Name: Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Öğrenin, Duchenne kas distrofili farelerde kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için normal myojenik progenitör hücrelerden elde edilen ekzomların arıtılması ve kalp içi nakli yöntemlerini. Bu teknik distrosin ifadesini artırarak kalp fonksiyonunu destekler.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tang kısmen Amerikan Kalp Derneği tarafından desteklenen: GRNT31430008, NIH AR070029, NIH HL086555, NIH HL134354.

Hayvanlar onaylı protokolleri ve hayvan refahı düzenlemeleri kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Gürcistan tıp Koleji Augusta Üniversitesi'nde ele.
1. izolasyon ve MPC kaynaklı Exosomes arıtma
<ol><li>Tohum 5 x 10 ile 20 mL tam Dulbecco'nın bir 15 cm hücre kültür yemek6 C2C12 hücrelerde % 10 fetal sığır serum (FBS), 100 U/mL penisilin G ve 100 μg/mL streptomisin içeren kartal orta (DMEM) değiştiren. 37 ° C ve % 5 CO2kuluçkaya.</li>
	<li>Ya tükenmiş orta FBS ultrasantrifüj 100.000 x g , sallanan bir kova rotor kullanarak 4 ° C'de 18 h için hazırlayın. Pelet atmak.</li>
	<li>Ne zaman monolayer hücrelerin % 80 izdiham kültür tabağına ulaşmak tam DMEM ya tükenmiş orta ile değiştirin.</li>
	<li>Hücre kültür çanak üç kez olmak üzere toplam 48 her h süpernatant toplamak için transfer pipet kullanın. 50 mL santrifüj tüpleri ve vasıl 150 x g kalan hücreleri kaldırmak 10 dk santrifüj süpernatant toplamak.</li>
	<li>Süpernatant hücre artıkları ortadan kaldırmak için bir 0,22 mikron filtre ile filtre. Ultracentrifuge Ultra net tüp hareketli kova rotor de 100.000 x g 120 dk 4 ° C'de exosomes çökelti kullanarak filtre uygulanmış orta.</li>
	<li>Ya içeren Pelet fosfat tamponlu tuz (PBS) resuspend ve tüm Ultra net tüp PBS ile doldurun. 100.000 x g de bu süspansiyon ultrasantrifüj 120 dk 4 ° C'de bulaşıcı proteinlerin ortadan kaldırmak için gerçekleştirir.</li>
	<li>Süpernatant atın ve eksozom Pelet 100 µL PBS resuspend. -80 ° c ileride kullanmak üzere saklayın.</li>
	<li>Elektron mikroskobu analiz için 3 µL exosomal süspansiyon, oda sıcaklığında 5 min için 200 mesh formvar kaplı bakır elektron mikroskobu kılavuz yerleştirin. 23boyama standart uranyl asetat ile devam edin. Yarı kuru kılavuz transmisyon elektron mikroskobu ile inceleyin.</li>
</ol>2. Intramyocardial ya teslim
Not: Her grupta altı fareler kullanılır.
<ol><li>100 mg/kg BW 10 mg/kg ile BW xylazine kombine ketamin mayi (IP) enjeksiyonlu DBA/2J-DMDMDX fareler (erkek; vücut ağırlığı (BW) > 18 g yaş > 10 ay) anestezi ve anestezi derinliği ayak çimdik tarafından onaylayın.</li>
	<li>Her fare cerrahi bir platformda sırtüstü pozisyonda her bacak güvenli ve üst çene tutmak için yatay olarak dişleri aşağıda 3-0 dikiş yerleştirmek için bant kullanarak düzeltebilirsiniz.</li>
	<li>Kürk deri kaldırmak için fare göğüs sol tarafına depilatory krem uygulayın.</li>
	<li>Endotrakeal entübasyon 24 G kateter kullanarak ağız boşluğu üzerinden gerçekleştirmek ve fare ile oda havası kemirgen solunum kullanarak 195 nefes/dk hızında havalandırmak ( Tablo reçetesigörmek).</li>
	<li>Cilt %75 alkol ve % 10 povidone iyot ile dezenfekte.</li>
	<li>Bir 10\u201215 mm oblik insizyon sol sternal kenarından sol koltuk altı için yapmak, büyük pektoralis pektoralis küçük makas tarafından kesip, sonra sol Torakotomi dördüncü interkostal uzayda olun. 10 mm genişliğine göğüs boşluğuna yayılmaya Retraktörü bantları yavaşça yerleştirin. Sol akciğer hasarı önlemek için dikkat ediniz.</li>
	<li>Kalp zarını kaldırmak için onları ayır ve kalp ortaya çıkarmak için Retraktörü ipuçları yer onları iki düz cımbız kullanın. MPC-Exo enjekte (30 µL PBS içinde 50 μg) veya 30 μL PBS (kontrol) olarak intramyocardially bir sitede 31 G insülin iğne kullanarak sol ventrikül anterior duvar içine.</li>
	<li>6-0 naylon dikiş göğüs boşluğuna, pektoralis kas ve cilt sırayla kapatmak için kullanın.</li>
	<li>Fareler kurtarmak. Ritmik, spontan solunum mevcut olduğunda, fareler havalandırma ve tüpü çıkarın. Gözlemlemek ve fareler koşulu ameliyattan sonra kaydedin.</li>
</ol>3. Ekokardiyografi
Not: Deneysel gruplarına kör bir tek gözlemci Ekokardiyografi ve veri analizi yapar.
<ol><li>İki gün sonra PBS/eksozom nakli, anestezi 1\u20122% isoflurane ile fareler.</li>
	<li>Bant kullanarak sırtüstü pozisyonda bir fare düzeltmek ve sol göğüs bölgesinde Önceden ısıtılmış akustik jel uygulayın.</li>
	<li>
Sol ventrikül fonksiyonları Ekokardiyografi tarafından yukarıda açıklanan16,24değerlendirmek.
	<ol>
<li>İki boyutlu (B modu) olarak sol ventrikül (LV) parasternal uzun ekseni görünümünü elde etmek ve sonra Papiller kas düzeyinde bir LV kısa eksen görünümü elde etmek için ultrason sonda 90 ° döndürün.</li>
		<li>Kayıt M-modu Ekokardiyografik olarak görüntüler ve ölçü sol ventrikül son diyastolik çap (LVEDD), sol ventrikül sistolik son ses (LVESD), sol ventrikül diyastolik son ses (LVEDV) ve sol ventrikül sistolik son ses (LVESV). Not: Kesirli kısalma (FS %) = [(LVEDD − LVESD) / LVEDD] x 100 ve Sol Ventrikül Ejeksiyon Fraksiyonu (VEF %) = [(LVEDV − LVESV) / LVEDV] x 100.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. immünhistokimya
<ol><li>İki gün sonra PBS/eksozom nakli, fareler (bkz. Adım 2.1) anestezi ve göğüs kemiği göğüs boşluğuna ortaya çıkarmak için kesmek. İnferior vena kava teşrih ve sol ventrikül tepe 3 mL 5 mL şırınga bağlı 25 G iğne ile bir kelebek kateter kullanarak, oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde 3 mL ardından PBS ile kalbine sıvı.</li>
	<li>Sabit kalpler parafin embed ve 5 mikron kalınlığında bölümlere kesti.</li>
	<li>Ksilen içindeki slaytları deparaffinize ve aşağıdaki sırayla etanol çözümlerinde rehydrate: % 100 Ksilen (3 dk), % 100 Ksilen (3 dk), % 100 etanol (1 dk), % 100 etanol (1 dk), % 95 etanol (1 dk), % 80'i etanol (1 dk), H2O (1dk).</li>
	<li>8 dakika oda sıcaklığında %4 paraformaldehyde ile doku bölümleri düzeltmek.</li>
	<li>Sodyum sitrat (0.01 M, pH 6.0) içindeki slaytları bırakın ve antijen alma bir antijen retriever kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.</li>
	<li>Bölümleri olarak % 1 polietilen glikol tert-octylphenyl eter PBS içinde oda sıcaklığında 1 h için permeabilize.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için PBS içinde % 5 keçi serum bölümlerle engelleyin.</li>
	<li>Bölümleri ile seyreltilmiş birincil antikoru (anti-dystrophin antikor) PBS (1: 100), gecede 4 ° C'de kuluçkaya sonra üç kez PBS ile 5 dakika yıkayın.</li>
	<li>Bölümleri (Alexa Fluor 488 keçi Anti-tavşan IgG Birleşik) seyreltilmiş ikincil antikor PBS (1: 400) içinde oda sıcaklığında 45 dk ile kuluçkaya.</li>
	<li>Denetim autofluorescence bir autofluorescence Şoklama Kiti ( Tablo reçetesigörmek) kullanma.</li>
	<li>Kullanım montaj orta DAPI içeren (slaytları bağlamaya Malzemeler tablobkz:).</li>
	<li>Slaytları confocal mikroskop altında gözlemlemek.</li>
</ol>

<ol><li>Yiu, E. M., Kornberg, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Paediatrics+and+Child+Health%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy.</a> Journal of Paediatrics and Child Health. 51 (8), 759-764 (2015).</li>
<li>Nudel, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy+gene+product+is+not+identical+in+muscle+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy gene product is not identical in muscle and brain.</a> Nature. 337 (6202), 76-78 (1989).</li>
<li>Rae, M. G., O'Malley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cognitive+dysfunction+in+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+a+possible+role+for+neuromodulatory+immune+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Cognitive dysfunction in Duchenne muscular dystrophy: a possible role for neuromodulatory immune molecules.</a> Journal of Neurophysiology. 116 (3), 1304-1315 (2016).</li>
<li>Mah, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+review+and+meta-analysis+on+the+epidemiology+of+Duchenne+and+Becker+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">A systematic review and meta-analysis on the epidemiology of Duchenne and Becker muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (6), 482-491 (2014).</li>
<li>D'Amario, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+current+approach+to+heart+failure+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Heart%22%5BJournal%5D)">A current approach to heart failure in Duchenne muscular dystrophy.</a> Heart. 103 (22), 1770-1779 (2017).</li>
<li>Koeks, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Outcomes+in+Duchenne+Muscular+Dystrophy%3A+A+Study+of+5345+Patients+from+the+TREAT-NMD+DMD+Global+Database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuromuscular+Diseases%22%5BJournal%5D)">Clinical Outcomes in Duchenne Muscular Dystrophy: A Study of 5345 Patients from the TREAT-NMD DMD Global Database.</a> Journal of Neuromuscular Diseases. 4 (4), 293-306 (2017).</li>
<li>Kamdar, F., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin-Deficient+Cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Dystrophin-Deficient Cardiomyopathy.</a> Journal of the American College of Cardiology. 67 (21), 2533-2546 (2016).</li>
<li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+Therapy+for+Cardiomyopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Regenerative Therapy for Cardiomyopathies.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li>
<li>Fayssoil, A., Nardi, O., Orlikowski, D., Annane, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiomyopathy+in+Duchenne+muscular+dystrophy%3A+pathogenesis+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Failure+Reviews%22%5BJournal%5D)">Cardiomyopathy in Duchenne muscular dystrophy: pathogenesis and therapeutics.</a> Heart Failure Reviews. 15 (1), 103-107 (2010).</li>
<li>Hagan, M., Ashraf, M., Kim, I. M., Weintraub, N. L., Tang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+regeneration+of+dystrophic+muscle+using+autologous+iPSC-derived+progenitors+with+CRISPR-Cas9+mediated+precise+correction%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+Hypotheses%22%5BJournal%5D)">Effective regeneration of dystrophic muscle using autologous iPSC-derived progenitors with CRISPR-Cas9 mediated precise correction.</a> Medical Hypotheses. 110, 97-100 (2018).</li>
<li>Quinlan, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+mdx+mouse+cardiomyopathy%3A+physiological+and+morphological+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Evolution of the mdx mouse cardiomyopathy: physiological and morphological findings.</a> Neuromuscular Disorders. 14 (8-9), 491-496 (2004).</li>
<li>Siemionow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+Dystrophin+Expressing+Chimeric+Cells+of+Myoblast+Origin+as+a+Novel+Stem+Cell+Based+Therapy+for+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Creation of Dystrophin Expressing Chimeric Cells of Myoblast Origin as a Novel Stem Cell Based Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 14 (2), 189-199 (2018).</li>
<li>Sienkiewicz, D., Kulak, W., Okurowska-Zawada, B., Paszko-Patej, G., Kawnik, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duchenne+muscular+dystrophy%3A+current+cell+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Neurological+Disorders%22%5BJournal%5D)">Duchenne muscular dystrophy: current cell therapies.</a> Therapeutic Advances in Neurological Disorders. 8 (4), 166-177 (2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+engraftment+of+myogenic+progenitors+from+adipose-derived+stem+cells+and+muscle+regeneration+in+dystrophic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Long-term engraftment of myogenic progenitors from adipose-derived stem cells and muscle regeneration in dystrophic mice.</a> Human Molecular Genetics. 24 (21), 6029-6040 (2015).</li>
<li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+for+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes for Angiogenesis.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 429-437 (2018).</li>
<li>Ju, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+Cardiac+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Promotes+Repair+in+Ischemic+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantation of Cardiac Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Promotes Repair in Ischemic Myocardium.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 11 (5), 420-428 (2018).</li>
<li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suxiao+Jiuxin+pill+promotes+exosome+secretion+from+mouse+cardiac+mesenchymal+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Suxiao Jiuxin pill promotes exosome secretion from mouse cardiac mesenchymal stem cells in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 569-578 (2018).</li>
<li>Ruan, X. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+from+Suxiao+Jiuxin+pill-treated+cardiac+mesenchymal+stem+cells+decrease+H3K27+demethylase+UTX+expression+in+mouse+cardiomyocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Exosomes from Suxiao Jiuxin pill-treated cardiac mesenchymal stem cells decrease H3K27 demethylase UTX expression in mouse cardiomyocytes in vitro.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 579-586 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, Y., Fan, G. C., Duan, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+as+novel+biomarkers+and+pharmaceutic+targets+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmacologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles as novel biomarkers and pharmaceutic targets of diseases.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 39 (4), 499-500 (2018).</li>
<li>Chen, Y., Tang, Y., Long, W., Zhang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell-Released+Microvesicles+and+Exosomes+as+Novel+Biomarkers+and+Treatments+of+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+International%22%5BJournal%5D)">Stem Cell-Released Microvesicles and Exosomes as Novel Biomarkers and Treatments of Diseases.</a> Stem Cells International. 2016, 2417268(2016).</li>
<li>Murphy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+extracellular+vesicles+in+musculoskeletal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Emerging role of extracellular vesicles in musculoskeletal diseases.</a> Molecular Aspects of Medicine. 60, 123-128 (2018).</li>
<li>Su, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Derived+Dystrophin+from+Allograft+Myogenic+Progenitors+Improves+Cardiac+Function+in+Duchenne+Muscular+Dystrophic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Exosome-Derived Dystrophin from Allograft Myogenic Progenitors Improves Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. , (2018).</li>
<li>Hu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-mediated+shuttling+of+microRNA-29+regulates+HIV+Tat+and+morphine-mediated+neuronal+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Exosome-mediated shuttling of microRNA-29 regulates HIV Tat and morphine-mediated neuronal dysfunction.</a> Cell Death & Disease. 3, 381(2012).</li>
<li>Bayoumi, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+carvedilol-responsive+microRNA%2C+miR-125b-5p+protects+the+heart+from+acute+myocardial+infarction+by+repressing+pro-apoptotic+bak1+and+klf13+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">A carvedilol-responsive microRNA, miR-125b-5p protects the heart from acute myocardial infarction by repressing pro-apoptotic bak1 and klf13 in cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 114, 72-82 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%2Fmicrovesicles+from+induced+pluripotent+stem+cells+deliver+cardioprotective+miRNAs+and+prevent+cardiomyocyte+apoptosis+in+the+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium.</a> International Journal of Cardiology. 192, 61-69 (2015).</li>
<li>Cheruvanky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isolation+of+urinary+exosomal+biomarkers+using+a+nanomembrane+ultrafiltration+concentrator%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Renal+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid isolation of urinary exosomal biomarkers using a nanomembrane ultrafiltration concentrator.</a> American Journal of Physiology-Renal Physiology. 292 (5), 1657-1661 (2007).</li>
<li>Oksvold, M. P., Neurauter, A., Pedersen, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+bead-based+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Magnetic bead-based isolation of exosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 1218, 465-481 (2015).</li>
<li>Pedersen, K. W., Kierulf, B., Neurauter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+Generic+Isolation+of+Extracellular+Vesicles+with+Magnetic+Beads%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Specific and Generic Isolation of Extracellular Vesicles with Magnetic Beads.</a> Methods in Molecular Biology. 1660, 65-87 (2017).</li>
<li>Teng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Exosomes+Improve+the+Microenvironment+of+Infarcted+Myocardium+Contributing+to+Angiogenesis+and+Anti-Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomes Improve the Microenvironment of Infarcted Myocardium Contributing to Angiogenesis and Anti-Inflammation.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 37 (6), 2415-2424 (2015).</li>
<li>Aminzadeh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome-Mediated+Benefits+of+Cell+Therapy+in+Mouse+and+Human+Models+of+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Exosome-Mediated Benefits of Cell Therapy in Mouse and Human Models of Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Stem Cell Reports. 10 (3), 942-955 (2018).</li>
</ol>

Tüm yazarlar bildirir hiçbir çıkar çatışmaları zorundalar.

Saf exosomes izole yöntemi exosomes işlev eğitim için esastır. Bir ortak teknikleri eksozom yalıtım için polietilen aracılı glikoller (mandal) yağış17,18,25' tir. Exosomes olabilir mandal içinde çöktürülmüş ve düşük hızlı Santrifüjü tarafından pelleted. PEG aracılı arıtma çok uygun, düşük maliyetli, Gelişmiş ekipman gerek değil, ama orada exosomes saflığı hakkında endişe beri diğer lipoproteinler birlikte çöktürülmüş ve kaldırıl...

Duchenne kas distrofisi (DMD) bir mutasyon DMD gen ve fonksiyonel dystrophin1kaybı nedeniyle bir X'e bağlı resesif, progressive nöromüsküler hastalıktır. Dystrophin öncelikle kas iskelet ve Miyokardiyum ifade edilir ve daha az düz kas, endokrin bezlerin ve nöronlar2,3' te ifade edilir. DMD 3.500-5000 yeni doğan çocuklar dünya çapında4,5başına bir bir insidansı ile Muskuler Distrofi en yaygın türüdür. Bireyler genellikle ilerleyici kas nekrozu, erken ergenlik ve ölüm nedeniyle kalp yetmezliği ve solunum yetmezliği6hayatlarının ikinci-üçüncü yıllarda tarafından bağımsız yürüme kaybı gelişir.
Dilate kardiyomiyopati, aritmi ve konjestif kalp yetmezliği DMD7,8ortak kardiyovasküler tutulum vardır. Hastalık tedavi edilemez, destekleyici tedavi semptomları veya kalp yetmezliği ilerlemesini geciktirmek, ama kalp fonksiyonu9,10artırmak çok zordur.
DMD hastaları, kas distrofisi X'e benzer (MDX) fare eksik dystrophin protein ve mevcut kardiyomiyopati11belirtileri ve bu nedenle ilişkili DMD kardiyomiyopati araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Dystrophin etkilenen kaslarda geri yükleyebilmek için Allojeneik Kök hücre tedavisi DMD12,13,14için etkili bir tedavi olduğu ispatlanmıştır. Exosomes, 30-150 nm membran veziküller çeşitli hücre tiplerinin tarafından salgılanan mesajcı RNA (mRNA) ve kodlamayan RNA'ların15,16,17 gibi genetik malzeme taşıma yoluyla hücre hücre iletişim önemli bir rol oynamaktadır ,18,19,20,21.
Bizim önceki çalışmalar myogenic progenitör hücrelerin (MPC), C2C12 hücre kültürünü gibi türetilmiş exosomes dystrophin aktarabilirsiniz göstermiştir bu allojeneik teslimini gösteren mRNA doğrudan kalp enjeksiyon22sonra ana bilgisayar cardiomyocytes için MPC kaynaklı exosomes (MPC-Exo) geçici DMD gen ekspresyonu MDX farelerde geri yükleyebilirsiniz. Bu makale MPC-Exo arıtma ve nakli teknikleri üzerinde duruluyor.

<table><tbody><tr><td>0.22 &mu; m Filter</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-004</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Hücre Kültürü Kabı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>157150</td><td></td></tr><tr><td>24 G kateter</td><td>TERUMO</td><td>SR-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>31 G insülin iğnesi</td><td>BD</td><td>328291</td><td></td></tr><tr><td>%4 paraformaldehit&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>6-0 sütür</td><td>Pro NDC P420697</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 keçi anti-tavşan IgG Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik Antimikotik</td><td>Çözelti Corning&nbsp;</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Distrofin antikoru</td><td>Abcam</td><td>ab15277</td><td></td></tr><tr><td>Antijen geri alıcısı ve nbsp;</td><td>Aptum Biologics</td><td>R2100-US</td><td>Antijen kurtarma</td></tr><tr><td>Otofloresan Söndürme Kiti&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>SP-8400</td><td></td></tr><tr><td>C2C12 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Unico</td><td>C8606</td><td></td></tr><tr><td>Change-A-Tip Yüksek Sıcaklık Koterleri</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>HIT</td><td></td></tr><tr><td>Konfokal mikroskopi</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 780 Dik Konfokal</td><td></td></tr><tr><td>DBA/2J-mdx fareler</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>013141</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning&nbsp;</td><td>10-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Corning&nbsp;</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>Keçi serumu&nbsp;</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>191356</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veteriner</td><td>07-893-1389</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Henry Schein</td><td>056344</td><td></td></tr><tr><td>DAPI ile Montaj Ortamı&nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1500</td><td></td></tr><tr><td>Fare Ekartör Seti</td><td>Kent Scientific</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>Polietilen glikol tert-oktilfenil eter</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>Kemirgen ventilatörü</td><td>Harvard Aparatı</td><td>55-7066</td><td></td></tr><tr><td>SW-28 Ti rotor</td><td>Beckman</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Görüntüleme Platformu</td><td>FUJIFILM VisualSonics</td><td>Vevo 2100</td><td>Ultrason Sistemi&nbsp;</td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>365672</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Tüpler</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin (XylaMed)</td><td>Bimeda-MTC Hayvan Sağlığı A.Ş.</td><td>1XYL003 8XYL006</td><td></td></tr></tbody></table>

arıtma ve myogenic progenitör hücre nakli exosomes duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen

Purification and Transplantation of Myogenic Progenitor Cell Derived Exosomes to Improve Cardiac Function in Duchenne Muscular Dystrophic Mice

Duchene müsküler distrofisi (DMD) fonksiyonel dystrophin protein eksikliğinden kaynaklanan bir X'e bağlı resesif genetik bir hastalıktır. Hastalık tedavi edilemez ve hastalık ilerledikçe hasta dilate kardiyomiyopati, aritmi ve konjestif kalp yetmezliği belirtileri gelişir. DMDMDX mutant fare dystrophin ifade edemediği ve DMD fare modeli olarak yaygın olarak kullanılır. Bizim son çalışmada, biz o intramyocardial enjeksiyon geniş türü (WT) gözlenen-geri geçici Miyokardiyum DMDMDX mutant farelerin dystrophin ifade myogenic progenitör hücre kaynaklı exosomes (MPC-Exo) hangi ilişkili ima kardiyak fonksiyon geçici bir iyileşme ile WT-MPC-Exo DMD kardiyak semptomlarını kontrol etmek için bir seçenek sağlar. MPC-Exo arıtma ve DMDMDX mutant farelerin kalpleri içine nakli tekniği bu makalede.

İzole edip exosomes C2C12 hücrelerden arıtma için bir akış şeması şekil 1içindeAgösterilir. Exosomes varlığını doğrulamak için transmisyon elektron mikroskobu çözümleme yapılır. Transmisyon elektron mikroskobu görüntüsü (şekil 1B) elde edilen C2C12 exosomes parlak ve yuvarlak şekil veziküller morfolojisi gösterir. Western blot analizi doğruladı eksozom işaretleri, CD63 ve TSG101 de dahil olmak üzere varlığı (<strong class="xfig"...

Burada, geçici exosomes normal myogenic atası hücrelerden türetilmiş dikim tarafından Duchenne kas distrofisi farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için bir protokol mevcut.

Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen

Duchene Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked recessive genetic disease caused by a lack of functional dystrophin protein. The disease cannot be cured, ...

Bu protokol, duchenne'nin kas distrofisi farelerinde normal miyojenik progenitör hücrelerinden elde edilen ekson nakli ile kardiyak fonksiyonu geçici olarak iyileştirme yöntemini sunar. Ekzozomal transplantasyon, dmd farelerde kalp fonksiyonlarını iyileştirebilir ve alıcı kalplerde distrofi ekspresyonunun artması yla ilişkili olarak. Ekson izolasyon, saflaştırma ve intramiyokardiyal transplantasyon için uygun yöntem, Duchenne kas distrofisi olan fareleriçin kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için ekson transplantasyonunun başarısına katkıda bulunur.MPC kaynaklı ekzozom tedavisi ekzozozom aracılı normal distrofin mRNA transferi ile iskelet kası fonksiyonlarını artırabilir. Bu video ekzozom arınma, intramiyokardiyal ekzozom doğum ve ekokardiyografi sonrası transplantasyon için kritik teknikleri göstermektedir. Ekokardiyografi gösterisi, laboratuarımızdan teknisyen Yan Shen tarafından yapılacak.Bu prosedürü başlatmak için, tohum beş milyon C2C12 hücreleri 15 santimetre kültür çanak içine 20 mililitre tam DMEM içeren 10% FBS ve antibiyotik. %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yat. Daha sonra, 100, 000 kez G ve dört derece Santigrat derece exozosome-tükenmiş orta hazırlamak için 18 saat boyunca FBS ultracentrifuge için bir sallanan kova rotor kullanın.Pelet atın ve supernatant toplamak. Tek katmanlı hücreler kültür çanasında %80 birleştiğinde, tam DMEM'i ekzozom tükenmiş ortamla değiştirin. Her 48 saatte bir hücre kültürü çanağı süpernatant toplamak için bir transfer pipet kullanın.Kalan hücreleri çıkarmak için 150 kez G tüpleri on dakika santrifüj. Herhangi bir hücre enkazını ortadan kaldırmak ve filtrelenmiş ortamı ultra net tüplere aktarmak için süpernatant'ı 0,22 mikrometre filtreden filtreleyin. Daha sonra, 100, 00 kez G ve 4 derece Santigrat 120 dakika ekzozomları çökeltmek için tüpler ultracentrifuge için bir salıncak kova rotor kullanın.PBS'deki ekzozom içeren peleti yeniden askıya alın ve ultra berrak tüpün tamamını PBS ile doldurun. Ultracentrifuge bu süspansiyon 100, 00 kez G ve 4 derece santigrat 120 dakika kontamine proteinleri ortadan kaldırmak için. Supernatant atın ve PBS 100 mikrolitre ekzozom pelet resuspend.İleride kullanılmak üzere eksi 80 santigrat derecede saklayın. İlk olarak, her bir ekstremite bant ile güvence altına alarak cerrahi bir platform üzerinde supine pozisyonda her anestezili fare düzeltmek. Üst çeneyi yerinde tutmak için üst dişlerin altına yatay olarak 3-0 dikiş yerleştirin.Daha sonra, köknarı deriden çıkarmak için farenin göğsünün sol tarafına tüy dökücü krem uygulayın. 24 gauge kateter kullanarak, oral kavite üzerinden endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. Ve dakikada 195 nefes hızında oda havası ile fareyi havalandırmak için bir kemirgen vantilatör kullanın.% 70 alkol ve% 10 povison iyot ile cildi dezenfekte. Sonra sol sternal kenarından sol koltuk altı için 10 ila 15 milimetre lik oblik kesi yapın. Pektoralis majör ve pektoralis minör kesmek için makas kullanın.Ve dördüncü kıyılar arası uzayda sol torakotami yapın. Torasik boşluğu sol akciğere zarar vermemeye özen tayarak 10 milimetre genişliğe yaymak için retraktör bantlarını yavaşça takın. Bundan sonra, perikard kaldırmak için iki düz cımbız kullanın.Onları ayırın ve kalbi ortaya çıkarmak için retractor ipuçları arkasına yerleştirin. MPC-Exo veya PBS intramiyokial inmiyokardial bir sitede sol ventrikül ön duvarına enjekte etmek için 31 gauge insülin iğnekullanın. Daha sonra, torasik boşluğu kapatmak için 6-0 naylon dikişler kullanın, pektoralis kasları, ve cilt, sırayla.PBS ekzozom naklinden iki gün sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi fareleri anestezi edin. Bir fareyi supine pozisyonunda düzeltmek ve sol göğüs bölgesine önceden ısıtılmış akustik jel uygulamak için bant kullanın. Daha sonra, sol ventrikül fonksiyonunu değerlendirmek için ekokardiyografi kullanın.İki boyutlu sol ventrikül parasternal uzun eksen görünümü elde ve sonra papiller kas düzeyinde bir sol ventrikül kısa eksen görünümü elde etmek için ultrason prob 90 derece döndürmek. Bundan sonra, M-modu ekokardiyografik görüntüleri kaydedin ve sol ventrikül son diyastolik çapı ölçmek, sol ventrikül end-sistolik hacim, sol ventrikül son diyastolik hacim, ve sol ventrikül sonu-sistolik hacmi. Farelerin kalp hızı kardiyak ölçüm fonksiyonu için en az 400 bpm kontrol edilmelidir.Ekzozomlar C2C12 hücrelerinden izole edilip saflaştırıldıktan sonra iletim elektron mikroskobu analizi ile varlığı doğrulanır. İletim elektron mikroskobu görüntüsü C2C12 türetilmiş ekzozomların parlak ve yuvarlak şekilli veziküllerinin morfolojisini gösterir. Batı leke analizi CD63 ve Tsg101 dahil olmak üzere ekzozom belirteçlerinin varlığını doğrular.Mdx farelerin sol ventrikülünün ön duvarına intramiyokardiyal enjeksiyon dan sonra yarı saydam ödem bölgesi gözlenir ve bu da miyokardiyuma enjeksiyonun başarılı olduğunu gösterir. Daha sonra distropofin için immünoresan boyama, kardiyak MPC-Exo doğumun mdx kalplerde distrofin-protein ekspresyonunu geri getirip getirmediğini belirlemek için yapılır. Kardiyomiyositlerin bazılarında membran lokalizasyonu ile distrofin ekspresyonunun kısmi restorasyonu gözlenmektedir.MPC-Exo transplasyonunun mdx farelerde kardiyak fonksiyonu iyileştirip iyileştirmediğini belirlemek için intramiyokal doğumdan iki gün sonra ekokardiyografi ile kardiyak fonksiyon ölçülür. MPC-Exo tedavisinin PBS ile karşılaştırıldığında iç duvar hareketini geliştirdiği görülür ve bu da MdX farelerde MPC-Exo transplantasyonunun kardiyak fonksiyonu iyileştirdiğini düşündürmektedir. Yaklaşık 20 derece ucu ile 31 gauge insülin iğnesi kullanarak miyokardiyum içine en ekzozomların teslim ivedilikle başarı için önemlidir ve kardiyomiyosit barındırmak için enjekte ekzozomların maruz kalma maksimize eder.İşlemden sonra, kardiyak MPC kaynaklı ekzozom doğumun distrofin-protein ekspresyonunu geri yükettiğini belirten immünofloresan boyama ile MPC türetilmiş ekzozom enjeksiyonundan sonra distrofin ekspresyonu saptanabilir. Bu teknik, DNA, mRNA, lncRNA veya mikroRNA'lar gibi ekzozom taşıyan terapötik genetik malzemelerle kardiyomiyopati tedavisinin önünü açacaktır.

purification-transplantation-myogenic-progenitor-cell-derived

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) türevi miyojenik progenitörler, kas distrofilerini tedavi etmek için hücre tedavisi stratejileri için adaylar vaat ediyor. Bu protokol, akut ve kronik kas yenilenmesinin fare modellerinde iPSC türevi mezoangioblastların (bir tür kas progenitörleri) engraftasyonunu ve farklılaşmasını değerlendirmek için gereken transplantasyon ve fonksiyonel ölçümleri açıklar.

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Hareketsiz uydu hücrelerin saf nüfusun izolasyonu ve kültürü, kas kök hücre topluluğu, kas kök hücre biyolojisi ve rejenerasyon, hem de kas distrofisi ve diğer dejeneratif hastalıklarda tedavileri için kök hücre nakli anlaşılması için gereklidir.

Kas Uydu Hücreleri İzolasyon, Kültür ve Transplantasyon

Bu protokol, kas distrofisi hastalarından idrardan türetilmiş hücrelerin izolasyonu için ayrıntılı prosedürler gerektirir; Sendai virüsü transdüksiyonu yoluyla verimli ve hızlı yeniden programlamaları.

Musküler Distrofi Hastalarda gelen uyarılmış pluripotent kök hücrelerin oluşturulması: İdrar Türetilmiş Hücre Verimli Entegrasyonu-ücretsiz yeniden programlanması

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

Burada vivo içinde kalp gen rekombinant Adeno-Associated virüs (rAAV) kullanarak farelerde düzenleme taşımak için detaylı bir protokol sağlamak-CRISPR teslimini aracılı. Bu iletişim kuralı distrofik kardiyomiyopati Duchenne kas distrofisi tedavisinde umut verici bir tedavi stratejisi teklifler ve kardiyak özgü nakavt postnatal farelerde oluşturmak için kullanılabilir.

Virüs-aracılı teslim CRISPR kardiyak Gene farelerde düzenleme için Adeno ilişkili

Burada, Dmdmdx fare kaynaklı deri fibroblastlarından iPSC'de distrofin ekspresyonunu geri yüklemek ve Tet-on MyoD aktivasyon sistemini kullanarak iPSC'leri doğrudan miyojenik progenitor hücrelerine (MPC) ayırmak için Cas9 tabanlı ekson23 silme protokolü salıyoruz.

iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi

Karmaşık insan hastalıkları geleneksel laboratuvar modeli sistemlerinde modellemek zor olabilir. Burada, insan iskelet kası biyopsilerinin immünyonfik farelere nakli yoluyla insan kas hastalığını modellemek için cerrahi bir yaklaşım tanımlıyoruz.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Bu makalede, distropin mRNA ve protein düzeylerinin ekson atlama dan sonra restorasyon değerlendirmek için MYOD1-dönüştürülmüş idrar türetilmiş hücreleri kullanarak Duchenne musküler distrofi kasının verimli modelleme için ayrıntılı bir protokol açıklanır.

İnsan İdrar Türemiş Hücrelerden Elde Edilen Doğrudan Yeniden Programlanmış Miyotüplerde Ekson Atlama

Bu protokol, 1) yetişkin fare gastroknemius kasından primer fibroblastların izolasyonunu ve kültürünü ve ayrıca 2) sükroz yoğunluk gradyanları ile birlikte diferansiyel bir ultrasantrifüj yöntemi kullanılarak eksozomların saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu ve ardından western blot analizlerini göstermektedir.

İskelet Kası Fibroblastlarından Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, cilt fibroblastlarının miyoblastlara dönüşümünü ve farklılaşmalarını miyotüplere açıklar. Hücre hatları nöromüsküler bozukluğu olan hastalardan türetilmiştir ve patolojik mekanizmaları araştırmak ve terapötik stratejileri test etmek için kullanılabilir.

Nöromüsküler Bozukluklar için Tedavileri Araştırmak için İnsan Fibroblastlarının Myoblastlara Doğrudan Yeniden Programlanması

Farelerde miyokard enfarktüsü bölgesi etrafında ultrason rehberliğinde hücre dağıtımı, hücre nakli için güvenli, etkili ve uygun bir yoldur.

Miyokard Enfarktüslü Farelerde Ultrason Rehberliğinde İndüklenen Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyosit İmplantasyonu

Öğrenin, Duchenne kas distrofili farelerde kardiyak fonksiyonu iyileştirmek için normal myojenik progenitör hücrelerden elde edilen ekzomların arıtılması ve kalp içi nakli yöntemlerini. Bu teknik distrosin ifadesini artırarak kalp fonksiyonunu destekler.

Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen (Video) | JoVE Journal

Arıtma ve Myogenic progenitör hücre nakli Exosomes Duchenne kas distrofik farelerde kardiyak fonksiyon geliştirmek için elde edilen

Daha fazla video keşfet