Neuritogenez ve Sinaps Matürasyonu yüksek içerikli Tarama için İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Nöronların Post-differentiation Rekaplamag
28 Ağustos 2019
Bu protokol, daha önce birden fazla hafta boyunca in vitro nöral atalardan farklılaşmış insan kök hücre türetilmiş nöronlar resucan ve kültür için ayrıntılı bir prosedür açıklar. Prosedür, ışık mikroskobu ve yüksek içerikli tarama ile uyumlu bir formatta nöritler, sinapslar ve geç ifade nöronal belirteçlerin görüntüleme tabanlı tahlilleri kolaylaştırır.
Bu protokol, yüksek içerik tarama uygulamaları için insan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronların kullanımını kolaylaştırır. Özellikle iyi sinaps lar, insan nöronlar uzun kültür dönemleri gerektiren atama kiçin uygundur. Büyük formatlı yemeklerden HCS uyumlu çoklu kuyulara kadar nöronların canlılığını koruyacak şekilde yeniden kaplamasını gösteriyoruz.
Sezgilere karşı, proteaz kuluçkasını yeniden sulandırma ve rekaplamadan önce uzatmanın nöronal sağkalımı artırdığını gösteriyoruz. İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar giderek temel araştırma, ilaç geliştirme ve dejeneratif tıp alanlarında ilgili. Bu nazik titrasyon yöntemi, kalın bir işlem ağına sahip büyük tek hücre tabakasını yeniden askıya almak için kullanılabilir.
İnsan iPSC'lerine ek olarak, birincil nöronların kültürünü yeniden kaplamak veya onları sıralama veya tek hücre dizilimi için yeniden askıya almak için kullanılabilir. Protokol adımlarını dikkatle takip etmek ve nöronların plakadan ayrılmasını sık sık izlemek önemlidir. En uygun kuluçka süresi kültüre bağlı olarak değişebilir.
Görsel gösteri bile deneyimsiz araştırmacılar bu prosedürü çoğaltmak için sağlar. PBS ile farklılaştırılmış nöronların plakasını hafifçe durulayarak başlayın. PBS'yi plakanın duvarından aşağı yayılTın ve bozulmaması için doğrudan hücrelere dağıtmayın.
PBS'yi çanak kenarından aspire ederken, hücrelere dokunmamaya özen gösterilsin. 10 santimetrelik plaka başına en az bir mililitre proteolitik enzim uygulayın. Ve hücreleri 40-45 dakika boyunca kuvöze geri verin.
Kuluçka sırasında, fazlı kontrast mikroskop üzerinde nöronlar kontrol edin ve nöral ağ tamamen plaka ayırır ve parçalanmaya başlayana kadar proteaz tedaviye devam edin. Nöronlar ayrıldığında, proteaz her bir mililitre için taze DEMEM medya beş mililitre ekleyerek sindirim durdurmak. Hücreleri plakaya karşı beş ila sekiz kez hafifçe titreetmek için serolojik pipet kullanın ve çok fazla basınç uygulamadığından emin olun.
Hücreleri 100 mikrometrelik bir kafesten 50 mililitrelik konik bir tüpe doğru süzün. Ve taze DMEM medya ek beş mililitre ile süzgeç durula. Hücreleri 1000 kez G'de beş dakika boyunca aşağı döndürmek için bir tezgah üstü santrifüj kullanın.
Santrifüjden sonra konik tüpü biyogüvenlik kabinine geri döndürün ve ortamların çoğunu aspire edin, hücreleri nemli tutmak için 250 mikrolitre bırakın. İki mililitre taze DMEM medyasındaki hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve beş mililitrelik serolojik pipetin ucundan geçirin. Son olarak, tüpü 2-3 kez ters çevirin.
Canlı hücreleri saymak için hemositometre ve tripan mavikullanın. Ve sonra DMEM istenilen konsantrasyona. Belirli hücre hattının gereksinimlerine bağlı olarak, tüp için uygun takviyeleri ekleyin ve yavaşça konik tüp 2-3 kez yatırarak hücreleri karıştırın.
24 kuyulu bir plakadan aspire laminin kaplama ve pbs ile bir kez durulayın. PBS'yi aspire edin. Ve kümelenmeyi önlemek için sekiz şeklindeki her kuyuya hücre çözeltisi uygulayın.
Hücreleri kaplama bittiğinde, 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit olarak belirlenen kuvöz plaka dönmek. Kısaca erken hücre ölümü muhabiri stok çözüm girdap ve el yazması talimatlarına göre kuyulara ekleyin. 20 dakika bekleyin.
Ve sonra cam alt çok kuyularda canlı ve ölü hücreleri görüntü. Proteaz kuluçka uzatılması hücrelerin kaldırılan levha içinde nöronal ağ gevşeme sağlar. Bu da dissosiyasyon sırasında hücre ölümünün azalmasına ve sonraki günlerde daha verimli bir iyileşmeyle sonuçlanır.
Genişletilmiş enzim kuluçka prosedürü kullanarak, kültürler replating ve ölü veya ölmekte olan hücrelerin daha düşük yoğunluğu sonra gün boyunca hücre canlılığı yaklaşık iki katına sergiler. Nöronal farklılaşmageçiş aşaması birkaç gün içinde gerçekleşir, sırasında hücreler yavaş yavaş geç evre nöronal belirteçleri ifade. Bu belirteçler, dört haftalık ön farklılaşmadan sonra yeniden doldurulan kültürlerde hemen tespit edilir.
Genişletilmiş proteaz protokolü de orta neuride büyüme artırır. Hem total neurit uzunluğu hem de dendrit büyümesi iyileşir. Replating de sinapslar çalışma için yararlıdır.
Rekaplamadan sadece bir hafta sonra sinaptik öncesi ve sonrası proteinler için belirteçler gözlendi. Ayrıca, spontan depolarizasyon ve sinaptically tahrikli akımlar elektriksel aktivite kalsiyum görüntüleme veya multielektrot dizileri kullanılarak tespit edilebilir. Bu kaplama yordamı birçok uygulama türüne uyarlanabilir.
Potansiyel terapötik bileşikleri belirlemek için yüksek içerik tarama ek olarak, görüntüleme büyüme konileri veya multielektrot dizi kayıtları için kullanılabilir. Zaten uzun süreçler oluşturmuş nöronların mekanik dissosiyasyonu stresli. Uzatılmış enzimatik kuluçka ve hücrelerin nazik titrasyonu bu işlemin başarısı için gerekli adımlardır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, in vitro farklılaştırılmış insan kök hücre kaynaklı nöronların yeniden süspanse edilmesi ve kültürlenmesi için bir prosedür belirlemektedir. Yöntem, nöritler, sinapslar ve nöronal markörler için görüntüleme temelli tahlilleri sağlar ve yüksek içerikli taramal uygulamaları için uygundur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kök Hücre Biyolojisi
- Hücre Kültürü Teknikleri
Arka Plan
- İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronlar, sinapsların çalışılabilmesi için kritiktir.
- Bu nöronlar olgunlaşmaları için uzun süreli kültür dönemleri gerektirir.
- Kültür sırasında nöronal canlılığın arttırılması, doğru tahlil için esastır.
- Prosedür, yeniden yerleştirme sonrası hücre kurtarımını ve canlılığını arttırır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan kök hücre kaynaklı nöronların kültürlenmesi için güvenilir bir yöntem oluşturmak.
- Yüksek içerikli taramal için etkili yeniden yerleştirmeyi göstermek.
- Hücre sağlığını iyileştirmek için proteaz inkübasyon süresini optimize etmek.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan pluripotent kök hücre kaynaklı nöronları içeren hücre kültürü yöntemi.
- Hücrelerin nazikçe ayrılması için detaylı bir proteaz tedavisi kullanıldı.
- Protokol sürecinde nöron ayrılmasını izlemek için görsel kontroller dahil edildi.
- İnkübasyon ve yeniden yerleştirme süreçleri için sıkı bir zaman çizelgesi izlendi.
- Yöntem, diğer nöron tipleri ve uygulamalar için uyarlanabilirdir.
Ana Bulgular
- Uzatılmış proteaz inkübasyonu, nöronal sağkalımı artırdı ve hücre ölümünü azalttı.
- Yeniden yerleştirmeden sonraki birkaç gün boyunca gelişmiş nörit çıkışı ve canlılık gösterildi.
- Replatting'den bir hafta sonra sinaptik proteinler için markörler gözlendi.
- Elektriksel aktivite tespit edilebilir hale geldi, bu da işlevsel nöronal ağlar olduğunu gösterir.
Sonuçlar
- Çalışma, nöronal kültür ve tahlil uygulamaları için tekrarlanabilir bir protokol sağlamaktadır.
- Artan sağkalım ve nörit büyümesi, nöronal işlevsellik üzerinde daha fazla araştırmayı kolaylaştırır.
- Bulgular, nöronal mekanizmaların ve potansiyel terapötik yolluların anlaşılmasına katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Replating human pluripotent stem cell-derived neurons enables high-content screening of neuritogenesis and synapse maturation within a compressed timeline, addressing the bottleneck of lengthy differentiation cycles in drug discovery. This approach supports scalable, reproducible assays for target validation and phenotypic screening in neurodegenerative disease models. By improving cell viability and preserving functional networks post-replating, the method enhances predictive confidence in early-stage compound evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through scalable assessment of neurite outgrowth and synaptic marker expression in human neurons.
- Operational Value: Provides a reproducible system for functional target validation using late-stage neuronal markers such as NeuN and CTIP2.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by allowing rapid detection of compounds affecting neurite regeneration and synapse assembly within two weeks post-replating.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates preparation of uniformly distributed, viable neurons in 384-well formats for high-content imaging of neurite length and synaptic puncta.
- Operational Value: Ensures assay standardization through enzymatic dissociation and gentle titration, minimizing variability from mechanical stress.
- Scalability: Enables platform reuse across compound libraries and gene perturbation studies with consistent cell recovery and viability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease-relevant neuronal phenotypes from discovery through preclinical validation by preserving synapse maturation trajectories.
- Mechanistic De-risking: Allows monitoring of pre- and post-synaptic protein expression and electrical activity as functional readouts for target engagement.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions based on quantitative neuritogenesis and synaptogenesis readouts prior to in vivo studies.
Pipeline & Workflow Integration
The replating method bridges early discovery and preclinical workflows by providing a scalable neuronal model compatible with high-content screening timelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via quantitative imaging of neurite outgrowth and dendritic arborization.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized dissociation and replating in multi-well formats.
- Analytics: Enables comparison of conditions via measurable outputs such as total neurite length, dendrite growth, and synaptic protein signal intensity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through detection of spontaneous electrical activity and synaptically-driven currents post-replating.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable neuronal plating capability applicable across multiple assay types and screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neurite and synapse formation assays.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through defined protease titration and gentle resuspension steps.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by shortening the time-to-assay for mature neuronal phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on early-stage neuritogenesis and synaptogenesis efficacy.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell-derived neuronal culture and enzymatic dissociation techniques.
- Depends on access to phase-contrast microscopy for monitoring neural network detachment during protease incubation.
- Necessitates standardized protocols for protease concentration, incubation time, and titration to ensure cross-lot consistency.
- Requires adaptation of coating and seeding densities when transitioning between different multi-well formats.
- Practical limitations include variability in optimal protease incubation time across cell lines and differentiation stages.
