Mitokondriyal solunum zinciri Süperkompleksleri ayrımı ve analizi için hibrid Clear/mavi yerli Elektroforez

Süper kompleksler iç-mitokondriyal membranda solunum zinciri kompleksleri tarafından oluşturulan supramoleküler derlemelerdir. Bu süper komplekslerin oluşumu, reaktif oksijen türlerinin üretiminin azalması, stabilizasyon ve bireysel solunum zinciri komplekslerinin daha etkili bir şekilde biraraya edilmesi, solunum zinciri aktivitesi düzenlemesi ve iç zarın protein açısından zengin ortamında protein toplamasının önlenmesi gibi çeşitli yapısal ve fonksiyonel avantajlar sağladığına inanılmaktadır. Süper komplekslerin montaj ve bileşimindeki değişiklikler dinamiktir ve fizyolojik adaptasyon sırasında gözlenen mitokondriyal fonksiyondaki değişikliklerin yanı sıra çeşitli genetik ve edinsel hastalıkların altında yatan değişiklikler inanılmaktadır.

Bu video, süper karmaşıkları hassas ve zaman etkili bir şekilde çözmek ve analiz etmek için karma açık/mavi yerel PAGE protokolü sunar. Bu melez açık / mavi yerli PAGE yönteminin ana avantajı en iyi geleneksel mavi ve net yerli PAGE protokolleri çeşitli yönlerini birleştirir, hangi en az en az deterjanve anyonik bileşiklere maruz kalma azaltmak için izin verir yayınlanan protokoller ile karşılaştırıldığında. Süper komplekslerin optimum ayrıştırılması ve analizi büyük degrade jellerde elde edilir.

Bu yordam, el ile beceri ve dikkatli yürütme gerektiren birkaç hassas adımlar içerir. Yazılı protokole görsel destek tekniğin uygulanmasını kolaylaştıracak önemli ipuçları sağlar. Prosedürü gösteren İskenderiye, benim laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi.

Başlamak için, 16 bir 1.5 mililitrelik tüp içinde hayvan dokusundan izole mitokondri santrifüj, 4 santigrat derece 10 dakika için 000-kez-G. Supernatant atın ve mitokondriyal pelet yeniden askıya almak için tüp için digitonin içeren buz soğuk çıkarma tampon hesaplanan hacmi ekleyin. Tüpleri bir mini tüp rotatörüne yerleştirin ve orta dönüş hızında 4 santigrat derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Santrifüj örnekleri 20, 400-kez-G 45 dakika 4santigrat derece insolubilize parçaları kaldırmak için. Supernatant’ı buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Elektroforez aynı gün yapılmazsa, numuneleri eksi 80 derecede saklayın.

Döküm odasını aç. Odaya 20 santimetre kat 22 santimetre dış cam plaka yerleştirin. Odanın yan ve köşelerine sıkıca oturttuklarından emin olmak için hizalama kartını kullanarak 1,5 mililitrelik spacer’lerden oluşan bir set yerleştirin.

Jel sandviç oluşturmak için spacers üstüne bir iç cam plaka yerleştirin ve cam plaka üstüne plastik bir ayırma levha koymak. Üç jel sandviç montaj düzenleyin. Odada kalan alanı almak için gerekirse daha fazla akrilik bloklar veya cam plakalar ekleyin.

Contayı conta çentikte sıkıca oturtmadan önce olukta bir parafilm şeridi yerleştirin. Tavan plakasını hazneye yerleştirin ve altı vidanın hepsini sıkın. Döküm odasını dur.

Işık karıştırma odasında bir manyetik karıştırıcı ile bir karıştırma plakası üzerinde eski degrade yerleştirin. Döküm odasının borularını degrade eskisine bağlayın ve peristaltik pompanın kasetindeki tüpü sabitlayın. Degrade eski stopcock kapalı olduğundan emin olun.

Dört jel atmak için, iki Erlenmeyer şişelerinde %4 ve 60 mililitre lik 60 mililitre jel çözeltihazırlayın ve iyice karıştırarak girdap layın. %4 jel çözeltisini Hafif karıştırma odasına, %12’sini degradenin ağır rezervuar odasına dökün. 350 rpm de karıştırma plakası karıştırma hızı ayarlayın.

Sonra stopcock açın ve 35 rpm de pompa açın. Hafif fraksiyonun çözelti seviyesi ağır fraksiyondan daha düşük olduğunda, pompayı duraklatın ve hafif ve ağır rezervuarlar arasındaki valf sapını açın. Kesirler hacmi dengeleyin ve pompa yeniden başlatın.

Hiçbir kabarcıklar sisteme girmek ve cam plakalar arasında sıkışıp olsun emin olun. Degrade jel tamamen dökülür sonra, pompa durdurmak ve jel kurutmaönlemek için her jel sandviç üzerine bir mililitre su bindirme. İki saat polimerize olsun.

Erlenmeyer şişesinde 25 mililitrelik istifleme jeli hazırlayın ve iyice karıştırmak için girdap. Suyu çıkarmak için montajı hassas bir şekilde ters çevirin ve her jel sandviçe 15 kuyuttekleyin. Pour istifleme jelve iki saat polimerize sağlar.

Bundan sonra, jel ve sandviç kelepçeler tarak tarak çıkarın. Kısa cam plaka aşağı bakacak şekilde, jel sandviçi soğutma çekirdeğine yerleştirin. Diğer tarafta tekrarlayın ve elektroforez tankına çekirdek yerleştirin.

Elektroforez tankının iç haznesinde 300 mililitre mavi katot tampondökün. Pipet ve yükleme uçları ile kuyu başına 75 ila 175 mikrogram protein yükleyin. Soğuk odada dört santigrat derecede elektrotları güç kaynağına takın ve 150 volta çıkarın ve jeli bir buçuk saat çalıştırın, ya da numunelerin hepsi degrade jeline girene kadar.

OxPHOS komplekslerinin jel içi faaliyetlerin paralel olarak belirlenmesini ve immünoblot analizini sağlamak için numunenin ayrı kuyularda çoğaltılması. Pipet ile mavi katot tampon kaldırın. Coomassie mavi ücretsiz katot tampon 300 mililitre değiştirin ve soğuk odada gecede 200 volt jel çalıştırın.

Elektroforez bitmeden önce, el yazmasına göre jel içi aktivite tamponları hazırlayın ve oda sıcaklığında karanlıkta tutun. Elektroforezi durdurun ve jeli alın. Plastik torbayı bir kitap gibi açabilsin diye kesin.

Şerit leri kesin ve jel şeritlerini plastik torbalara aktarın. Üç taraftan ikisini kapatmak için ısı yalıtımı kullanın. Negatif kontrol denemeleri yapılırsa, bağırsak arabelleklerine inhibitörler ekleyin.

Üç deneysel örnek için, in-jel aktivite tampon 20 mililitre ekleyin. Kabarcıklar çıkarın ve plastik torbanın dördüncü tarafında mühür. Karanlıkta 37 santigrat derecede jel şeritlerini inkübedin ve her 15 dakikada bir kontrol edin.

Kuluçka süresi protein ve kompleksmiktarına bağlı olarak değişir. Kuluçkadan sonra, reaksiyonu durdurmak için suda jel şeritlerini durulayın ve karmaşık V için karmaşık I, karmaşık IV veya siyah arka plan için beyaz bir arka plan üzerinde görüntü.Bu örnekiçin, taze fare karaciğer mitokondrisinden izole edilen süper kompleksleri görselleştirmek için karmaşık bir IV jel içi aktivite gerçekleştirildi. Monomerik kompleks IV ve yüksek molekül ağırlıklı süper komplekslerin iyi bir çözünürlüğü sağladığından, bu örnek için en uygun digitonin miktarı gram başına dört gramdır.

Daha düşük bir oranda, bantlar açık değildir ve elektroforez sırasında bir yayma içine çözmek, digitonin yüksek oranda kullanımı yüksek molekül ağırlıklı süperkomplekslerin bozulmasına yol açar. Bir fareden izole edilen karaciğer mitokondrisi solunum süperkomplekslerini çıkarmak için en uygun miktarda digitonin ile tedavi edildi. OXPHOS komplekslerinin elektroforetik hareketliliği, proteinler melez açık/mavi yerli PAGE koşulları kullanılarak ayrıldığında, coomassie mavisinin azaltılmış miktarı nedeniyle standart yerli PAGE ile karşılaştırıldığında biraz azalır.

Bu hareketlilik kayması karmaşık IV monomerler için daha büyüktür, bunu karmaşık V monomerleri takip ve karmaşık I.The mavi arka plan mavi yerel SAYFA’ya göre hibrit açık yerli/mavi yerel SAYFA’da daha düşüktür. Mavi yerli PAGE’i izleyen yüksek arka plan seviyeleri, karmaşık II için jel içi aktivite boyamayı tamamen maskeler ve karmaşık IV dimerlerin aktivitesi ile ilişkili arka plan gürültüsünü artırır. Bu protokol için, enzim aktivitesi ve fizyolojik protein etkileşimleri korurken, optimal solubilizasyona izin veren koşulları belirlemek için ilgi örneklerinin çeşitli miktarlarda digitonin ile titrasyonu çok önemlidir.

Jel döküm ile ilgili tüm adım uygun numune ayırma için en uygun degrade oluşumuna titizlikle yapılmalıdır. Aşırı bakım da bu büyük ve kırılgan jellerin manipülasyon için alınmalıdır. Her zaman jel yüksek yüzdeucunu kullanarak birkaç parmak ile tutun.

Bu hibrit berrak/mavi yerli PAGE yöntemi ile numuneler, elektroforezin başlangıcında diğer deterjanlara maruz kalmadan aniyonik boya Coomassie mavisine kısaca maruz kalmaktadır. Bu, süper kompleksleri geleneksel mavi yerli PAGE yöntemlerinde olduğu gibi etkili bir şekilde ayırmak ve çözmek için izin verirken, yüksek Coomassie mavi düzeylerinin in-gel aktivite tahlilleri ve süper kompleksler içindeki labile protein-protein etkileşimleri üzerindeki olumsuz etkisinden kaçınır. Bu protokol ile hassas ve hızlı jel içi aktivite ölçümlerini 2D elektroforez, immünositve/veya proteomik içeren analitik tekniklerle birleştirmek mümkündür.