Name: Isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek Silks malzeme oluşumu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-06T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Öğrenin, rekombinant örümcek ipek proteinlerini suyla çözerek çeşitli malzeme formları üretme yöntemini. Bu teknik, biyoteknoloji ve malzeme bilimi alanlarında yeni uygulamalar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar minnetle Utah bilim ve teknoloji araştırma (USTAR) girişimi fon kabul etmek istiyorum.

1. liyofilize protein stokları rekombinant örümcek ipek karışımı hazırlama
<ol><li>İstenilen malzeme oluşumları için gerekli formülü ve hacmi belirleyin. Tipik formülasyonlar% 3 ' ten (w/v)% 15 ' e kadar (w/v) değişir. Bu seçimi kullanarak, uygun rSSp, konsantrasyonları ve oranları hesaplayın.<ol>
<li>Bu protokolde açıklanan her malzemeyi hazırlamak için aşağıdaki ilgili formülasyonları kullanın: hidrogeller/süngerler/lyogels,% 6 (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; Filmler/kaplamalar,% 5 (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2; Yapıştırıcılar,% 12 (w/v) 50:50 MaSp1: MaSp2; lifleri, 12,5% (w/v) 80:20 MaSp1: MaSp2. Not: çoğu formülasyonları özel formlar ve malzemeler için daha iyi monte olsa da, genellikle örtüşebilir formülasyonlar geniş bir yelpazede vardır. Ayrıca, son rSSp malzemeleri de istenilen özellikleri üretmek için oluşum ve işleme sırasında uyarlanmış olabilir. Genellikle, her protein uygun veya yararlı parametreler içine soruşturma gerektirecektir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kauçuk astarlı vida kapağı ile temiz ve yeni 8 ml otoklavlanabilir borosilikat cam kültür şişe seçin.</li>
	<li>Kapağı çıkarın ve boş şişeyi analitik bir denge üzerine yerleştirin. Denge sıfır kütle okur böylece boş şişe kütlesi Dara.</li>
	<li>İstenilen lizofilize rSSp tozu her özel malzeme için boş şişeye ekleyin.<ol>
<li>Her malzeme için her protein türünün bu belirli kütlelerini kullanın, 2 mL çözüm hazırlarken: hidrogeller/süngerler/lyogels, 60 mg MaSp1 ve 60 mg MaSp2; Filmler/kaplamalar, 80 mg MaSp1 ve 20 mg MaSp2; Yapıştırıcılar, 120 mg MaSp1 ve 120 mg MaSp2; lifler, 200 mg MaSp1 ve 50 mg MaSp2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İstenilen miktarda ultra saf suyu, en az 2 ml, zaten ağırlıklı rssp tozları içeren şişeye ekleyin. Not: tüm solvasyon prosedürleri için en az 2 mL 'Lik bir hacim önerilir.</li>
	<li>Mühür şişe kap ve briskly bir dağınık oluşturmak için içeriği Vortex, ve homojen, şimdi solvasyon prosedürü için hazır olan rssp karışımı. Sonication veya pervane karıştırma gibi ek homojenizasyon yaklaşımlar ile istihdam edilebilir, ya da ek olarak, Vortex karıştırma.</li>
</ol>2. rekombinant örümcek ipek solvasyon
DIKKAT: solvasyon prosedürü sırasında yüksek ısıtmalar ve baskılar üretilir. Bu süreç için uygun kişisel koruyucu ekipmanlar, özellikle gözlük, uzun kollu ve ısıya dayanıklı eldivenler gereklidir.
<ol><li>Bu sıkıca ve güvenli bir şekilde sıkılaştırılmış olduğundan emin olmak için şişe, veya gemi, kap son bir kontrol gerçekleştirin. Ardından, askıya alınan rSSp karışımını geleneksel bir mikrodalga fırınına aktarın. Not: 700 ' den 1.500 watt 'a kadar güç aralığında mikrodalga üniteleri, daha küçük iç oda kapasiteleri bulunan ve dönen platformlar daha iyi besleme koşulları sağlamak için tavsiye edilir.</li>
	<li>Tam güce sahip 5 s patlamaları ile mikrodalga çalışma başlayın. Her patlama kısa bir süre sonra kapıyı açın ve dikkatle Mix/girdap önlemek için şişe yerleşmek ve askıya karışımı korumak.</li>
	<li>Karışım ve/veya çözelti, bir kızılötesi termometre ile doğrudan şişenin bölümlerini içeren çözüme karşı ölçülen en az 130 °C sıcaklık elde edene kadar bu mikrodalga işlemi tekrarlayın. Tüm katı partiküller tamamen çözülmüş ve artık görünmez olana kadar bu işlemi yineleyin. Not: Bu şişe ve çözüm zaman zaman serin izin vermek için önerilir, özellikle formülasyon rSSp mevcut yüksek bir konsantrasyon varsa. 200 °C ' yi aşan sıcaklıklar şişe mühür yetmezliği riskini arttırır. Süper ısıtılmış karışımı/çözeltinin mührü dokunmasını önlemek için, ayrıca şişe muhafaza arızasına neden olacak özel dikkat da verilmelidir.</li>
	<li>Bir çözüme rSSp karışımı başarıyla solvating sonra çözeltinin sıcaklığı ve şişe kapağı 100 altında soğutmak için izin ° c (kaynama noktası) açmadan önce.</li>
</ol>3. Hidrojeller
<ol><li>Mikrodalga çıkarttıktan sonra çözeltinin bir hidrojel hazırlayın ve serin ve ayarlamak için izin. Hidrojel tamamen serin izin vermeden önce belirli geometriler içine cast. Not: farklı rSSps bir hidrojel geçiş zaman çeşitli miktarlarda gerektirir. Örneğin, MaSp2 benzeri diziler MaSp1 benzeri dizilere kıyasla daha hızlı Hidrojeller oluşturmak eğilimindedir. Protein konsantrasyonları, tuzluluk ve pH da doğrudan bir hidrojel geçiş hızını etkiler.</li>
</ol>4. süngerler
<ol><li>İlk olarak bir hidrojel oluşturmak için birincil solvated çözüme izin vererek bir rSSp süngerleri hazırlayın.</li>
	<li>Hidrojel su küvetine yerleştirin, bu banyosu buzdolabına-20 °C ' de yerleştirin ve banyo tamamen donduruluncaya kadar bekleyin.</li>
	<li>Dondurulmuş hidrojel ve su banyosunun dondurucudan çıkarılması ve 25 °C ' de çözünmesi ile sünger oluşumu sürecini tamamlayın. Ortaya çıkan sünger artık çözülmüş sudan kaldırılabilir.</li>
</ol>5. lyogel
<ol><li>Bir rssp lyogel doğrudan oluşturulan bir hidrojel dondurarak hazırlamak, ya da bir su banyosu olmadan, ve bir kurutucu dondurulmuş hidrojel örnek transfer (dondurma kurutma makinesi).</li>
	<li>Nem süblimasyon oluştuğu geminin son liyofilize jel malzeme çıkarın.</li>
</ol>6. Filmler ve kaplamalar
<ol><li>Üç aşağıdaki yöntemlerden birini kullanın: çözüm döküm, çözüm püskürtme, veya daldırma kaplama film veya rSSp kaplamaları üretmek için.<ol>
<li>İstenen şeklin PDMS formları içine/üzerine çözünen ipek çözeltisi cast.</li>
		<li>Film çözeltisi 200 μL dökmek ve yaymak ve test veya tedavi için PDMS substrat onları soyulmadan önce bu kuru izin.</li>
		<li>Bunların kurumasına izin verdikten sonra, mekanik testler için oluşturulan filmleri çıkarın veya mekanik özellikleri iyileştirmek için filmleri sonrası tedavi edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir kaplama hazırlamak için, veya substrat kaldırılamaz bir film, ince bir film tabakası üretmek için ya sprey veya daldırma kaplama kullanın. Not: ceket sprey Için, bu protokol bir Master Airbrush modeli boya püskürtücü ile başarı buldu.<ol>
<li>Sadece çözünen rSSp içine seçim substrat alt ve istenen kalınlığı elde etmek için kurutduktan sonra tekrarlayın bir daldırma kaplama formu.</li>
		<li>Son kaplama tutarlılığı ve etkinliğini artırmak için bir daldırma ceket uygulamadan önce bir ilk sprey ceket gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. yapıştırıcılar
Not: yapıştırıcıların oluşumu aşağıdaki yöntemlerden biri aracılığıyla elde edilir.
<ol><li>Doğrudan bir substrat üzerine çözünen rSSp ekleyin ve sonra çözümün üst kısmında ikinci bir substrat uygulayın. Parçaları birlikte sıkıca kelepçe ve daha sonra en az 16 h için 25 °C asgari sıcaklık ile bir fırında örnekleri kurutun.</li>
	<li>Alternatif olarak, bir sprey kaplama ile iki substrat yüzeyleri sprey ve sonra birlikte substratlar kelepçe.</li>
	<li>RSSp 'yi substrat kaplamasının daldırma yöntemiyle uygulanması ve substratlar yapışmasını hazırlamak ve yapıştırıcı için de kullanılabilir.</li>
</ol>8. ıslak-spun lifleri
<ol><li>Bir 19 G kayma iğne ile Luer-Lok ucu ile bir eşmerkezli şırınga içine çözünen uyuşturucu solüsyonu yükleyin. Hava kabarcıklarını çıkarın ve uyuşturucunun şırınganın luer-Lok ucunda otursun.</li>
	<li>En az 25 mm PEEK boru, iç çapı 0,01 inç, PEEK tüpünün tek parça parmak sıkı bağlantı parçaları içine 1/16 inç OD ve 10/32 koni takın. Bu bağlantı elemanı, Luer-Lok dişi adaptörüne bir PEEK borusu takın.<ol>
<li>19 kalibrelik iğneleri, yüklenmiş şırıngayı bu kurla değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doldurmak bir uzun boylu, açık cam banyo ile 99% saf izopropanol Koagülasyon Banyosu için kullanmak.<ol>
<li>Streç godets altında bulunan streç Banyoları doldurun. Bu 80:20 isopropanol olacak: ilk streç banyoda distile su, ve 20:80 isopropanol: ikinci streç banyoda distile su.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koagülasyon banyo ve ilk streç banyoda ilk Godet sonra ilk Godet aynı hızda döner gibi Godet streç sistemi ayarlayın.<ol>
<li>Streç banyo 1, orta üst Godet ve aynı hızda streç banyo 2 ilk Godet son Godet hızları ayarlayarak ilk streç başlatın. Bu hız, ilk fiber kaldırma hızı kadar hızlı 2x olacaktır.</li>
		<li>Streç banyo son Godet hızları ayarlayarak ikinci streç başlatın 2, son üst Godet, ve aynı hızda sarıcı. Bu hız, ilk streç veya 4X ilk lifler kaldırma hızı için kullanılan hız kadar hızlı 2x olacaktır.</li>
		<li>Lif kayma tutmak için ara Godeli dışında nitril eldiven yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Çözümü yavaşça pıhtılaşma banyosuna ekstrüze etmeye başlayın. Otomatik bir sistemde Ekstrüzyon hızını 10 mm/s kaldırma hızına uyacak şekilde ayarlayın.<ol>
<li>Fiber ekstrüzyon ince bir metal kanca veya forseps kullanarak banyo lifleri çekmeden önce üniforma haline izin verin. Banyosundan fiber kaldırarak doğrulamak PEEK Boru ucu ve banyo banyo bırakarak fiber yolu arasında bir döngü oluşturdu.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bir makara üzerine gitmeden önce lifin streç banyoları içinde batık ama streç banyoları arasında havada kurutulması gibi Godeli serisi ile alınan fiber Kılavuzu. Bu kuruma yüksek yerleştirilmiş ara godets tarafından elde edilir. Not: fiber kaldırma oranı ve/veya ekstrüzyon oranı protein konsantrasyonu, katkı maddeleri, ve protein türü üzerinde koagülasyon banyosunun alt lifleri havuzu olmadan bol pıhtılaşma süresi izin göre ayarlanması gerekir.</li>
	<li>Bant kullanarak sarıcı mekanizması üzerinde biriktirme için tam olarak gergin fiber takın.</li>
</ol>

<ol><li>Huemmerich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Structure+Elements+of+Spider+Dragline+Silks+and+Their+Contribution+to+Protein+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Primary Structure Elements of Spider Dragline Silks and Their Contribution to Protein Solubility.</a> Biochemistry. 43 (42), 13604-13612 (2004).</li>
<li>Schacht, K., Scheibel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+Hydrogel+Formation+of+a+Recombinant+Spider+Silk+Protein%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Controlled Hydrogel Formation of a Recombinant Spider Silk Protein.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2488-2495 (2011).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+Than+Just+Fibers%3A+An+Aqueous+Method+for+the+Production+of+Innovative+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">More Than Just Fibers: An Aqueous Method for the Production of Innovative Recombinant Spider Silk Protein Materials.</a> Biomacromolecules. 16 (4), 1418-1425 (2015).</li>
<li>Tucker, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+and+Physical+Properties+of+Recombinant+Spider+Silk+Films+Using+Organic+and+Aqueous+Solvents%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mechanical and Physical Properties of Recombinant Spider Silk Films Using Organic and Aqueous Solvents.</a> Biomacromolecules. 15 (8), 3158-3170 (2014).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sticky+Situation%3A+An+Investigation+of+Robust+Aqueous-Based+Recombinant+Spider+Silk+Protein+Coatings+and+Adhesives%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">A Sticky Situation: An Investigation of Robust Aqueous-Based Recombinant Spider Silk Protein Coatings and Adhesives.</a> Biomacromolecules. 17 (11), 3761-3772 (2016).</li>
<li>Jones, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+Heat+and+Pressure+for+Solubilization+of+Recombinant+Spider+Silk+Proteins+in+Aqueous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Importance of Heat and Pressure for Solubilization of Recombinant Spider Silk Proteins in Aqueous Solution.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (11), 1955(2016).</li>
<li>Copeland, C. G., Bell, B. E., Christensen, C. D., Lewis, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Process+for+the+Spinning+of+Synthetic+Spider+Silk%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Development of a Process for the Spinning of Synthetic Spider Silk.</a> ACS Biomaterials Science and Engineering. 1 (7), 557-584 (2015).</li>
<li>Arcidiacono, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+Processing+and+Fiber+Spinning+of+Recombinant+Spider+Silks%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Aqueous Processing and Fiber Spinning of Recombinant Spider Silks.</a> Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).</li>
<li>Work, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+Major+Ampullate+Silk+Fiber+Formation+by+Orb-Web-Spinning+Spiders%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+American+Microscopical+Society%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of Major Ampullate Silk Fiber Formation by Orb-Web-Spinning Spiders.</a> Transactions of the American Microscopical Society. 96 (2), 170-189 (1977).</li>
<li>Decker, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+Destruction+of+Endotoxin+in+Synthetic+Spider+Silk+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Method for the Destruction of Endotoxin in Synthetic Spider Silk Proteins.</a> Scientific Reports. 8 (12166), 1-6 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar hiç bir ilgi çatışması bildirmiyor.

Rekombinant örümcek ipek proteinleri arıtıldıktan sonra, malzeme oluşumu için kullanılabilecek bir çözelti içinde hazırlanmalıdır. Likofilize örümcek ipek proteini su ile karıştırarak ve bu karışımı mikrodalga ışınlarına maruz bırakarak, ısı ve basınç oluşturmak için, rSSp çözümünü hazırlamak mümkün. Bu basit ve verimli rSSp çözünme yönteminden çok çeşitli malzeme formları üretilebilmektedir. Her malzemenin istenilen sonuç ve özellikleri elde etmek için benzersiz bir şekilde hazırlanması ve işlenmesi gerekir. İlk formüla...

Spider ipek güç, elastikiyet ve biyouyumluluk onların etkileyici kombinasyonu için malzeme bilim adamlarının ilgisini topladı. Liflerin yeniden oluşturulması geleneksel olarak araştırmanın itme gücü olmuştur. Bu çaba, su içinde rekombinant örümcek ipek proteini (rSSp) inçözünme yanı sıra geleneksel solvasyon teknikleri (chaotropik ajanlar ve deterjanlar) sulu solvasyon elde etmek için yetersizlik tarafından engel oldu. Daha fazla, rssp sürümleri solvating için geliştirilen teknikler tüm rssp türevleri üzerinde çalışmaz ve aynı zamanda önemli manipülasyon ve zaman genellikle protein kaybı1,2sonuçları gerektirir. Bu büyük ölçüde alan 1, 1, 1, 3, 3, 3-hexafluoroisopropanol (HFıP) hangi lifleri ve diğer sınırlı malzeme formları oluşturmak için bir çözücü olarak kullanılarak sonuçlandı. Tüm bilinen rSSp HFıP çözünür olduğu avantajı, her araştırma grubu arasında veri bütünlüğü sağlar. Dezavantajı HFıP pahalı ve sağlık endişeleri ve çevresel hususlar nedeniyle ölçeklemek için pratik olmayan bir toksik solvent olduğunu.
RSSp 'ye yeni bir yaklaşım, sert organik solvent HFıP ve seçici rSSp solvasyon için çalıştı diğer teknikler arasındaki teknolojik boşluğu köprülenmiş geliştirilmiştir. RSSp ve suyun süspansiyonları için özel ısıtmalar ve basınçların kombinasyonu uygulandı. Sonuçlar, rSSp 'nin yanı sıra yüksek protein konsantrasyonlarının% 100 solvasyonu ve geri kazanımı gibi; çeşitli malzeme formları HFIP veya diğer organik çözücüler3,4,5,6kullanılarak ulaşılamayan tüm bu formülasyonlardan mümkün olduğu belirlendi. Bu yaklaşımın amacı, daha sonra çeşitli malzeme formları üretimi için kullanılabilecek sulu bir çözelti içinde arıtılmış ve kurutulmuş rekombinant örümcek proteinlerini verimli ve kolay bir şekilde çözünsündür.
Elyaflar, Filmler, kaplamalar, yapıştırıcılar, Hidrojeller, lyogels, microspheres ve sünger malzemeleri, bu yöntemi kullanarak aynı sulu rSSp çözümünden kolayca başarılır. Bu yöntemin devam eden evriminin, sadece ek rSSp ile değil, diğer proteinler ile, yeni malzeme formları ve alternatif protein arıtma ve çözünme caddeleri yol açabilir.

<table><tbody><tr><td>Luer-Lok Uçlu 3 mL Şırınga</td><td>BD</td><td>309657</td><td>Diğer boyutta şırıngalar kullanılabilir, ancak uçları açık tutmak için luer-lok uçlarının kullanılması tavsiye edilir.</td></tr><tr><td>4 mL kültür şişesi, kauçuk kaplı kapaklı şeffaf</td><td>Wheaton 225142</td><td></td><td>Minimum uyuşturucu hacmi 1 mL, maksimum 2 mL'dir</td></tr><tr><td>8 mL kültür şişesi, kauçuk kaplı kapakla şeffaf</td><td>Wheaton</td><td>225144</td><td>Minimum uyuşturucu hacmi 2 mL'dir, maksimum 4 mL</td></tr><tr><td>% 99 İzopropil Alkol, Reaktif ACS/USP Sınıfı</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>231000099</td><td></td></tr><tr><td>Freezone 4.5 Plus</td><td>Labconco</td><td>7386030</td><td>Dondurarak Kurutucu</td></tr><tr><td>Luer Adaptörü Dişi Luer x 10-32 Dişi, Tefzel (ETFE)</td><td>IDEX</td><td>P-629</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodalga</td><td>Magic Chef</td><td>HMD1110B</td><td>120V, 60Hz AC; 1000 watt; 1.1 cu. ft. kapasite; cam döner tabla ile</td></tr><tr><td>Tek Parça Parmak Geçirmez 10-32 Koni, 1/16" OD</td><td>IDEX</td><td>F-120X</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Boru için 1/16" OD x 0.010" ID</td><td>IDEX</td><td>1531B</td><td></td></tr><tr><td>Püskürtücü: Master Airbrush</td><td>Master Airbrush</td><td>TC-60</td><td></td></tr></tbody></table>

isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek silks malzeme oluşumu

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Birçok örümcekler yedi tür Silks üretir. Örümceklerin altı, örümcekler tarafından üretildiğinde lif şeklindedir. Bu lifler su çözünmez. Örümcek Silks olağanüstü mekanik özelliklerini çoğaltmak için, örümcekler hem toprak ve yamyam olduğu gibi heterolog hosts üretilmelidir. Örümcek ipek Sentetik analogları da sulu çözümlerde çözünmez olma eğilimindedir. Böylece, rekombinant örümcek ipek araştırma büyük bir yüzdesi malzeme büyük ölçekli üretim için zararlı olan organik çözücüler güveniyor. Bizim grubun yöntemi bu rekombinant örümcek ipek su içine solvasyon zorlar. Bu proteinler bu ısı ve basınç yöntemi kullanılarak hazırlanırken, film, elyaf, sünger, hidrojel, lyogel ve yapıştırıcılar dahil olmak üzere rekombinant örümcek ipek proteinlerinin (rSSp) aynı çözeltisi ile çok çeşitli malzeme formları hazırlanabilir. Bu makalede, tek başına yazılı malzeme ve yöntemlerden daha kolay anlaşılır bir şekilde ayrılmış rSSp ve malzeme formları üretimini göstermektedir.

RSSp 'nin belirtilen çözünme yönteminden, Şekil 1' de görüldüğü gibi çeşitli malzeme formları elde edilebilir. Çözünme yöntemi, geleneksel bir mikrodalga tarafından oluşturulan ısı ve basıncı, rSSp ve suyun süspansiyonunu uygulamak için kullanılır. Kritik sıcaklıklar ve baskılar elde edildiğinde, protein çözünecek. Bu çözünen rSSp çözümünden, gerekli koşullar yedi malzeme formları için sunulmaktadır: Hidrojeller, lyogels, sünger, yapıştırıcılar, kaplamalar, F...

Burada, su çözünebilir rekombinant örümcek ipek protein çözümleri ve bu çözümlerden oluşabilir malzeme formları üretmek için bir protokol sunuyoruz.

Isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek Silks malzeme oluşumu

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Rekombinant örümcek ipek solubilizing Bu yöntem geleneksel sert organik çözücüler kullanarak mümkün değildir malzeme formları üretir. Ayrıca, süreç tahıl, suda basit bir protein çözeltisi ile sonuçlanan. Bu yöntemden yararlanılarak, oluşan veya üretilen malzemeler örümcek ipek proteinlerinin arzu edilen özelliklerini korur.Rekombinant örümcek ipekleri için bu solubilizasyon tekniği bir adım sürecinde rekombinant örümcek ipek lerin çözünürleştirilmesiiçin izin verir. Bu, protein üretmenin çok zor olduğu için bu arzu edilir, çünkü kapsamlı işleme yoluyla kaybolmazlar. Ayrıca, çözeltiler suda sadece protein olduğundan, uygulama için arzu edilirse diğer biyolojik olarak aktif bileşikler eklenebilir.Özellikle, protein yapısı fonksiyonu ilişkisi, bu sistem bir örümcek yüksek konsantrasyonda su ve proteinler kullanır nasıl bir lif yapar memetik olduğunu. Bu solubilizasyon yöntemi ve daha sonraki bir malzeme oluşumu kullanılarak, oluşan malzemeler ve bunlardan sorumlu yapılar hakkında anlayış kazanmak mümkün olmalıdır. Bunun olabileceği düşünülmektedir, biz aksi takdirde solvate bir alkali veya asidik ortam gerektirecek sentetik peptidler çözünürhale getirmek için bu tekniği kullandık.Bu peptidler için downstream uygulamalarda avantajlı olabilir. Ayrıca, sentetik olarak ifade edilen bilinen proteinlerin bir dizi çözünmez fraksiyonu sonunda eğilimindedir. Resolubilizing, ve daha sonra bu proteinlerin yeniden katlanması genellikle büyük kayıplara neden zahmetli bir süreçtir.Bu tekniği kullanarak, çözünmez proteinler için geri kazanım süreçlerinin verimliliğini artırmak mümkün olabilir. Mikrodalga ya da mikrodalga ya sızdırmaz bir şişe yerleştirmek, aşırı ısınma ve böylece şişe üzerinde basınç lama riski veren biraz yıldırıcı. Isı ve basınç uygulamak için aşamalı yaklaşımı anlamak çok önemlidir.İkinci olarak, özellikle rekombinant örümcek ipek için, tuz mevcut olan tekniğin çalışmasına izin vermez veya ne kadar tuz mevcut bağlı olarak etkili bir şekilde çalışmasına izin vermez. Tuz giderme anahtarıdır. Sabırlı ve dikkatli olun, mikrodalga zamanlarınızı ve şişeiçindeki sıcaklıkları yakından izleyin.Genellikle geleneksel yazılı malzeme ve yöntem bölümleri ile iletmek zor işletmeye hareketli parçalar bir dizi vardır, çünkü önemlidir. Yeterli çalışmayı engelleyen çözünürlük problemi olan birçok protein olduğu göz önüne alındığında, bu yöntemin geliştirmek, hatta analitik teknikler ve karakterizasyon alabilmeleri için çeşitli protein boşluklarında uygulanma potansiyeli vardır. Başlamak için, kauçuk kaplı vida kapağı ile temiz ve yeni sekiz mililitrelik otoklaveable borosilikat cam kültür şişesi seçin ve analitik bir denge üzerinde boş şişe yerleştirin.Boş şişenin kütlesini yırtın, böylece denge sıfır kütleyi okur. Belirli bir malzeme için boş şişe için istenilen lyophilized rekombinant örümcek ipek protein tozu ekleyin. Daha sonra, şişeye en az iki mililitre ultra saf su, istenilen miktarda ekleyin.Şişe kapağını kapatın ve dağınık ve homojen rekombinant örümcek ipek proteinkarışımı oluşturmak için içindekileri tempolu bir şekilde girdaplayın. Sıkıca ve güvenli bir şekilde sıkılmış olduğundan emin olmak için şişe kapağıson bir kontrol gerçekleştirin. Daha sonra, 700 ila 1500 watt güç aralığı ile geleneksel bir mikrodalga fırın için askıya rekombinant örümcek ipek protein karışımı aktarın.Mikrodalganın çalışmasına beş saniyelik patlamayla başlayın ve manuel olarak açılıp kapanarak tam güç ayarlayın. Her patlamadan sonra, kısaca kapıyı açın ve dikkatlice yerleşmeönlemek için şişe karıştırın ve askıda karışımı korumak. Bazen şişenin ve çözeltinin soğumasını bekleyin ve aşırı ısınmış çözeltinin conta değmesini önleyin.Şişenin bir kısmını içeren çözeltinin sıcaklığını ölçmek için kızılötesi termometre kullanın. Mikrodalga işlemini sıcaklık en az 130 santigrat dereceye ulaşana ve katı partiküllerin tümü tamamen çözülene kadar tekrarlayın. Daha sonra çözeltinin sıcaklığının ve şişe kapağının 100 santigrat derecenin altında soğumasını bekleyin.Bu çözelti tamamen soğutulmadan önce, bir hidrojel oluşturmak için şişeden belirli geometrilere atın. Hidrojel oluşturulduktan sonra, bir su banyosu yerleştirin ve eksi 20 santigrat derece dondurucuya aktarın. Banyo tamamen donana kadar bekleyin.Dondurulmuş hidrojel ve su banyosunu dondurucudan çıkararak ve 25 santigrat derecede eriterek sünger oluşum işlemini tamamlayın. Daha sonra, çözülmüş sudan çıkan süngeri çıkarın. Bir lyogel hazırlamak için, bir lyophilizer için dondurulmuş hidrojel örnek aktarın.24 saat sonra, son lyophilized jel malzemeyi damardan çıkarın. Rekombinant örümcek ipek proteini filmleri üretmek için, istenilen şekli bir PDMS formu üzerine şişe sıcak çözünürleştirilmiş rekombinant örümcek ipek proteini 200 mikrolitre döküm. Kuruduktan sonra, test veya tedavi için PDMS substratından soyun.Substrat kaldırılamayan bir kaplama hazırlamak için, tercih edilen substrat üzerinde bir ilk sprey kaplama gerçekleştirmek için solubilize rekombinant örümcek ipek proteinuygulamak için bir airbrush püskürtücü kullanın. Kuruduktan sonra, bir daldırma kaplama oluşturmak için solubilized rekombinant örümcek ipek protein içine kaplı substrat batırın. İstediğiniz kalınlığa ulaşmak için daldırma kaplamasını tekrarlayın.Yapıştırıcılar oluşturmak için, bir substrat üzerine çözünürre rekombinant örümcek ipek proteineklemek için bir pipet kullanın ve sonra çözeltinin üstüne ikinci bir substrat uygulayın. Parçaları sıkıca birbirine kenetleyin ve numuneleri en az 25 derece sıcaklıkta en az 16 saat fırında kurutun. Islönme lifleri oluşturmak için, 19 gauge süzülme iğnekullanın ve luer kilidi ucu ile eşmerkezli bir şırınga içine solubilize uyuşturucu çözeltisi yükleyin.Hava kabarcıklarını çıkar ve uyuşturucunun şırınganın Luer kilidi ucunda oturmasına izin verin. PEEK borunun tek parça parmak sıkı bağlantı parçalarına 16 inç dış çapı ve 32 tarak tan 10'a kadar en az 25 milimetre PEEK boru yerleştirin. 19 gauge iğneyi şırınganın Luer kilidi kadın adaptöründeki bu kurulumla değiştirin.Daha sonra, orta godets dışında nitril eldiven yerleştirin, kayma dan oluşturulacak lif tutmak için, ve motorlara zarar önlemek için. Bir pıhtılaşma banyosu olarak kullanmak için% 99 saf izopropanol ile uzun boylu net cam banyo alın. İlk streç banyoyu 80-20 izopropanol ve distile su oranıyla doldurun.İkinci streç banyoda, izopropanol ve distile su 20-80 oranı doldurun. Bilgisayarda godet streç sistemi ayarlayın. Lif kaldırma ana hızını ayarlamak için, ne kadar iyi ve hızlı bir şekilde lif oluşturan bağlı olarak, saniyede 10 ila 14 milimetre arasında bir değere godet üçlü A hız için sürgülü çubuğu ayarlayın.Godet üçlü B streç oranı nın sürgülü çubuğunu ikiye taşıyarak ilk esneme başlatın Germe banyosu nda son godet bir, orta üst godet ve streç banyo iki ilk godet için. Godet üçlü C streç oranı nın sürgülü çubuğunu streç banyo iki, son üst godet ve sarkan son godet için iki ye taşıyarak ikinci streç başlatın. Bu kurulum, pıhtılaşma banyosundan sonraki ilk godet'in ve ilk streç banyosundaki ilk godet'in aynı hızda dönmesini sağlar.Daha sonra, ipek çözeltisini özel bir spin hattı aletinin şırıngasına yükleyin. Otomatik sistemde, ipek çözeltisini izopropanol dolu cam pıhtılaşma banyosuna çıkarmak için ekstrüzyon hızını saniyede 10 milimetreye ayarlayın. Ince bir metal kanca ile banyo lifleri çekmeden önce, lif ekstrüzyon düzgün olmak için izin verin.Banyodan lif çıkarmanın PEEK boru ucu ile banyodan çıkan lif yolu arasında bir döngü oluşturduğunu doğrulayın. Godets serisi ile alınan lif Kılavuzu, lif streç banyoları batık olduğu gibi, ancak streç banyoları arasında havada kurutma, ve bir makara üzerine gitmeden önce. Bu protokolde rekombinant örümcek ipek proteininin çözünmesi ile çeşitli malzeme formları elde edilebilir.Yedi malzeme formları burada sunulmaktadır. Hidrojeller, lyogels, sünger, yapıştırıcılar, kaplamalar, filmler ve lifler. Lifler bir pıhtılaşma banyosu içine ekstrüzyon tarafından en kapsamlı işleme gerektirir, ve daha sonra seri sonrası bin streç banyolarda ham lif germe.Protein ve su çözeltilerinin nispeten yüksek sıcaklık ve basınca ısıtıldığı göz önüne alındığında, deneyimlerimiz çözeltilerin proteinin çözündolduğu noktada steril olduğudur. Bu, burada sunulan herhangi bir materyal formun hücre kültürüne alınmasını sağlar. Kesinlikle bu teknik yapıştırıcılar ve sünger malzeme de dahil olmak üzere yeni malzeme formları, keşfine yol açmıştır.Lif oluşumu bu tekniğin geliştirilmesi ile de gelişme görmüş alanlardan biri olmasına rağmen, mutlaka lif oluşumuna yönelik olmayan malzeme formları. Kapalı bir şişenin içinde ısı ve basınç üretmek doğal bir tehlike arz eder. Bu işlemleri gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman takın.

material-formation-recombinant-spider-silks-through-aqueous-solvation

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.

Black Widow Spider İpek üreten Bezler, Mikrodisseksiyon

Örümcek ipek ve üstün mekanik özellikleri ve biyokimyasal rağmen, bu malzeme geleneksel yollarla, büyük miktarlarda hasat edilemez. Burada nesil Biyomalzeme olarak örümcek ipeği üretimi ve kullanımı eğitimi araştırmacılar için önemli bir süreç olan yapay örümcek ipeği lifleri, spin etkili bir strateji tanımlamak.

Bir Laboratuvar Ölçekli Sentetik Örümcek İpek Üretimi

Örümcek ipek lifleri olağanüstü mekanik özellikler gösterir.

Electrospun Rekombinant Örümcek İpek Proteinlerin Nonwoven Ağlar dahil Hava Filtresi Cihazları

Karıştırma özellikleri ve kombine özellikleri geniş bir yelpazesi ile biyomalzemeleri oluşturmak için etkili bir yaklaşımdır. Farklı doğal ipek proteinleri arasındaki moleküler etkileşimlerin tahmin eden, ayarlanabilir mekanik dayanıklılık, elektriksel tepkinin, optik saydamlık, kimyasal işlenebilirliği, biyolojik olarak ya da bir termal stabilitesi olan yeni bir ipek-ipek proteini alaşım platformları tasarlanabilir.

Biyomedikal Uygulamalar için İpek-ipek Protein Alaşım Materyalleri Tasarlama

Bir protokol mikrosıvısal iplik ve rejenere ipek fibroin Monofilament Mikroyapı karakterizasyonu için sunulmaktadır.

Mikrosıvısal kuru-iplik ve rejenere ipek Fibroin lifleri karakterizasyonu

Bu protokol, biyomedikal ve çevresel uygulamalarda kullanılmak üzere Self-motile biyouyumlu ve çevre dostu mikro karıştırıcılar yazdırmak için reaktif inkjet baskı kullanma yeteneğini göstermektedir.

Ipek bazlı kendinden tahrikli mikro karıştırıcılar reaktif Inkjet Baskı ve Itme Analizi

Plazmid DNA, sitoplazmik proteinleri ve DNA-protein kompleksleri görselleştirme dokunarak modu için bir atomik kuvvet mikroskobu (AFM) yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem, biyokimyasal manipülasyon AFM görüntüleme örnekleri hazırlamak için alternatif yaklaşımlar içerir. Spesifik protein etkileşim bölgeleri içeren DNA yakın fizyolojik tampon koşulları görülmektedir.

Atomik Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Rekombinant DNA ve Protein Kompleksleri Görselleştirme

Sulu de iki fazlı sistemlerde hücrelerin aynı anda birden fazla kalıp popülasyonları için kullanılmıştır. Hücre desenlendirme için bu hızlı ve kolay bir yöntem dekstran ve polietilen glikol ve iki polimer çözümleri arasında var arayüzey gerilimi sulu çözeltilerinin faz ayrışması yararlanır.

Sulu İki fazlı sistemler kullanma Hücre Co-kültür desenlendirme

Biz şablon baskı ve fotolitografi, hem de microfabricated desenleri kültür hücreleri yöntemleri ile micropattern nano altın ince filmler için teknikler hakkında rapor. Buna ek olarak, malzeme ve taramalı elektron ve floresan mikroskobu teknikleri kullanılarak kültürlenmiş hücrelerin morfolojisi karakterize etmek için görüntü analiz yöntemleri açıklanmaktadır.

Hücre-malzeme Etkileşim Araştırmalar Nanogözenekli Altın Patterns mikroimalat

Gözenekli ortamı taklit eden mikroakışkan bir cihazda biyofilm oluşumunun incelenmesi için protokoller tartışılmaktadır. Mikroakışkan cihaz, bir dizi mikro sütundan oluşur ve bu cihazda Pseudomonas floresanları tarafından biyofilm oluşumu incelenir.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Öğrenin, rekombinant örümcek ipek proteinlerini suyla çözerek çeşitli malzeme formları üretme yöntemini. Bu teknik, biyoteknoloji ve malzeme bilimi alanlarında yeni uygulamalar sağlar.

Isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek Silks malzeme oluşumu

Daha fazla video keşfet