Name: İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Öğrenin enzimatik istikrarın izotermal titrasyon kalorimetresi ile ölçümünü. Bu yöntem, enzim aktivitesinin termal stabilitesini doğrudan değerlendirerek geleneksel testlere göre daha az iş gücü gerektirir ve çeşitli enzimlerle kullanılabilir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. hazırlanması örnekleri
<ol><li>
1000 mL 0.1 M sodyum asetat arabelleği pH 4.6
	<ol>
<li>800 mL distile su bir 1000 mL mezun ölçek ölçmek.</li>
		<li>Susuz sodyum asetat 8.2 g tartmak ve kabı için ekleyin.</li>
		<li>Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin, bir heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin, heyecan plaka üzerinde açmak ve tamamen eriyene kadar karıştırın.</li>
		<li>Ne zaman susuz sodyum asetat tamamen çözülmüş, kalibre edilmiş pH metre ile pH çözüm ölçmek.</li>
		<li>Buna göre 1 M HCl veya NaOH istenen pH 4,6 elde etmek için ekleyin.</li>
		<li>Kadar toplam hacmi 1000 mL distile su ekleyin.</li>
		<li>Oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Enzim çözüm
	<ol>
<li>Enzim mezun çözüm 15 ml 0.1 M sodyum asetat tampon pH 4,6 ilk ölçüm 8 mL tarafından 10-30 mg/mL aralığında silindir 10 mL hazırlayın.</li>
		<li>Arabellek çözüm 15 mL konik tüp enzim ile içine ekleyin ve enzim eriyene kadar şiddetle çalkalanır.</li>
		<li>Toplam hacim 10 mL olana daha fazla arabellek çözüm ekleyin.</li>
		<li>4 ° C'de enzim çözüm kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Substrat çözeltisi
	<ol>
<li>300-600 mM aralığında bir substrat çözeltisi hazırlamak için gram cinsinden istediğiniz toplama yapmak için gerekli substrat miktarı hesaplamak.</li>
		<li>Belgili tanımlık substrate tartmak ve 100 mL cam kabı yerleştirin</li>
		<li>20 mL 25 mL mezun silindir kullanarak tampon çözeltisi ölçmek ve daha sonra cam kabı ekleyin.</li>
		<li>Kabı bir heyecan tabağa yerleştirin ve bir manyetik heyecan çubuk ölçek kabı yerleştirin. Klimayı açabilir ve karıştırma hızı buna göre ayarlayın.</li>
		<li>Belgili tanımlık substrate eriyene kadar devam etmek için karıştırma izin verir.</li>
		<li>Substrat çözeltisi 50 mL konik tüp içine dökün ve kadar Toplam hacim 45 mL 0.1 M sodyum asetat tampon pH 4,6 ekleyin. Sallayarak karıştırın.</li>
		<li>Substrat çözeltisi, oda sıcaklığında kullanmak kadar saklamak.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. deneme gerçekleştirme
<ol><li>ITC enstrüman hazırlanıyor<ol>
<li>Başvuru hücresi 350 µL distile su ile yüklü emin olun. Enzim örnek hücre yüklemeden önce örnek hücre temizledi doğrulayın.</li>
		<li>İletişim kuralı-dolgu yükleme şırınga 500 µL % 2 temizleme solüsyonu (Malzemeler tablo) ile Temizleme, dikkatle iğne örnek hücreye, hücreyi doldurmak ekleyip yavaş yavaş sıvı aynı Ģırınga kullanarak kaldırabilirsiniz. Sıvı kabı atın. Bu % 2 temizleme solüsyonu (Malzemeler tablo) ile iki kez üç kez % 70 etanol ile adımları yineleyin ve sonra on kere distile su ile yıkayın.</li>
		<li>Enzim çözüm 450 µL ile yükleme şırıngaya doldur, dikkatle sonuna kadar örnek hücrenin altına iğne yerleştirin ve yavaş yavaş hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için pompayı 100 µL satır aşağı tuşuna basın.</li>
		<li>İğne ucu suya koyarak sonra yavaş yavaş şırınga suya alarak sonra atık konteyner içine su dağıtımı tarafından üç kez 50 µL titrasyon şırınga distile su ile yıkayın.</li>
		<li>Artık su substrat çözeltisi ile üç kez durulama tarafından kaldırın.</li>
		<li>Titrasyon şırınga yukarıya-e kadar belgili tanımlık tenkıye herhangi bir hava kabarcığı tam çözüm çizerek substrat çözeltisi ile doldurun.</li>
		<li>Hala substrat çözeltisi içinde şırınga pistonu çıkarın ve yaklaşık 2 µL hava şırınga girin ve pistonu eski mevkiini geri vermek için izin.</li>
		<li>ITC buret kolu Kaldır, içinde buret tanıtıcı şırınga yerleştirin ve sıkı kadar canı cehenneme.</li>
		<li>Bir hav bırakmayan dokusu ile karıştırıcı ucu silin sonra dikkatlice buret kolu ITC araç yerleştirin ve yerine kilitlemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ITCrun ayarlama
<ol><li>Bilgisayarda ITCrun açın ve ayarla' yı tıklatın.</li>
	<li>Oranı karıştırma tıklatın ve 350 RPM için ayarlayın. Şırınga büyüklüğü (µL) denetleyin ve 50 µL olduğundan emin olun.</li>
	<li>Sıcaklığı ayarlamak ve Updatetuşuna basın. Bu adım gerçekleştirilmesi önerilir ITC hazırlamadan önce en az 1 h. Bu kadar ısı veya gerektiği gibi soğuması araç için yeterli zaman sağlar.</li>
	<li>Deneme kurulumu için artımlı titrasyon seçin.</li>
	<li>Enjeksiyonlar kurulum için Ekle ' yi tıklatın. 5.400 için enjeksiyon aralığını ayarlama s, enjeksiyon hacmi (µL) 4 ve 4 iğne sayısı. Ayarlarını onaylamak için Tamam tuşuna basın.</li>
	<li>Denge kutusu, Otomatik equilibrate ve büyük ısıtır beklenenseçin. (Beklenen ısıtır küçük, bir küçük altında beklenen ısıtır seçebilirsiniz; ancak, bu denge süreyi uzatmış olursunuz.)</li>
	<li>300'e ilk temel küme s.</li>
	<li>Çalışma, tıklayın başlatmak için Başlat karıştırma oranı yanındaki simge ve yanında İngiliz anahtarı simgesi bulunan Başlat ' ı tıklatın.</li>
	<li>Dosyayı kaydedin ve aracı çalıştırmak izin verir.</li>
</ol>4. verilerin analizi
<ol><li>Açık belgili tanımlık eğe içinde NanoAnalyze. Veri ' ı tıklatın ve veri sütunlarıseçin.</li>
	<li>Tüm verileri seçin, kopyalayın ve sonra verileri Microsoft Excel'e yapıştırabilirsiniz.</li>
	<li>300 gerekli değeri ekleyerek sıfır temel ayarlamak yapmak için s sıfır. Bu düzeltme ısı oranı değerleri sütunun tamamına uygulanır.</li>
	<li>Denklemi kullanarak her enjeksiyon için ısı oranı en küçük veya en büyük değeri bulmak: =MIN(cell:cell) veya MAX(cell:cell). Her veri noktası en yüksek enzimatik aktivite her enjeksiyon adlı enzim temsil eder.</li>
	<li>Değeri titrasyon sırasında oluştuğu zamana karşı MIN veya MAX değerleri grafikleri çizmek.</li>
</ol>

<ol><li>Anastas, P., Eghbali, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+chemistry%3A+principles+and+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Green chemistry: principles and practice.</a> Chemical Society Reviews. 39 (1), 301-312 (2010).</li>
<li>Jin, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+Recombinant+Glucose+Isomerase+for+Efficient+Production+of+High+Fructose+Corn+Syrup%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+Biotechnoiogy%22%5BJournal%5D)">Immobilization of Recombinant Glucose Isomerase for Efficient Production of High Fructose Corn Syrup.</a> Applied Biochemistry Biotechnoiogy. 183 (1), 293-306 (2017).</li>
<li>Budak, ŞÖ, Koçak, C., Bron, P. A., de Vries, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBudak%2C+%C5%9E%C3%96+%22Microbial+Cultures+and+Enzymes+Dairy+Technology%22">Microbial Cultures and Enzymes Dairy Technology</a>. , 182-203 (2018).</li>
<li>van Donkelaar, L. H. G., Mostert, J., Zisopoulos, F. K., Boom, R. M., van der Goot, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+enzymes+for+beer+brewing%3A+Thermodynamic+comparison+on+resource+use%5BTitle%5D)+AND+%22Energy%22%5BJournal%5D)">The use of enzymes for beer brewing: Thermodynamic comparison on resource use.</a> Energy. 115, 519-527 (2016).</li>
<li>Rodriguez-Colinas, B., Fernandez-Arrojo, L., Ballesteros, A. O., Plou, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galactooligosaccharides+formation+during+enzymatic+hydrolysis+of+lactose%3A+Towards+a+prebiotic-enriched+milk%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Galactooligosaccharides formation during enzymatic hydrolysis of lactose: Towards a prebiotic-enriched milk.</a> Food Chemistry. 145, 388-394 (2014).</li>
<li>Lawrence, P. B., Price, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+PEGylation+influences+protein+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinions+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">How PEGylation influences protein conformational stability.</a> Current Opinions in Chemical Biology. 34, 88-94 (2016).</li>
<li>Bernal, C., Rodriguez, K., Martinez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+enzyme+immobilization+and+protein+engineering%3A+An+alternative+path+for+the+development+of+novel+and+improved+industrial+biocatalysts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Advances%22%5BJournal%5D)">Integrating enzyme immobilization and protein engineering: An alternative path for the development of novel and improved industrial biocatalysts.</a> Biotechnology Advances. 36 (5), 1470-1480 (2018).</li>
<li>Rigoldi, F., Donini, S., Redaelli, A., Parisini, E., Gautieri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review%3A+Engineering+of+thermostable+enzymes+for+industrial+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Bioengeneering%22%5BJournal%5D)">Review: Engineering of thermostable enzymes for industrial applications.</a> Applied Bioengeneering. 2 (1), 011501(2018).</li>
<li>Johnson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+scanning+calorimetry+as+a+tool+for+protein+folding+and+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Differential scanning calorimetry as a tool for protein folding and stability.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 531 (1), 100-109 (2013).</li>
<li>Chen, N. G., Gregory, K., Sun, Y., Golovlev, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+model+of+thermal+deactivation+of+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">Transient model of thermal deactivation of enzymes.</a> Biochimica et biophysica acta. 1814 (10), 1318-1324 (2011).</li>
<li>Mason, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calorimetric+Methods+for+Measuring+Stability+and+Reusability+of+Membrane+Immobilized+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Jounal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Calorimetric Methods for Measuring Stability and Reusability of Membrane Immobilized Enzymes.</a> Jounal of Food Science. , (2017).</li>
<li>Leksmono, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Lactase+Enzymatic+Activity+in+the+Teaching+Lab%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab.</a> Journal of visualized experiments : Journal of Visual Experiments. (138), e54377(2018).</li>
</ol>

Burada açıklanan ITC enzim istikrar tahlil önemli bir avantajı otomasyon sistemidir. Tüm uygun arabellek ve çözümleri yapıldıktan sonra her tahlil için hazırlık süresi yaklaşık 15dk için tahlil yapan biri var. Buna ek olarak, geleneksel deneyleri invertase ve laktaz aktivitesi için tahlil yapan kişinin sürekli katılımı ile yaklaşık 2 h gerektirir ve birçok enzimatik aktivite deneyleri miktardan çok daha fazla adam-saat değerlerini alır. Bir önceki yayında veri ITC yönteminden daha geleneksel bir spectrophotrometric yönte...

Proteinler organik reaksiyonlar geniş bir dizi katalizlerler yetenekli enzimlerdir. Çoğu enzim işlevinde yakınındaki nötr pH böylece sert çözücüler kullanımı kaçınarak sulu çözüm. Onların yüksek seçicilik nedeniyle daha az katalize enzim reaksiyonlar üretmek (bazı durumlarda hiçbir yan) yan asitler ve bazlar1gibi non-selektif katalizörler daha. Bu tüm kimyasal reaksiyonlar nihai ürün insan tüketimi için güvenli bu yüzden burada yapılması gereken gıda üretiminde özellikle önemlidir. Şu anda, enzimleri yüksek fruktoz mısır şurubu2, peynir3, bira4, laktozsuz süt5ve diğer önemli gıda ürünleri üretmek için kullanılır. Enzim kullanımı gıda sektöründe bu kağıt odaklanır iken enzimleri yeşil kimya ve ilaç sentezi de dahil olmak üzere çok çeşitli amaçlarla.
Belgili tanımlık yarar enzimlerin enzim üç boyutlu yapısını korumak üzerinde bağlıdır enzim aktivitesinin istikrar ile sınırlıdır. Enzim yapısı PEGylation6, immobilizasyon sağlam destek7, genetik değişiklikler8ve formülasyonları gibi değişiklikleri tarafından stabilize. Şu anda, enzim istikrar genellikle diferansiyel tarama Kalorimetre (DSC) tarafından ölçülür ve bitiş noktası enzim etkinliği9deneyleri. DSC hangi bir enzim izlerken sıcaklık ölçer; yüksek sıcaklık, daha istikrarlı bir yapı. Ancak, aktivite kaybı kez enzim veya etki alanları enzim10içinde açılmak için gerekenden daha düşük bir sıcaklıkta oluşur. Bu nedenle, DSC bir enzim değişiklik enzim aktivitesinin istikrar artıp artmadığını belirlemek için yeterli değildir. Bitiş noktası enzim deneyleri genellikle yoğun zaman, birden fazla örnekleri gerektirir ve genellikle son derece renkli veya opak çözümleri veya kullanılamaz hale için geçerli değildir eşleşmiş bir kolorimetrik reaksiyon içerir.
Bu eser bir enzim aktivitesi kararlılığını doğrudan ölçme izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) gösterir. ITC serbest veya bir tepki boyunca absorbe ısı hızını ölçer. Neredeyse tüm reaksiyonlar üretmek veya ısı emer, ITC eşleşmiş bir tepki veya oluşan reaksiyonlar süt gibi opak medya da dahil olmak üzere çoğu enzim katalize reaksiyonlar için kullanılabilir. ITC uzun yıllar çeşitli tepkiler için kimyasal kinetik parametreleri ölçmek için kullanılmıştır, ancak burada sunulan protokolü en yüksek ısı hızı enzim katalize reaksiyonların ölçmek için ITC kullanarak üzerinde odaklanır ve enzim aktivite doğrusal olduğunu gösterir en yüksek sıcaklık hızı ile ilişkili. En yüksek ısı hızını ITC ölçümleri çoğunlukla özerk ve kurulum ve analiz etmek için çok az personel zaman gerektirir.

<table><tbody><tr><td>a-Laktoz</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>bilinmeyen (çok eski)</td> <td>500g</td></tr><tr><td>Sodyum Asetat, Susuz% 99 min</td><td>Alfa Aesar</td><td>A13184-30</td><td>250g</td></tr><tr><td>Laktaz&nbsp;</td><td>MP Bio</td><td>100780</td><td>5g</td></tr><tr><td>Hidrokolrik Asit Çözeltisi, 1N&nbsp;</td><td>Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>SA48-500</td><td>500mL</td></tr><tr><td>Masaüstü Ölçüm Cihazı - pH</td><td>VWR</td><td>89231-622</td><td></td></tr><tr><td>Etanol %70</td> <td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP8231GAL</td><td>1 galon</td></tr><tr><td>Micro-90</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>NC024628</td><td>1L (temizleme solüsyonu)</td></tr></tbody></table>

İzotermal titrasyon kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

Measuring Enzymatic Stability by Isothermal Titration Calorimetry

Bu eser izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) enzim aktivitesi kararlılığını ölçmek için yeni bir yöntem gösterir. Substrat çözeltisi tek bir enjeksiyon bir enzim çözüm içine enzim aktivitesi ile ilişkili sonra gözlenen en yüksek ısı hızı. Belgili tanımlık substrate zaman içinde birden çok enjeksiyonları aynı enzim çözüm içine kayıp enzim aktivitesinin göster. Tahlil gerektiren çok az personel zaman, özerk ve çoğu medya ve enzimler için geçerlidir.

Şekil 1 ve şekil 5 temsilcisi sonuçlarında iki enzimler, laktaz ve invertase gelen verileri göstermek. Laktaz ve invertase bir disaccharide hidroliz iki bol katalizler endothermically ve exothermically, anılan sıraya göre. Her iki enzimatik reaksiyonları doygunluk enzim durdurulmasını emretti konsantrasyonları işletilmiştir.
Laktaz veri ITC verileri enzim istikrar tahmin etmek için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir. Dört sıralı...

Enzim aktivitesinin termal kararlılık kolayca izotermal titrasyon Kalorimetre (ITC) tarafından ölçülür. Çoğu protein istikrar deneyleri şu anda ölçü protein unfolding kullanılan ancak enzimatik etkinliği hakkında bilgi sağlamaz. ITC enzim değişiklikleri istikrarı üzerinde enzim aktivitesinin etkisini doğrudan tayini sağlar.

İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

This work demonstrates a new method for measuring the stability of enzyme activity by isothermal titration calorimetry (ITC). The peak heat rate observed ...

Reaksiyonlarda katalizör olarak enzimlerin kullanılması reaksiyon için gerekli enerji miktarını azaltabilir ve toksik yan ürünleri azaltabilir. Ancak, enzimlerin endüstride kullanımı sınırlıdır, çünkü enzimler kararlı değildir ve pahalı olabilir. Bu protokol, koşulların enzim aktivitesine zararlı olup olmadığını veya enzimdeki değişikliklerin stabilitesini artırıp artırmadığını belirlemek için gereken süreyi azaltabilir.Bu tekniğin en büyük avantajı geleneksel enzim stabilitesi tahlillerinden daha az insan saati gerektirmesidir. Ayrıca, bu protokol çok çeşitli enzimlerle kullanılabilir, çünkü ısıyı serbest bırakan veya emen herhangi bir reaksiyonla kullanılabilir. Başlamak için, 0.1 molar sodyum asetat tampon hazırlayın.1,000 mililitrelik bir kabın içinde 800 mililitre distile su ölçün. Sonra, tartmak 8.2 susuz sodyum asetat gram, ve beher ekleyin. Bir karıştırma plakası üzerine beher yerleştirin.Kabın içine bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve tamamen eriyene kadar karıştırmak için karıştırma plakası açın. Susuz sodyum asetat tamamen çözündüğünde, çözeltinin pH'ını ölçmek için kalibre edilmiş bir pH metre kullanın. Buna göre 4.6 istenilen pH elde etmek için 1 molar hidroklorik asit veya sodyum hidroksit eklemek için bir pipet kullanın.Toplam hacim 1.000 mililitreye ulaşana kadar kabın içine distile su ekleyin. Enzim çözeltisini hazırlamak için, 15 mililitrelik bir silindirde, 0,1 molar sodyum asetat tamponunun 8 mililitresini ölçün. Daha sonra, enzim ile 15 mililitrelik konik tüp içine tampon çözeltisi ekleyin ve enzim eriyene kadar şiddetle sallayın.Toplam birim 10 mililitreye ulaşana kadar daha fazla arabellek çözümü ekleyin. Enzim çözeltisini kullanıma kadar 4 santigrat derecede saklayın. Substrat çözeltisini hazırlamak için, substratı tartın ve 100 mililitrelik cam kabına yerleştirin.Tampon çözeltisinin 20 mililitresini ölçmek için mezun olmuş bir silindir kullanın ve sonra cam kabına ekleyin. Bir karıştırma plakası üzerine beher yerleştirin ve beher içine bir manyetik karıştırma çubuğu yerleştirin. Isıyı açın ve karıştırma hızını buna göre ayarlayın.Substrat eriyene kadar karıştırmadevam edin. Substrat çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe dökün ve toplam hacmi 45 mililitre olana kadar daha önce hazırlanmış sodyum asetat tamponu ekleyin. Karıştırmak için tüpü sallayın.Substrat çözeltisini kullanıma kadar oda sıcaklığında saklayın. Bilgisayarda ITC Çalıştır'ı açın ve kuruluma tıklayın. Karıştırma oranını tıklatın ve 350 rpm olarak ayarlayın.Şırınga nın boyutunun 50 mikrolitre olduğunu kontrol edin. Sıcaklığı 55 dereceye ayarlayın ve güncellemeye basın. ItC cihazının gerektiği gibi ısınması veya soğuması için yeterli zaman tanımak için ilerlemeden önce en az bir saat bekleyin.Enzimi yüklemeden önce, referans hücrenin 350 mikrolitre distile su ile yüklendiğinden emin olun. Örnek hücreyi temizlemek için yükleme şırıngasını yüzde 2 temizleme çözeltisinin 500 mikrolitresi ile doldurun. İğneyi dikkatlice örnek hücreye takın, hücreyi doldurun ve aynı şırıngayı kullanarak sıvıyı yavaşça çıkarın.Sıvıyı bir kabın içine atın. Bu adımı yüzde 2 temizleme solüsyonuyla, üç kez yüzde 70 etanol ile tekrarlayın ve sonra damıtılmış suyla on kez yıkayın. Numune hücresi temizlendikten sonra yükleme şırıngasını 450 mikrolitre enzim çözeltisi ile doldurun.İğneyi numune hücresinin dibine kadar dikkatlice takın ve hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için yavaşça 100 mikrolitrelik çizgiye doğru bastırın. Daha sonra, 50 mikrolitrelik titrasyon şırıngını, iğne ucunu suya koyarak üç kez yıkayın ve suyu yavaşça şırıngaya alın ve suyu bir atık kabına dağıtın. Artık suyu temizlemek için substrat çözeltisi ile üç kez durulayın.Bundan sonra, şırınga herhangi bir hava kabarcıkları olmadan dolu olana kadar çözelti çizerek substrat çözeltisi ile titrasyon şırınga doldurun. Şırınga hala substrat çözeltisindeyken, pistonu çıkarın ve yaklaşık 2 mikrolitre havanın şırınganın üst kısmına girmesine izin verin ve pistonu yeniden takın. ITC'nin burette sapını çıkarın, şırıngayı burette sapının içine yerleştirin ve sıkı olana kadar vidala.Titrasyon şırıngasının ucunu tüy bırakmayan bir dokuyla silin ve burette sapını dikkatlice ITC aletine yerleştirin ve yerine kilitleyin. Deneme kurulumu için artımlı titronu seçin. Enjeksiyonları ayarlamak için ekle'yi tıklatın.Enjeksiyon aralığını 5, 400 saniye, enjeksiyon hacmini 4 mikrolitreye ve enjeksiyon sayısını dörde ayarlayın. Ayarları onaylamak için Tamam'a basın. Equilibration kutusunda, otomatik denge ve beklenen büyük ısıları seçin.İlk taban çizgisini 300 saniyeye ayarlayın. Çalıştırmayı başlatmak için karıştırma hızının yanındaki başlat simgesini tıklatın ve ardından anahtar sembolünün yanında bulunan başlat'ı tıklatın. Dosyayı kaydedin ve enstrümanın çalışmasına izin verin.Verileri çözümlemek için Nano Analyze'da dosyayı açın. Verileri tıklatın ve veri sütunlarını seçin. Tüm verileri seçin, kopyalayın ve verileri Microsoft Excel'e yapıştırın.0 yapmak için 300 saniye de gerekli değeri ekleyerek 0 taban çizgisi ayarlayın. Bu düzeltmeyi ısı oranı değerlerinin tüm sütununa uygulayın. Ardından, titrasyon sırasında değerin oluştuğu zamana göre minimum veya maksimum değerlerin grafiklerini çizin.Bu protokolde, LAKtaz aktivitesinin ITC veri izleri pH 4.6 tampon 55 santigrat derece, 45 santigrat derece, 35 santigrat derece ve 25 santigrat derece laktaz çözeltisi içine laktoz dört ardışık enjeksiyonları ile gösterilir. Karıştırma ısısı için 55 santigrat derecede enzim kontrolü yapılmadı. Enzimin her enjeksiyonu için, karıştırma bir başlangıç ekzotermik ısı vardır, ve daha sonra, laktoz laktaz katalize enfortermik hidroliz reaksiyonu tamamlanana kadar oluşur, ve ısı hızı taban çizgisine döner.Her enjeksiyondan sonra endotermik pik minimum, enzimatik aktivitenin azalması nedeniyle önceki enjeksiyondan biraz daha azdır. Beklendiği gibi, her enjeksiyon için enzim stabilitesi artan sıcaklık ile azalır. Kontrol deneyi, 25 santigrat derecedeki laktaz aktivitesinin enzim aktivitesinde dört enjeksiyondan sonra seyreltme nedeniyle yüzde 8 oranında azaldığını gösteriyor.Dördüncü enjeksiyonun tsurelde yüzde 73'lük bir azalma gösterdiği düşünülürse, gerçek enzim aktivitesi kaybı bu nedenle yüzde 65'tir. Böylece, laktaz seyreltme her enjeksiyon sonucu, enzim aktivitesi üzerinde yüzde 11 nispeten küçük bir etkisi vardı. Enzim ve substrat çözeltilerinin yapmak için kullanılan tamponun mümkün olduğunca yakın eşleşmesi önemlidir.pH veya konsantrasyon uyumsuzluk reaksiyon ısı maskeleyebilir karıştırma daha büyük bir ısı neden olabilir. Bu protokolü enzimlerin incelenmesi ve reaksiyon sırasında salınan veya emilen ısı oranını ölçerek kararlılıklarını belirlemek için uygulayabilirsiniz.

measuring-enzymatic-stability-by-isothermal-titration-calorimetry

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

ITC, ev sahibi bir ligand bağlama eğitimi için güçlü bir araçtır. Ancak karmaşık sistemler, çeşitli modeller eşit derecede iyi veriler uygun olabilir. Burada anlatılan yöntem kompleks sistemler için uygun bir bağlama modelini aydınlatmak ve ilgili termodinamik parametreleri ayıklamak için bir araç sağlar.

Cilt Mekanizmaları belirleme Sipariş Değişken konsantrasyon İzotermal Titrasyon Kalorimetre Veri Kümeleri toplanıyor

Izotermal titrasyon kalorimetri orta bağlanma afiniteleri ile biyolojik sistemler için bağlayıcı termodinamik izlemek için kullanmak için genel bir protokol sunulmuştur.

Makromolekül-ligand Affinity Ölçüm İzotermal Titrasyon Kalorimetre

Bir bakteri kültürünün seri seyreltmelerini alın ve büyüme ortamı içeren kalorimetrik şişelere alikotlar ekleyin.Metabolik ısı üretimini ölçmek için kapalı şişeleri izotermal mikrokalorimetrenin çok kuyulu plakasına yükleyin.Cihaz, tespit edilen ısının yalnızca bakteri metabolizmasından kaynaklandığından emin olmak için sabit bir sıcaklıkta tutulur.Bakteriler besinleri metabolize edip çoğaldıkça, sensörlerin gerçek zamanlı olarak algıladığı ısıyı serbest bırakırlar.Paralel olarak, aynı şişeleri...

Bakterilerde Metabolik Aktiviteyi İzlemek için İzotermal Mikrokalorimetri

8-oxoguanine DNA glikozilaz en glikozilaz aktivite için zaman kurslar ürün oluşumu ve doğrusal kararlı durum faz bir patlama gösteren bifazik bulunmaktadır. Sırasıyla 8-oxoguanine ve ürün DNA'dan glikozilaz serbest çıkarılması karşılık bastırma-akım teknikleri, patlama ve kararlı durum oranları ölçülebilir, kullanılması.

DNA glikosilaz Faaliyet için kararlı durum, Ön kararlı durum ve Tek cirosu Kinetik Ölçüm

Izotermal titrasyon kalorimetre önlemler ısı akışı serbest veya kimyasal reaksiyonlarda absorbe. Bu yöntem, enzim katalizi ölçmek için kullanılabilir. Bu yazıda, enstrümantal kurulumu için protokol, deneme çalışan ve veri analizi genel olarak anlatılmıştır, ve jack fasulye üreazla enzimatik üre hidroliz karakterizasyonu uygulanır.

Sıcak Biyolojik kataliz: İzotermal Titrasyon Kalorimetre enzimatik reaksiyonların Characterize

in vitro ATPase aktivitesini ölçmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, belirli bir saflaştırılmış ATPaz için aktivite düzeyine ve gereksinimlere göre optimize edilebilir.

ölçme<em&gt; İn Vitro</emEnzimatik Karakterizasyonu için&gt; ATPaz Aktivitesi

Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır.

Diferansiyel Taramalı Kalorimetre - Protein Antigen Termal İstikrar ve Yapısının Değerlendirilmesi Bir Yöntem

Bir iletişim kuralı hızla termal kayması deneyleri ve nano fluorimetry tarama fark koşulları çeşitli proteinler termal kararlılığını sınamak için sunulmaktadır. Tampon sistemleri, tuzları ve katkı maddeleri, birlikte üç benzersiz istikrar ekran, oluşan uygun işlevsel ve yapısal çalışmalar arabelleklerini tanımlamak için protein ile denetlesinler.

Protein dengelemek nasıl: istikrar ekranlar için termal kayması deneyleri ve Nano diferansiyel Fluorimetry virüs-X projede tarama

Bu protokol, numune hazırlama, çalışma standartları ve numuneler dahil olmak üzere bir DNA aptamer ve tetrasiklin arasındaki bağlanmanın ilişkisini ve ayrışma kinetiğini analiz etmek için İzotermal Titrasyon Kalorimetrisinin (ITC) kullanımını açıklamaktadır.

İzotermal Titrasyon Kalorimetrisi Kullanılarak DNA Aptamer ve Tetrasiklinin Termodinamik ve Kinetik İlişkisinin Belirlenmesi

Planta'da besin ve toksik madde akılarının ölçümü, bitki beslenmesi ve toksisitesinin incelenmesi için esastır. Burada, örnek olarak potasyum (K+) ve amonyak/amonyum (NH3/NH4+) akılarını kullanarak, bozulmamış bitki köklerinde akıntı ve akış tayini için radyoizleyici protokollerini ele alıyoruz. Bu tür tekniklerin avantajları ve sınırlamaları tartışılmaktadır.

Radyoaktif izleyiciler ile Bitkilerde Mineral Besin ve Toksikantların Değişimler Ölçme

Öğrenin enzimatik istikrarın izotermal titrasyon kalorimetresi ile ölçümünü. Bu yöntem, enzim aktivitesinin termal stabilitesini doğrudan değerlendirerek geleneksel testlere göre daha az iş gücü gerektirir ve çeşitli enzimlerle kullanılabilir.

İzotermal titrasyon Kalorimetre tarafından ölçüm enzimatik istikrar

Daha fazla video keşfet