ı 0,5 mililitrelik işaretine kadar aspire edin. Peleti 10 mililitre DMEM/F12 ve pipette iyice yeniden askıya alın. Şimdi tüpü 450 kat-G'ye kadar titreşerek ve bu hıza ulaştıktan sonra dört saniye durdurarak santrifüj edin.Santrifüj farklılaşması ile organoidleri arındırmak için yıkama adımlarını üç kez daha tekrarlayın. Pelet artık sadece epitel organoidlerden oluşan beyaz olmayan bir renk olmalıdır. Peleti 10 mililitre DMEM/F12'de yeniden askıya alın.Pipet iyice homojen bir çözüm oluşturmak için. 50 mikrolitreyi 30 milimetrelik Petri kabına aktarın ve 20X'te faz kontrastlı mikroskop altında görüntüleyin. Bir sayım sayacı ile organoidlerin sayısını sayMak.Pipet 50 mikrolitre organoidin her bir kuyuya düşük yapışma plakası. 200 mikrolitre toplam çalışma hacmi getirmek için organoid orta 150 mikrolitre ekleyin. Dikkatle her iki günde bir orta değiştirin.%10 FPS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenen DMEM ortamlarında GFP veya D-domates etiketli ham 264,7 makrofajları koruyun. İstenilen yoğunlukta hücreleri organoid ortama tohum. Zaman içinde makrofaj infiltrasyon izlemek için canlı hücre faz kontrastı ve floresan görüntüleme kullanın.Dikkatlice keserek kuyulardan organoid ortamı çıkarın. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %10 nötr tamponlu formalin ile düzeltin. 1X PBS'de sabit organoidleri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.İstenirse, sabit numuneler daha fazla boyama için bir hafta boyunca dört santigrat derecede saklanabilir. Yıkamadan sonra, beş dakika boyunca sabit organoidler permeabilize. Sabit organoidleri %0.1 PBST'de %5 normal keçi serumu ile oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin ve pbs ile beş dakika boyunca üç kez yıkanın.Sabit organoidleri anti-sitokeratin-14, E-kadherin veya sıkı bağlantı proteini olan, PBST'de %1 NGS'de oda sıcaklığında bir saat kuluçkaya yatırın. Sonra PBST beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Şimdi oda sıcaklığında bir saat boyunca% 1 NGS PBST ile keçi anti-tavşan ikincil antikor ile organoidler kuluçka.Hafif maruz kalmamak için folyo ile kaplayın. Daha önce olduğu gibi yıkadıktan sonra, yaklaşık yarım saat çekirdekleri leke lemek için nükleer boya kullanın. Lekeli organoidleri PBS'de beş dakika üç kez yıkayın.Bir oda slayt kullanıyorsanız, bir kapak kayma ile monte. Folyoya sarılmış organoidleri dört santigrat derecede iki haftaya kadar saklayın. Işınlanmış organoidler düşük yapışma plakalarında veya bazal membran içinde kültürlenebilir, ancak en hızlı büyüme düşük yapışma plakalarında meydana gelmiştir.Organoidler meme bezi özelliklerini recapitulated. Kanal ve loblara morfolojik olarak benzeyen yapılar gözlendi. Büyüme eğilimleri, organoidlerin sindirim ve sıralamadan sonra hemen tohumlandığında, ışınlanmamış organoidlerin ışınlanmış organoidlerden daha hızlı büyüdüğünü, büyük olasılıkla DNA hasar onarım mekanizmalarından kaynaklanan hücre büyümesi nedeniyle ortaya çıktıklarını göstermiştir.Organoidler immünoresan boyama yoluyla değerlendirilen epitel özelliklerini ifade ettiler. Işınlanmış organoidler epitel belirteçlerini ifade ettiler. Sitokeratin-14, miyoepitelyum bir belirteç, güçlü ışınlanmış organoidlerin yüzeyinde ifade edildi.Ayrıca, E-kadherin ve sıkı kavşak protein bir organoidlerin hücresel kavşakiçinde ifade edildi. Bu proteinler uygun hücre yapışması için gereklidir. Işınlama dan sonra, organoidler epitel özelliklerini korumaya devam ettiler.Organoidlerin floresan boyama floresan mikroskopi kullanılarak düşük yapışma plakaları içinde görselleştirilebilir. Ancak en net görüntüleme konfokal mikroskopi ile elde edilerek elde edilebildi. Düzeltilmiş toplam floresan yoğunluğu arka plan çıkarılarak ve organoid alan tarafından normale döndürülerek hesaplandı.96 kuyulu düşük yapışma plakalarında büyüyen organoidler de ortak kültür deneylerini basitleştirdi. Meme bezinde tipik konsantrasyonlarda tohumlandığında, ışınlanmış organoidlerle makrofaj kolokalizasyonu artmıştır. Bu işlemi gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey organoidleri aşırı sindirmemek ve santrifüj farklılaşmasını uygun şekilde arındırmak.Bu yordamı takiben, ek ortak kültür deneyleri yapılabilir. Organoidler tümör hücreleri ile birlikte kültürolabilir, diğer bağışıklık hücreleri, ve stromal hücreleri nüks ile ilişkili ışınlanmış mikroortamı yeniden oluşturmak için. Bu yöntem, normal doku hasarının özellikle bağışıklık hücre dinamiklerini nasıl etkilediğini değerlendirmek için önemli olacak ve sonunda tümör hücre işe alım mekanizmalarını anlamak için kullanılacaktır.Meme organoidleri meme bezi gelişimi mekanizmaları açıklanmış var, ve in vitro sağlam recapitulated meme kanseri var. Biz modelradyasyona bağlı tümör hücre alımı hakkında anlayışlar sağlar umuyoruz.

growth-characterization-irradiated-organoids-from-mammary

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Epitel ve stromal hücrelerden oluşan ve yerli endometrial dokunun özelliklerini koruyan insan primer endometriyal organoidler oluşturmak için bir protokol sunulmuştur. Bu protokol, rahim dokusu alımından endometrial organoidlerin histolojik işleme yöntemlerini açıklamaktadır.

Multicellular Human Primer Endometrial Organoidlerin Üretimi

Meme bezi, dış miyoepitelyal ve iç luminal epitel hücrelerinden oluşan çift katmanlı bir yapıdır. Sunulan diferansiyel trippsinizasyon kullanarak organoidler hazırlamak için bir protokoldür. Bu verimli yöntem araştırmacılar ayrı ayrı meme bezi formu ve fonksiyonu rollerini ile ilgili soruları keşfetmek için bu iki hücre türleri işlemek için izin verir.

Diferansiyel Tripsinizasyon a göre Mozaik Meme Organoidlerinin Üretimi

Bu protokol, diferansiyel santrifüjleme yoluyla primer normal ve tümör meme dokusundan epitel organoidleri üretmek için bir yaklaşımı tartışmaktadır. Ayrıca, gömülü organoidlerin immünofloresan görüntülenmesinin yanı sıra üç boyutlu kültürleme için talimatlar da dahil edilmiştir.

Normal ve tümörlü meme dokusundan fare ve insan epitel organoidlerinin passiz olmadan üretilmesi ve görüntülenmesi

Bu protokol, kimyasal karsinogenez yoluyla indüklenen normal, preneoplastik ve skuamöz hücreli karsinom lezyonlarını temsil eden murin oral-özofagus 3D organoidlerini üretmek ve karakterize etmek için anahtar adımları açıklamaktadır.

3D Organoidlerde Oral-Özofagus Skuamöz Hücreli Karsinomun Modellenmesi

Burada, hasta kaynaklı meme tümörü rezeksiyonlarından veya normal meme dokusundan insan meme organoidlerinin oluşturulması için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Protokol, insan hasta kaynaklı meme organoidlerinin kültürlenmesi, dondurulması ve çözülmesi için kapsamlı adım adım talimatlar sağlar.

Hasta kaynaklı meme organoidlerinin kurulması ve kültürü

Burada, taze melanom dokularından ayrışmış hücre süspansiyonlarını kültürleyerek melanom hastadan türetilmiş organoidler oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Bu organoidler, hastaya özgü tümörleri in vitro olarak aslına uygun olarak özetleyerek, tümör immünosupresif mekanizmalarını, ilaç taramasını, ilaç direnç mekanizmalarını ve kanser sürveyans yaklaşımlarını keşfetmek için yenilikçi bir yaklaşım sunar.

Melanom Hasta Kaynaklı Organoid Modellerle Terapötik Fırsatların Ortaya Çıkarılması

Prostat kanseri heterojenliği ve tedavi direnci zorluklar olmaya devam etmektedir. Temel ebeveyn tümör özelliklerini koruyan hasta kaynaklı organoidler (PDO'lar) üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu standartlaştırılmış model, ilaç taramasını ve hassas tıptaki gelişmeleri destekler.

Hasta Kaynaklı Prostat Kanseri Organoidlerinin Oluşturulması ve Sürdürülmesi: Ayrıntılı Bir Deneysel Protokol

Bu protokol, kontrollü üç boyutlu bir kültür sisteminde meme morfogenezinin temel özelliklerini özetleyen insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntemi tanımlar.

Meme morfogenezini yeniden düzenleyen üç boyutlu insan meme organoidleri üretmek için tanımlanmış hidrojel tabanlı bir yöntem

Akson streç büyüme yansıtan benzersiz bir doku mühendisliği yöntemiyle kültürünün çok sayıda sinir lifleri uzatmak için geliştirilmiştir; sinirleri büyütme vücudun büyüme ile birlikte uzatmak sayede sinir sistemi gelişimine bir form.

Akson Streç Büyüme: Nöronal Büyüme Mechanotransduction

Öğrenin, iyonize radyasyonun tümör hücre çekimini nasıl etkilediğini fare meme bezlerinden elde edilen organoidler kullanarak analiz etmeyi. Bu yöntem, kanser nüks mekanizmalarını anlamak için önemli bilgiler sağlar.

Mammary bezlerinden ışınlanmış Organoidlerin büyüme ve karakterizasyonu

Daha fazla video keşfet