Isı ve basınç kullanarak sulu solvasyon yoluyla rekombinant örümcek Silks malzeme oluşumu

Rekombinant örümcek ipek solubilizing Bu yöntem geleneksel sert organik çözücüler kullanarak mümkün değildir malzeme formları üretir. Ayrıca, süreç tahıl, suda basit bir protein çözeltisi ile sonuçlanan. Bu yöntemden yararlanılarak, oluşan veya üretilen malzemeler örümcek ipek proteinlerinin arzu edilen özelliklerini korur.

Rekombinant örümcek ipekleri için bu solubilizasyon tekniği bir adım sürecinde rekombinant örümcek ipek lerin çözünürleştirilmesiiçin izin verir. Bu, protein üretmenin çok zor olduğu için bu arzu edilir, çünkü kapsamlı işleme yoluyla kaybolmazlar. Ayrıca, çözeltiler suda sadece protein olduğundan, uygulama için arzu edilirse diğer biyolojik olarak aktif bileşikler eklenebilir.

Özellikle, protein yapısı fonksiyonu ilişkisi, bu sistem bir örümcek yüksek konsantrasyonda su ve proteinler kullanır nasıl bir lif yapar memetik olduğunu. Bu solubilizasyon yöntemi ve daha sonraki bir malzeme oluşumu kullanılarak, oluşan malzemeler ve bunlardan sorumlu yapılar hakkında anlayış kazanmak mümkün olmalıdır. Bunun olabileceği düşünülmektedir, biz aksi takdirde solvate bir alkali veya asidik ortam gerektirecek sentetik peptidler çözünürhale getirmek için bu tekniği kullandık.

Bu peptidler için downstream uygulamalarda avantajlı olabilir. Ayrıca, sentetik olarak ifade edilen bilinen proteinlerin bir dizi çözünmez fraksiyonu sonunda eğilimindedir. Resolubilizing, ve daha sonra bu proteinlerin yeniden katlanması genellikle büyük kayıplara neden zahmetli bir süreçtir.

Bu tekniği kullanarak, çözünmez proteinler için geri kazanım süreçlerinin verimliliğini artırmak mümkün olabilir. Mikrodalga ya da mikrodalga ya sızdırmaz bir şişe yerleştirmek, aşırı ısınma ve böylece şişe üzerinde basınç lama riski veren biraz yıldırıcı. Isı ve basınç uygulamak için aşamalı yaklaşımı anlamak çok önemlidir.

İkinci olarak, özellikle rekombinant örümcek ipek için, tuz mevcut olan tekniğin çalışmasına izin vermez veya ne kadar tuz mevcut bağlı olarak etkili bir şekilde çalışmasına izin vermez. Tuz giderme anahtarıdır. Sabırlı ve dikkatli olun, mikrodalga zamanlarınızı ve şişeiçindeki sıcaklıkları yakından izleyin.

Genellikle geleneksel yazılı malzeme ve yöntem bölümleri ile iletmek zor işletmeye hareketli parçalar bir dizi vardır, çünkü önemlidir. Yeterli çalışmayı engelleyen çözünürlük problemi olan birçok protein olduğu göz önüne alındığında, bu yöntemin geliştirmek, hatta analitik teknikler ve karakterizasyon alabilmeleri için çeşitli protein boşluklarında uygulanma potansiyeli vardır. Başlamak için, kauçuk kaplı vida kapağı ile temiz ve yeni sekiz mililitrelik otoklaveable borosilikat cam kültür şişesi seçin ve analitik bir denge üzerinde boş şişe yerleştirin.

Boş şişenin kütlesini yırtın, böylece denge sıfır kütleyi okur. Belirli bir malzeme için boş şişe için istenilen lyophilized rekombinant örümcek ipek protein tozu ekleyin. Daha sonra, şişeye en az iki mililitre ultra saf su, istenilen miktarda ekleyin.

Şişe kapağını kapatın ve dağınık ve homojen rekombinant örümcek ipek proteinkarışımı oluşturmak için içindekileri tempolu bir şekilde girdaplayın. Sıkıca ve güvenli bir şekilde sıkılmış olduğundan emin olmak için şişe kapağıson bir kontrol gerçekleştirin. Daha sonra, 700 ila 1500 watt güç aralığı ile geleneksel bir mikrodalga fırın için askıya rekombinant örümcek ipek protein karışımı aktarın.

Mikrodalganın çalışmasına beş saniyelik patlamayla başlayın ve manuel olarak açılıp kapanarak tam güç ayarlayın. Her patlamadan sonra, kısaca kapıyı açın ve dikkatlice yerleşmeönlemek için şişe karıştırın ve askıda karışımı korumak. Bazen şişenin ve çözeltinin soğumasını bekleyin ve aşırı ısınmış çözeltinin conta değmesini önleyin.

Şişenin bir kısmını içeren çözeltinin sıcaklığını ölçmek için kızılötesi termometre kullanın. Mikrodalga işlemini sıcaklık en az 130 santigrat dereceye ulaşana ve katı partiküllerin tümü tamamen çözülene kadar tekrarlayın. Daha sonra çözeltinin sıcaklığının ve şişe kapağının 100 santigrat derecenin altında soğumasını bekleyin.

Bu çözelti tamamen soğutulmadan önce, bir hidrojel oluşturmak için şişeden belirli geometrilere atın. Hidrojel oluşturulduktan sonra, bir su banyosu yerleştirin ve eksi 20 santigrat derece dondurucuya aktarın. Banyo tamamen donana kadar bekleyin.

Dondurulmuş hidrojel ve su banyosunu dondurucudan çıkararak ve 25 santigrat derecede eriterek sünger oluşum işlemini tamamlayın. Daha sonra, çözülmüş sudan çıkan süngeri çıkarın. Bir lyogel hazırlamak için, bir lyophilizer için dondurulmuş hidrojel örnek aktarın.

24 saat sonra, son lyophilized jel malzemeyi damardan çıkarın. Rekombinant örümcek ipek proteini filmleri üretmek için, istenilen şekli bir PDMS formu üzerine şişe sıcak çözünürleştirilmiş rekombinant örümcek ipek proteini 200 mikrolitre döküm. Kuruduktan sonra, test veya tedavi için PDMS substratından soyun.

Substrat kaldırılamayan bir kaplama hazırlamak için, tercih edilen substrat üzerinde bir ilk sprey kaplama gerçekleştirmek için solubilize rekombinant örümcek ipek proteinuygulamak için bir airbrush püskürtücü kullanın. Kuruduktan sonra, bir daldırma kaplama oluşturmak için solubilized rekombinant örümcek ipek protein içine kaplı substrat batırın. İstediğiniz kalınlığa ulaşmak için daldırma kaplamasını tekrarlayın.

Yapıştırıcılar oluşturmak için, bir substrat üzerine çözünürre rekombinant örümcek ipek proteineklemek için bir pipet kullanın ve sonra çözeltinin üstüne ikinci bir substrat uygulayın. Parçaları sıkıca birbirine kenetleyin ve numuneleri en az 25 derece sıcaklıkta en az 16 saat fırında kurutun. Islönme lifleri oluşturmak için, 19 gauge süzülme iğnekullanın ve luer kilidi ucu ile eşmerkezli bir şırınga içine solubilize uyuşturucu çözeltisi yükleyin.

Hava kabarcıklarını çıkar ve uyuşturucunun şırınganın Luer kilidi ucunda oturmasına izin verin. PEEK borunun tek parça parmak sıkı bağlantı parçalarına 16 inç dış çapı ve 32 tarak tan 10'a kadar en az 25 milimetre PEEK boru yerleştirin. 19 gauge iğneyi şırınganın Luer kilidi kadın adaptöründeki bu kurulumla değiştirin.

Daha sonra, orta godets dışında nitril eldiven yerleştirin, kayma dan oluşturulacak lif tutmak için, ve motorlara zarar önlemek için. Bir pıhtılaşma banyosu olarak kullanmak için% 99 saf izopropanol ile uzun boylu net cam banyo alın. İlk streç banyoyu 80-20 izopropanol ve distile su oranıyla doldurun.

İkinci streç banyoda, izopropanol ve distile su 20-80 oranı doldurun. Bilgisayarda godet streç sistemi ayarlayın. Lif kaldırma ana hızını ayarlamak için, ne kadar iyi ve hızlı bir şekilde lif oluşturan bağlı olarak, saniyede 10 ila 14 milimetre arasında bir değere godet üçlü A hız için sürgülü çubuğu ayarlayın.

Godet üçlü B streç oranı nın sürgülü çubuğunu ikiye taşıyarak ilk esneme başlatın Germe banyosu nda son godet bir, orta üst godet ve streç banyo iki ilk godet için. Godet üçlü C streç oranı nın sürgülü çubuğunu streç banyo iki, son üst godet ve sarkan son godet için iki ye taşıyarak ikinci streç başlatın. Bu kurulum, pıhtılaşma banyosundan sonraki ilk godet'in ve ilk streç banyosundaki ilk godet'in aynı hızda dönmesini sağlar.

Daha sonra, ipek çözeltisini özel bir spin hattı aletinin şırıngasına yükleyin. Otomatik sistemde, ipek çözeltisini izopropanol dolu cam pıhtılaşma banyosuna çıkarmak için ekstrüzyon hızını saniyede 10 milimetreye ayarlayın. Ince bir metal kanca ile banyo lifleri çekmeden önce, lif ekstrüzyon düzgün olmak için izin verin.

Banyodan lif çıkarmanın PEEK boru ucu ile banyodan çıkan lif yolu arasında bir döngü oluşturduğunu doğrulayın. Godets serisi ile alınan lif Kılavuzu, lif streç banyoları batık olduğu gibi, ancak streç banyoları arasında havada kurutma, ve bir makara üzerine gitmeden önce. Bu protokolde rekombinant örümcek ipek proteininin çözünmesi ile çeşitli malzeme formları elde edilebilir.

Yedi malzeme formları burada sunulmaktadır. Hidrojeller, lyogels, sünger, yapıştırıcılar, kaplamalar, filmler ve lifler. Lifler bir pıhtılaşma banyosu içine ekstrüzyon tarafından en kapsamlı işleme gerektirir, ve daha sonra seri sonrası bin streç banyolarda ham lif germe.

Protein ve su çözeltilerinin nispeten yüksek sıcaklık ve basınca ısıtıldığı göz önüne alındığında, deneyimlerimiz çözeltilerin proteinin çözündolduğu noktada steril olduğudur. Bu, burada sunulan herhangi bir materyal formun hücre kültürüne alınmasını sağlar. Kesinlikle bu teknik yapıştırıcılar ve sünger malzeme de dahil olmak üzere yeni malzeme formları, keşfine yol açmıştır.

Lif oluşumu bu tekniğin geliştirilmesi ile de gelişme görmüş alanlardan biri olmasına rağmen, mutlaka lif oluşumuna yönelik olmayan malzeme formları. Kapalı bir şişenin içinde ısı ve basınç üretmek doğal bir tehlike arz eder. Bu işlemleri gerçekleştirirken her zaman kişisel koruyucu ekipman takın.