Name: Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Keşfedin, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerini PiggyBac vektörleriyle fonksiyonel motor nöronlara dönüştürme yöntemini. Bu protokol, ALS gibi motor nöron hastalıklarının modellenmesi ve ilaç taraması için hızlı bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, destek ve teknik tavsiyeler için Life nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia Center 'da Imaging tesisine teşekkür etmek istiyor. Biz yararlı tartışma için yaşam nano bilim merkezi üyelerine minnettarız. Bu çalışmanın kısmen AriSLA (pilot Grant 2016 "StressFUS") dan AR için bir hibe tarafından desteklenmektedir.

1. Insan iPSCs 'nin Bakımı
<ol><li>
Matris kaplı plakaların hazırlanması
	<ol>
<li>Çözme bir 5 mL matris şişe (bkz. malzeme tablosu) 4 °c gece. Orijinal matris stokları farklı stok konsantrasyonlarda gelir ve plakaya veri sayfasında belirtilen seyreltme faktörü göre yapılır, bireysel lot için özel. Matrisin erken jelini önlemek için şişe ve tüpler buz soğuk tutmak önemlidir. Buz üzerinde önceden soğutulmuş cryotubes içinde plakaya içine matris dağıtma. Kullanılmayan plakaya-20 °c ' de dondur.</li>
		<li>Yaklaşık 2 h çözülmek için buzda bir kısım yerleştirin.</li>
		<li>50 ml konik tüpte 20 ml soğuk dmem/F12 ile matrisin kısım seyreltmeli.</li>
		<li>İyi karıştırın ve 35 mm yemeklere (diğer yemeklerin yüzey alanı başına eşdeğer tutarlar) 1 mL seyreltilmiş matrisin dağıtımı yapın.</li>
		<li>Kaplama sağlamak için oda sıcaklığında 1 saat için seyreltilmiş matris içeren yemekleri tutun. Not: Parafilm ile mühürlenmiş yemekler, 2 haftaya kadar 4 °C ' de depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Stok çözeltisi (20 ml) ve 1 adet yumuşak hücre dağılma reaktörünün çalışma plakaya hazırlanması (bkz. malzeme tablosu).<ol>
<li>PBS 'de 10 mg/mL 'ye toz eritin (CA2 +/mg2 + ücretsiz).</li>
		<li>0,22 μm filtre membran ile filtre sterilize edilir.</li>
		<li>20 plakaya (her biri 1 ml) hazırlayın ve-20 °c ' de saklayın.</li>
		<li>Kullanmadan önce, PBS 'de bir kısım seyreltin (CA2 +/mg2 + ücretsiz) 1 mg/ml (1x çalışma aliquots). Not: 1x çalışma plakaya 2 hafta kadar 4 °c ' de depolanabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
İnsan IPhone 'ları geçmekle.
	<ol>
<li>Başlamadan önce: 4 °C ' de depolanırsa, 37 °C ' de kuluçsa ön sıcak matris kaplı plakalar 20-30 dk. oda sıcaklığında önceden sıcak insan iPSC orta miktarı (bkz. malzeme tablosu) gerekli. Ön sıcak DMEM/F12.</li>
		<li>Aspirate kültür ortamı.</li>
		<li>Ipscs 'yi PBS ile durulayın (CA2 +/mg2 + ücretsiz).</li>
		<li>1x nazik ayrışma solüsyonu ekleyin (35 mm 'lik bir çanak için 0,5 ml). 37 °C ' de kolonilerin kenarları tabandan ayrılmaya başlayana kadar genellikle 3-5 dak.</li>
		<li>Yumuşak ayrışma çözümünü aspirate, IPSC kolonilerini ayırmamaya dikkat edin.</li>
		<li>Hücreleri dmem/F12 (35 mm çanak için 2 ml) ile yıkayın ve hücreleri ayırmak için dikkatli olmak Aspire. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>İnsan iPSC Orta (35 mm çanak için 1 mL) ekleyin.</li>
		<li>Kolonileri bir hücre kaldırıcısı ile yavaşça ayırın ve 15 mL tüpüne aktarın.</li>
		<li>Bir P1000 pipetör 3-4 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme tarafından yavaşça hücre kümeleri kırmak.</li>
		<li>Matris kaplı plaka (ler) den süpernatant aspirate.</li>
		<li>İnsan iPSC orta uygun kültür hacmi hücreleri tohum. Bölünmüş oranı satırdan satıra değişebilir ve yaklaşık 1:4-1:8. Günlük orta değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NIL ve NıP Indüklenebilir iPSC hatları üretimi
<ol><li>
Hücre transfeksiyon.
	<ol>
<li>Hücreleri PBS ile durulayın (CA2 +/mg2 + ücretsiz).</li>
		<li>Hücre ayrışma reaktif ekleyin (bkz. malzeme tablosu) (35 mm çanak Için 0,35 ml) ve tek hücreler ayrılıncaya kadar 37 °c ' de inkübasyon (5-10 dk).</li>
		<li>Bir P1000 pipetör 3-4 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme ile yavaşça komple hücre ayrımı.</li>
		<li>15 mL 'Lik bir tüpte toplayın ve PBS (CA2 +/mg2 + ücretsiz) ' ye 10 ml ekleyin. Hücreleri say.</li>
		<li>Pellet 106 hücreler ve pelletini içinde 100 μL tampon R (hücre Elektroporasyon kiti dahil, bkz. malzeme tablosu).</li>
		<li>Transfeksiyon için Plasmid DNA ekleyin: 4,5 μg transpoze vektörü (EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP12) ve 0,5 μg piggybac transposase Plasmid13.</li>
		<li>Hücre Elektroporasyon sistemi ile transfect ( malzeme tablosunabakın) üreticinin talimatlarına göre ve daha önce aşağıdaki parametrelerle3 açıklanan: 1.200 V voltaj, 30 MS genişlik, 1 darbe. 10 μM Y-27632 ile tamamlayıcı insan IPSC orta hücreleri tohum (ROCK inhibitörü, malzeme tablosubkz) 6 mm matris kaplı çanak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Antibiyotikler ile seçim.
	<ol>
<li>Transfeksiyondan iki gün sonra kültür ortamına 5 μg/mL Blasticidin ekleyin.</li>
		<li>Transfürif olmayan hücrelerin çoğu 48 h 'de Blasticidin seçimi içinde ölecek. Genomda transgenler entegre değil hücreleri karşı-seçmek için en az 7-10 gün boyunca Blasticidin hücreleri tutun.</li>
		<li>Farklı sayıda transgenler ve farklı entegrasyon sitesi içeren hücrelerden oluşan karışık bir nüfus olarak stabil transfenli hücreleri koruyun veya tek klonları yalıtın.</li>
		<li>1 μg/mL doksisiklin indüksiyonunda, Ngn2 için transgeni özgül astar ile RT-PCR tarafından, transgenlerin etkili bir ifade için kontrol etmek için ek bir çanak hazırlamak (Forward: TATGCACCTCACCTCCCCATAG; Ters: GAAGGGAGGAGGGCTCGACT), daha önce açıklanan12.</li>
		<li>Bu aşamada, insan iPSCs (bkz. malzeme tablosu) için donma ortamında NIP-ipsc hatlarının romanını dondur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. motor neuron farklılaşma
<ol><li>Hücrelerin hücre kesilmesi reakajıyla açıklandığı gibi ayırmak (Steps 2.1.1.-2.1.3.). 15 mL tüp ve DMEM/F12 5 hacimiyle seyreltilmiş hücreleri toplayın. 10 μM kaya inhibitörü ile tamamlayıcı hücre ve insan ipsc orta pelletini Pellet. 62.500 hücreler/cm2yoğunluğu matris kaplı yemeklerle hücreler ve tohum saymak.</li>
	<li>Sonraki gün, DMEM/F12 ile orta değiştirin, 1x istikrarlı L-glutamin analog ile tamamlayıcı, 1x esansiyel olmayan amino asit (NEAA) hücre kültürü takviyesi ve 0.5 x penisilin/streptomisin, ve içeren 1 μg/mL doksisiklin. Bu farklılaşma gün 0 olarak kabul edilir. 1. gün, orta ve doksisiklin yenileyin.</li>
	<li>2. gün, 5 μM DAPT, 4 μM SU5402 ve 1 μg/mL doksisiklin içeren (1x B27, 1x istikrarlı L-glutamin analog, 1x NEAA ve 0.5 x penisilin/streptomisin) olan Nörobasal Orta (neurobasal/B27) orta, orta değiştirmek (bkz . malzeme tablosu ). Her gün 5 kadar orta ve doksisiklin yenileyin.</li>
	<li>
5. gün: hücre ayrışma reaktif ile hücreler ayrışma (bkz. malzeme tablosu).<ol>
<li>Hücreleri PBS ile durulayın (CA2 +/mg2 + ücretsiz).</li>
		<li>Hücre ayrışma reakajının (35 mm 'lik bir çanak için 0,35 ml) ekleyin ve tüm hücre tek tabakalı çanak ayrılır kadar 37 °c ' de inkübasyon. Tek hücrelerin inkübasyon sırasında ayrılmaz unutmayın.</li>
		<li>1 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri 15 mL 'Lik bir tüpte toplayın.</li>
		<li>Bir P1000 pipetör 10-15 kez ile yukarı ve aşağı pipetleme ile yavaşça komple hücre ayrımı.</li>
		<li>4 mL DMEM/F12 ekleyin ve hücreleri saymak.</li>
		<li>Bu aşamada, üretici talimatlarına göre, hücre donma Orta ( malzeme tablosunabakın) motor nöron ataları dondurmak.</li>
		<li>Pellet hücreleri ve nöronal Orta içinde pelletini (nörobazal/B27 orta ile tamamlayıcı 20 ng/ml BDNF, 10 ng/ml GDNF ve 200 ng/ml L-askorbik asit, bkz: malzeme s tablosu) 10 μM kaya inhibitörü ile desteklenmektedir.</li>
		<li>Poly-ornitin/laminin üzerindeki hücreleri tohumlama-veya alternatif olarak matris kaplı desteklerin yoğunluğu 100.000 hücreler/cm2. İmmünostatik analiz için polimer lamel magazini (bkz. malzeme tablosu) ile μ-Slide plastik destekler kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>6. gün, taze nöronal orta ROCK inhibitörü yoksun orta değiştirin. Sonraki günlerde, her 3 günde bir ortamın yarısını yenileyin. Kültür ortamı, yüzeyden dekolmanı önlemek için çok dikkatli bir şekilde değiştirilmelidir.</li>
</ol>4. immünostam Analizi
<ol><li>Hücre fikreme. Hücreleri PBS ile durulayın (CA2+/mg2 +ile) ve PBS 'de% 4 civarında formaldehite (CA2 +/mg2 +ile) Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inküye yapın. Dikkat: Paraformaldehyde zehirli ve kansere neden olduğundan şüpheleniliyor. Cilt ve gözler ile temasından kaçının ve kimyasal duman kaputu altında tutunuz.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0,1 Triton X-100 içeren PBS (CA2 +/mg2 +ile) ile geçirgen.</li>
	<li>Antikor engelleme çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inküye (ABS:% 3 BSA, PBS 'de CA2 +/mg2 +ile).</li>
	<li>ABS: Anti-TUJ1 (1:1000; tavşan) ve anti-Oct4 (1:200; fare) veya anti-sohbet (Anti-Kolin asetiltransferaz; 1:150; keçi) Primer antikorlar ile Oda sıcaklığında 1 h için inküye. Bkz. malzeme tablosu.</li>
	<li>ABS 'de uygun eşek ikincil antikor çifti ile Oda sıcaklığında 45 dk için inküat: Anti-fare Alexa Fluor 647 (1:250), Anti-tavşan Alexa Fluor 594 (1:250) ve anti-keçi Alexa Fluor 488 (1:250). Bkz. malzeme tablosu.</li>
	<li>0,4 μg/mL DAPı 'de 5 dakika boyunca oda sıcaklığında, çekirdekleri etiketlemek için inküye yapın.</li>
	<li>Floresan mikroskobun görüntülenmesi için hücreleri montaj Orta (bkz. malzeme tablosu) ile bağlayın.</li>
</ol>5. yama ile fonksiyonel karakterizasyon-kelepçe kayıtlar
<ol><li>HEPES hazırlamak-equilibrated dış solüsyon (NES) aşağıdaki gibi: 140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mm MgCl2, 10 mm HEPES, ve 10 mm glikoz. 290-300 MΩ arasında Osmolarite ayarlayın. 1N NaOH kullanarak 7,3 için pH ayarlayın ve çözümü 4 °C ' de saklayın.</li>
	<li>İç solüsyonu hazırlayın: 140 mM K-glukonat, 2 mM NaCl, 5 mM BAPTA, 2 mM MgCl2, 10 mm HEPES, 2 mm MG-ATP, 0,3 mm na-GTP. 1m Koh ile 7,3 için pH ayarlayın ve Osmolarite yaklaşık 290 MΩ ayarlanır kontrol edin. Çözümü-20 °C ' de küçük aliquots 'da dondurur.</li>
	<li>Deneyleri çalıştırmadan önce, NES çözümünü su banyosundan yaklaşık 28-30 °C ' ye önceden ısıtın.</li>
	<li>Bazı borosilikat mikropipetleri çekin (ID 0,86 mm; OD 1,5 mm) bir uç direnci taşıyan: 5-6 MΩ ve pipet tutucusuna monte etmeden önce hücre içi çözeltisi ile doldurun. Not: Tel yüzeyinde AgCl 'nin üniforma tabakası oluşturmak için en az 30 dakika boyunca kayıt elektrot ve referans elektrot su klorür Gümüş Teller unutmayın.</li>
	<li>Petri çanağını kayıt odasına aktarın ve 1-2 mL/dak 'da NES çözümüyle odasına bırakın. Solüsyonu sıcak tutmak için 30 °C sıcaklıkta bir satır içi ısıtıcıdan geçen akışa izin verin.</li>
	<li>Electrofizyoloji kayıt odasını dik mikroskop altında yerleştirin. Yama kelepçe amplifikatör ile membran akımları kaydedin ve uygun bir yazılım ile veri elde.</li>
	<li>Amplifikatör kontrol yazılımını açın ve 1 değeri ve 10 kHz 'de Bessel filtresinde sinyal kazanımı ayarlayın. Bessel filtresinin örnekleme frekansından 2,5 kat daha düşük olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kayıt yazılımında gerilim kelepçe ve akım kelepçe denemeleri için deneysel protokolleri ayarlayın.</li>
	<li>Protokol ayarında, epizodik stimülasyon modunu işaretleyiniz ve örnekleme sıklığını 25 kHz olarak ayarlayın. Sonra, dalga formu sekmesine gidin ve gerilim veya geçerli adım genlik ve uzunluğu takip olarak yazın.</li>
	<li>Voltaj-Gated sodyum akımları için, 15 gerilim basamakları (50 MS süresi)-100 mV ila + 40 mV (10 mV artışı) kullanın. Yamalı hücreye atladıktan sonra protokol çalıştırın-60 mV amplifikatör üzerinden bir tutma potansiyeli. Benzer şekilde, voltaj-Gated potasyum akımları (250 MS süresi her)-30 mV ile + 50 mV (10 mV artışı)-40 mV kaydedilmiş hücre tutan voltaj basamakları ile uyarılır.</li>
	<li>IPSC-türetilmiş kranial ve spinal MNs, kelepçe hücreleri, geçerli kelepçe modunda, bir membran potansiyeli-70 mV ve kullanım 4 akım darbeleri (1 s süresi her) artan amplitüd (+ 20 pA + 80 pA; 20 pA artışı) ateş özelliklerini araştırmak için.</li>
	<li>Her hücre voltajı-aktif akımları için elde, uyarılmış ateş aktivitesi ve üç pasif özellikleri tüm hücre kapasitans (cm), hücre membran direnci (RM) ve Istirahat membran potansiyeli (RMP) olarak.</li>
</ol>

<ol><li>Dimos, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Generated+from+Patients+with+ALS+Can+Be+Differentiated+into+Motor+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Science+%28New+York%2C+NY%29%22%5BJournal%5D)">Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons.</a> Science (New York, NY). 321 (5893), 1218(2008).</li>
<li>Ebert, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+from+a+spinal+muscular+atrophy+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient.</a> Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALS+mutant+FUS+proteins+are+recruited+into+stress+granules+in+induced+Pluripotent+Stem+Cells+%28iPSCs%29+derived+motoneurons%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+models+%26+mechanisms%22%5BJournal%5D)">ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons.</a> Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).</li>
<li>Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Orphanet+journal+of+rare+diseases%22%5BJournal%5D)">Amyotrophic lateral sclerosis.</a> Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).</li>
<li>Yan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frameshift+and+novel+mutations+in+FUS+in+familial+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+ALS%2Fdementia%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia.</a> Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).</li>
<li>Boulting, G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functionally+characterized+test+set+of+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells.</a> Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).</li>
<li>Amoroso, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+high-yield+generation+of+limb-innervating+motor+neurons+from+human+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).</li>
<li>Maury, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+analysis+of+developmental+cues+efficiently+converts+human+pluripotent+stem+cells+into+multiple+neuronal+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes.</a> Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).</li>
<li>Allodi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+neuronal+vulnerability+identifies+IGF-2+as+a+protective+factor+in+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS.</a> Scientific reports. 6, 25960(2016).</li>
<li>Kaplan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+matrix+metalloproteinase-9+is+a+determinant+of+selective+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration.</a> Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).</li>
<li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic+binding+of+transcription+factors+to+cell-specific+enhancers+programs+motor+neuron+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity.</a> Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).</li>
<li>De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+conversion+of+human+pluripotent+stem+cells+into+cranial+motor+neurons+using+a+piggyBac+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector.</a> Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).</li>
<li>Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hyperactive+piggyBac+transposase+for+mammalian+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).</li>
<li>Sances, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+ALS+with+motor+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).</li>
<li>Miller, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPSC-based+modeling+of+late-onset+disease+via+progerin-induced+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+stem+cell%22%5BJournal%5D)">Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging.</a> Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).</li>
<li>Lenzi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+control+and+ALS+mutant+human+iPSCs+into+functional+skeletal+muscle+cells%2C+a+tool+for+the+study+of+neuromuscolar+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases.</a> Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Single-Step+Induction+of+Functional+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).</li>
<li>Theka, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+generation+of+functional+dopaminergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+through+a+single-step+procedure+using+cell+lineage+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cells+translational+medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors.</a> Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).</li>
<li>Pawlowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+and+Deterministic+Forward+Programming+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+into+Neurons%2C+Skeletal+Myocytes%2C+and+Oligodendrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes.</a> Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Generation+of+Functional+Subtype+Astrocytes+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).</li>
<li>Nehme, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+NGN2+Programming+with+Developmental+Patterning+Generates+Human+Excitatory+Neurons+with+NMDAR-Mediated+Synaptic+Transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+reports%22%5BJournal%5D)">Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission.</a> Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar açıklamak için hiçbir şey var

Bu protokol, insan ıpscs 'yi, kemiğe özel transkripsiyon faktörlerinin ektopik ifadesi sayesinde Spinal ve kranial motor nöronlara verimli bir şekilde dönüştürmeyi sağlar. Bu transgenler, doksisiklin ile indüklenebilir ve piggyBac transposon tabanlı vektörü sayesinde genomda stabil bir şekilde entegre edilir. Karma bir nüfusa göre, piggyBac vektörünün bir veya birkaç kopyası, tek hücrelerin genomuna rasgele entegre edilecek ve genom bütünlüğü değişimi riskini arttırır. Dahası, iPSC subklonların Progressive seçimi zaman i...

Motor nöron (MN) dejenerasyonu amilotrofik lateral skleroz (ALS) ve spinal kas atrofi (SMA) gibi insan hastalıklarında etken rol oynar. İnsan MN karmaşıklığı özetlemek uygun in vitro hücre modeli sistemleri kurulması yeni terapötik yaklaşımlar gelişimine yönelik önemli bir adımdır. Belirgin plurilineage farklılaşma özellikleri ile donatılmış olan indüklenen pluripotent kök hücreleri (ıpscs), şimdi motor nöron hastalıkları etkilenen hastaların bir dizi türetilmiştir1,2. MN hastalıklarına ilişkili patojen mutasyonları taşıyan ek IPSC hatları, kontrol "sağlıklı" pluripotent kök hücreleri3' ten başlayarak gen düzenleme ile üretilir. Bu çizgiler in vitro hastalık modelleme ve ilaç taraması için yararlı araçları temsil eder, MNs içine IPSC farklılaşma için uygun yöntemler mevcuttur sağlanır. Bu yöntemin gelişiminin arkasındaki mantık, MN hastalıklarıyla ilgilenen bilimsel toplumu, Olgun fonksiyonel MNs 'ye yol veren hızlı ve verimli bir farklılaşma protokolüyle sağlamaktayız. Bu yöntemin ilk avantajı, yürütme zaman dilimi olur. Güç başka bir ilgili noktası herhangi bir arıtma adım eliminasyon gelir. Son olarak, protokol motor nöronların iki farklı nüfus oluşturmak için kullanılabilir.
MNs farklı alt türleri oluşturma olasılığı MN hastalıkları modelleme için özellikle ilgilidir. Tüm MN alt türleri ALS ve SMA 'da eşit derecede savunmasız değildir ve farklı motor ünitelerinde semptomların başlangıcı prognozu büyük ölçüde etkiler. ALS 'de, üst ve alt ekstremitelerde başlayan semptomlarla spinal başlangıçlar yaklaşık 3-5 yıl içinde ölüme yol açar4. Tersine, kraniyal MNS dejenerasyonu ile başlayan bulber başlangıcı, en kötü prognoz vardır. Dahası, RNA-bağlayıcı proteinleri FUS ve TDP-43 mutasyonları olan hastalarda SOD1 mutasyonları5olan bireylere göre, bulber başlangıcı yüzdesi önemli ölçüde daha yüksektir. Alternatif MN farklılaşma protokollerinin neredeyse bütünlüğü, ipscs6,7,8türevlerini ayırt etmek için omurilik karakterini gösteren retinoik asit (ra) aktivitesine dayanır. Bu spesifik MN alt türlerinden9,10koruyucu olabilir içsel faktörler, eğitim olasılığını sınırlar.
Fare embriyonik kök hücrelerinde bir önceki çalışma ile tutarlı11, son zamanlarda ınsan ıpscs ektopik ifade Ngn2, Isl1 ve LHX3 (NIL) BIR spinal MN kimlik indükler göstermiştir, Ngn2 ve Isl1 artı Phox2a (n) kranial MNS12belirtin. Bu nedenle, 12 gün boyunca işlevsel özelliklere sahip insan MNs üretimini sağlayan etkili bir protokol geliştirdik. Bu yöntemin amacı, kısa bir zaman diliminde ve arıtma (örneğin, FACS) gerek kalmadan elde etmektir, hücre nüfusu yüksek spinal veya kranial kimlik ile MNs için zenginleştirilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Elektrofizyolojik çözeltiler için</td> <td>5-Bapta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926-1G</td> kimyasalları</tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964-100ML&nbsp;</td><td>Hücre ayrışma reaktifi</td></tr><tr><td>anti-CHAT</td><td>EMD Millipore&nbsp;</td><td>AB144P</td><td>Anti-Kolin Asetiltransferaz. İmmün boyama deneylerinde kullanılan birincil antikor. RRID: AB_2079751; Lot numarası: 2971003</td></tr><tr><td>anti-keçi Alexa Fluor 488&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>A11055</td><td>İmmonofloresan deneyleri için kullanılan ikincil antikor. RRID: AB_2534102; Lot numarası: 1915848</td></tr><tr><td>anti-fare Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A31571</td><td>İmmonofloresan deneyleri için kullanılan ikincil antikor. RRID: AB_162542; Lot numarası: 1757130</td></tr><tr><td>anti-Oct4&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>611202</td><td>İmmün boyama testlerinde kullanılan birincil antikor. RRID: AB_398736; Lot numarası: 5233722</td></tr><tr><td>anti-Phox2b</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji A.Ş.</td><td>sc-376997</td><td>İmmün boyama deneylerinde kullanılan birincil antikor. Lot numarası: E0117</td></tr><tr><td>anti-tavşan Alexa Fluor 594&nbsp;</td><td>İmmünolojik Bilimler</td><td>IS-20152-1</td><td>İmmonofloresan testleri için kullanılan ikincil antikor</td></tr><tr><td>, anti-TUJ1&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>T2200</td><td>İmmün boyama deneylerinde kullanılan birincil antikor. RRID: AB_262133</td></tr><tr><td>B27</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-566</td><td>Nöronal hücre bakımı için serum içermeyen takviye</td></tr><tr><td>Bambanker</td><td>Nippon Genetics</td><td>NGE-BB02</td><td>Hücre dondurma ortamı, burada motor nöron progenitörleri için kullanılır</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-02</td><td>Beyin Kaynaklı Nörotrofik Faktör</td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203350</td><td>Prokaryotlarda ve ökaryotlarda protein sentezini inhibe eden nükleosit antibiyotik</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td>Sığır Serum Albümini. İmmün boyama deneylerinde antikorların spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için bloke edici ajan</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td>elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar</td></tr><tr><td>Clampex 10 yazılımı</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Clampex 10</td><td>Membran akımları kayıt sistemi</td></tr><tr><td>Corning Matrigel hESC nitelikli Matrix</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) fare sarkomundan sulandırılmış bazal membran hazırlığı. iPSC'nin plastik ve cam desteklere yapıştırılması için kullanılır</td></tr>, <tr><td>CRYOSTEM ACF DONDURMA ORTAMI</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>05-710-1E</td><td>İnsan iPSC'leri için dondurma ortamı</td></tr><tr><td>D-Glukoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5146</td><td>elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar</td></tr><tr><td>DAPI tozu</td><td>Roche 10236276001</td><td></td><td>4&asal;,6-diamidino-2-fenilindol. Adenin ile bağlanan floresan lekesi&ndash; immünofloresan deneylerinde çekirdek boyama için kullanılan DNA'daki timin açısından zengin bölgeler</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>AdipoGen</td><td>AG-CR1-0016-M005</td><td>Gama sekretaz inhibitörü</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>İnsan iPSC'lerinin nazikçe ayrışması için reaktif</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421-500ML</td><td>Hücre kültürü için bazal ortam</td></tr><tr><td>Doksisiklin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-1G & nbsp;</td><td>epB-Bsd-TT-NIL ve epB-Bsd-TT-NIP vektörlerinden transgenlerin ekspresyonunu indüklemek için kullanılır</td></tr><tr><td>DS2U&nbsp;</td><td>WiCell</td><td>UWWC1-DS2U</td><td>Ticari insan iPSC hattı</td></tr><tr><td>E.Z.N.A Toplam RNA Kiti&nbsp;</td><td>Omega bio-tek</td><td>R6834-02</td><td>Kültürlenmiş ökaryotik hücrelerden RNA'nın toplam ekstraksiyonu için kit</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PreproTech</td><td>450-10</td><td>Glial Türetilmiş Nörotrofik Faktör</td></tr><tr><td>Gibco Epizomal hiPSC Hattı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A18945</td><td>Ticari insan iPSC hattı</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050038</td><td>Arttırılmış stabiliteye sahip L-glutamine bir alternatif. Hücre sağlığını iyileştirir.</td></tr><tr><td>Elektrofizyolojik çözümler için</td> <td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td> kimyasalları</tr><tr><td>RT-qPCR için iScript Ters Transkripsiyon Süper Karışımı&nbsp;</td><td>Gerçek</td> zamanlı qPCR <td>iTaqTM Universal SYBR</td> Green Supermix&nbsp; <td>kullanarak gen ekspresyon analizi için Bio-Rad 1708841 Kiti</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5121&nbsp;</td><td>Herhangi bir gerçek zamanlı PCR cihazında boya bazlı kantitatif PCR (qPCR) için optimize edilmiş, kullanıma hazır reaksiyon ana karışımı</td></tr><tr>Elektrofizyolojik çözeltiler için <td>K-Glukonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td>kimyasalları Elektrofizyolojik çözeltiler için</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>kimyasalları</td></tr><tr><td>L-askorbik asit</td><td>LKT Laboratuvarları</td><td>A7210</td><td>Hücre kültüründe antioksidan</td></tr><tr><td>olarak kullanılır Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11243217001</td><td>İn vitro nöral hücrelerin bağlanmasını ve büyümesini teşvik eder</td></tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop&nbsp;</td><td>Olimpos</td><td>&nbsp; iX83 FluoView1200</td><td>İmmün boyama görüntülerinin elde edilmesi için konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar</td></tr><tr><td>Montaj Ortamı&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>50001</td><td>Konfokal mikroskopi ve immünofloresan testleri için kullanılan montaj çözümü</td></tr><tr><td>Multiclamp yama-kelepçe amplifikatörü</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>700B</td><td>Membran akımları kayıt sistemi</td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td>elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71376</td><td>elektrofizyolojik çözeltiler için kimyasallar</td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11140035</td><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler. Hücre büyümesini ve canlılığını artırmak için hücre kültürü ortamı için ek olarak kullanılır.</td></tr><tr><td>Neon 100 & mu; L Kiti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK10096</td><td>Hücre elektroporasyon kiti</td></tr><tr><td>Neon Transfeksiyon Sistemi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td>Hücre elektroporasyon sistemi</td></tr><tr><td>Neurobazal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Astrosit besleyici katmana ihtiyaç duymadan nöronal hücre popülasyonlarının uzun süreli bakımı ve olgunlaşması için tasarlanmış bazal ortam</td></tr><tr><td>NutriStem-XF/FF&nbsp;</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>05-100-1A</td><td>İnsan iPSC kültür ortamı</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>157-8</td><td>İmmün boyama deneylerinde hücre fiksasyonu için kullanılır</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662-500ML</td><td>Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salin, Kalsiyumlu, Magnezyumlu</td></tr><tr><td>PBS Ca 2 + / Mg2 + ücretsiz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td>Dulbecco'nun Fosfat Tampon Salini, Kalsiyumsuz, Magnezyum</td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333-100ML</td><td>Penisilin / Streptomisin çözeltisi, bakterilerden hücre kültürü kontaminasyonunu önlemek için kullanılır.</td></tr><tr><td>poli-ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957</td><td>İn vitro</td></tr><tr><td>SU5402</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0443-5MG</td><td>Vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptörü 2'nin seçici inhibitörü (VEGFR-2)</td></tr> <tr><td>Triton X-100 ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>4- (1,1,3,3-Tetrametilbutil) fenil-polietilen glikol,&nbsp; t-Oktilfenoksipolietoksietanol, Polietilen glikol&nbsp; tert-oktilfenil eter. İmmün boyama testlerinde hücre geçirgenliği için kullanılır</td></tr><tr><td>Dik mikroskop</td><td>Olympus</td><td>BX51VI</td><td>CoolSnap Myo kamera ile donatılmış elektrofizyolojik kayıt için mikroskop&nbsp;</td></tr><tr><td>Y-27632&nbsp; (KAYA inhibitörü)</td><td>Enzo Yaşam Bilimleri</td><td>ALX-270-333-M005&nbsp;</td><td>Rho ile ilişkili, sarmal bobin içeren protein kinazın (ROCK) hücre geçirgen seçici inhibitörü. iPSC sağkalımını artırır</td></tr><tr><td>&mu;-Slayt 8 İyi&nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>High&ndash desteği; Sabit hücrelerin mikroskobik analizini sonlandırın</td></tr></tbody></table>

insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (ipscs), piggybac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

Burada insan indüklenen pluripotent kök hücrelerden fonksiyonel omurilik ve kraniyal motor nöronları elde etmek için bir yöntem tarif (ıpscs). Motor nöron içine doğrudan dönüşüm transkripsiyon faktörleri alternatif modüller ektopik ifade ile elde edilir, yani Ngn2, Isl1 ve Lhx3 (NIL) veya Ngn2, Isl1 ve Phox2a (NSIP). NIL ve NıP sırasıyla spinal ve kraniyal motor nöron kimliğini belirtir. Protokollerimiz, NIP 'nin bir piggybac transpozon vektörü ile genomda stabil entegre edildiği değiştirilmiş IPSC hatları ile başlar. Transgenlerin ifadesi daha sonra doksisiklin ve yol açar, 5 gün içinde, ıpscs MN progenitors dönüşümüne. Sonraki olgunlaşma, 7 gün boyunca, spinal veya kranial MNs homojen nüfusa yol açar. Bizim yöntemi önceki protokoller üzerinde çeşitli avantajları tutar: son derece hızlı ve Basitleştirilmiş; viral enfeksiyon veya daha fazla MN yalıtım gerektirmez; farklı MN alt kitleleri (omurilik ve kranial) olgunlaşma dikkat çekici bir derece ile Üreten sağlar, eylem potansiyelleri trenler yangın yeteneği tarafından gösterilmiştir. Dahası, çok sayıda motor nöronları karışık nüfus arıtmadan elde edilebilir. IPSC-türev spinal ve kraniyal motor nöronlar Amilotrofik lateral skleroz ve motor nöron diğer nörodejeneratif hastalıkların in vitro modelleme için kullanılabilir. Homojen motor nöron nüfus hücre tipi spesifik ilaç gösterimleri için önemli bir kaynak temsil edebilir.

Şekil 1' de farklılaşma yönteminin şematik bir açıklaması gösterilir. İnsan ipscs (WT I Line3) EPB-BSD-TT-NIL veya EPB-BSD-TT-NIP ile transfekte edildi, oluşturulan, Blasticidin seçimi üzerine, istikrarlı ve indüklenebilir hücre hatları12, bundan sonra IPSC-NIL ve IPSC-NIP olarak anılacaktır, sırasıyla. Farklılaşan hücreler pluripotency Marker OCT4 ve Pan-neuronal Marker TUJ1 ifadesi için karakterize edildi. İmmünostik analizi, TUJ1 pozitifliği...

Bu protokol indüklenebilir piggyBac vektörler transkripsiyon faktörlerin ektopik ifade, bir spinal veya kranial kimlik ile motor nöronlar içine indüklenen pluripotent kök hücrelerinin hızlı ve verimli dönüşüm sağlar.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Motor nöronların farklı alt tipleri üretme olasılığı özellikle amotrofik lateral skleroz gibi modern motor nöron hastalıklarının modelilmesi için önemlidir. Bu yöntem, kısa bir zaman diliminde ve arınma adımı olmadan spinal veya kranial kimliği olan motor nöronlar için son derece katı olan hücre popülasyonlarının edinimisağlar. Basitleştirilmiş kültür durumu altında indüklenen pluripotent kök hücrelerden veya iPSC insan motor nöronların üretimi motor nöron hastalıkları için ilaç tarama kolaylaştırabilir.Programlama transkripsiyon faktörü indüklenebilir ifade nöronal gibi başka bir hücre tipleri oluşturmak için kullanılabilir, iskelet kası, ve bir iPSC deposundan glial hücreler. NIL ve NIP iPSC hat üretimi için, 37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika hücre bölünmesi reaktifi ile hücreleri tedavi etmeden önce kalsiyum ve magnezyumiçermeyen PBS ile insan iPSC kültürünü durulayın. Hücreler kültür kabından çıkmaya başladığında, hücreleri elle üç ila dört kez ayırmak için p1000 pipetkullanın.Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve son hacmi 10 mililitreye kadar getirin ve taze PBS'yi kalsiyum ve magnezyum olmadan sayın. Santrifüj ile altıncı hücrelere bir kez 10 toplayın ve elektroporasyon kitinden 100 mikrolitre tampon R'de peleti yeniden askıya alın. Transpoze edilebilir vektör plazma DNA 4,5 mikrogram ve transfeksiyon için piggyBac transposase plazma DNA 0,5 mikrogram ekleyin.Transfect ile hücre elektroporasyon sistemi üreticinin talimatlarına göre belirtilen parametreleri. Daha sonra, insan iPSC orta hücreleri tohum altı milimetre matris kaplı çanak 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiştir. Transfeksiyondan iki gün sonra, transgenleri entegre etmemiş hücreleri seçmek için en az 7 ila 10 gün boyunca hücreleri antibiyotikte tutmak için kültür ortamına mililitre blastisdin başına 5 mikrogram ekleyin.Kuluçka sonunda, farklı sayıda transgen ve farklı entegrasyon alanlarına sahip hücrelerden oluşan karışık bir popülasyon olarak transfected hücreleri korumak veya tek klonları izole. Daha önce açıklandığı gibi nörojenin-2 için transgen-spesifik astarlar ile RT-PCR tarafından değerlendirilecek doksisiklin indüksiyon mililitre başına bir mikrogram üzerinde transgenlerin etkili ifade sağlamak için ek bir yemek hazırlayın. Bu aşamada, roman NIL ve NIP iPSC hatları stokları da insan iPSCs için dondurucu ortamda dondurulmuş olmalıdır.Motor nöron farklılaşması için, hücrelerin beş cilt DMEM/F12 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplanmasına izin vermek için gösterildiği gibi, stably transfected hücre kültürlerini ayrıştırın. Santrifüjden sonra, mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen insan iPSC ortamda hücreleri resuspend sayma için. Hücreleri matris kaplı tabaklarda 6,25 kat 10 santimetre karelik bir yoğunlukta tohumlayın.Önümüzdeki iki gün için, taze diferansiyasyon orta doksisiklin ile takviye supernatants değiştirin. Gün iki, gama sekretaz inhibitörü ile desteklenen nörobazal B27 orta orta değiştirmek, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör inhibitörü, ve doksisiklin. Beşinci gün, gösterildiği gibi hücreleri ayırın ve sayım için DMEM/F12 orta dört mililitre müstakil hücreleri yeniden askıya.Pipetleme hücrelerin tam bir dissociation için önemlidir. Üreticinin talimatlarına göre hücre dondurma ortamda motor nöron progenitors bir aliquot dondurma ve santrifüj ile hücrelerin geri kalanını toplamak. Nöronal ortamda pelet resuspend 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile takviye.Poliornitlamin kaplı mikroslide üzerindeki hücreleri, santimetre kare yoğunluğunda bir defadan 10'a kadar polimer kapak lı destekler. Altıncı gün, dikkatle destek yüzeyinden hücreleri ayırmadan aşağı analiz kadar kültür için inhibitör olmadan taze nöronal orta ile orta değiştirin. Pluripotency marker octamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü dört veya OTC4 tek tip bir ekspresyon pan nöronal marker nöron özgü sınıf üç beta-tubulin TUJ1 pozitifliği yokluğunda gün sıfır hücre kültürleri ayırt gözlenebilir.Üçüncü gün, OCT4-pozitif hücrelerin sayısında güçlü bir azalma belirgindir. Bu, TUJ1'in iPSC'leri ayırt eden bir alt kümesindeki ifadesiyle yansıtılır. Beşinci gün, TUJ1 tutarlı bir ifade ve edinsel nöronal morfoloji gösteren popülasyonda OCT4 hiçbir ifade gözlenmez.Immünoboyama analizi motor nöron progenitor hücrelerinin rekaplama yedi gün sonrası TUJ1 ve olgun motor nöron marker kolin asetiltransferaz tek tip bir ekspresyonu ortaya koymaktadır. iPSC NIL türetilmiş nöronlar voltaj bağımlı sodyum akımlarını ve voltaj bağımlı potasyum akımlarını başarıyla görüntüler. Mevcut kelepçe yönteminde kenetlenmiş iPSC NIL türetilmiş motor nöronların %80'i, artı 60 pikoamp veya daha fazla akım darbesi enjekte edildiğinde sivri trenleri tetikleyebilir.Kaydedilen hücrelerin %50'sinden fazlasında tekrarlayan ateşleme sağlamak için gereken minimum akım artı 40 pikoam, yaklaşık eksi 38 milivolt luk bir başak eşiği ve yaklaşık sekiz hertz'in 40 pikoamp'ında ortalama ateşleme sıklığına sahiptir ve bu da iPSC NIL kaynaklı spinal motor nöronların olgun nöronların tipik fonksiyonel özelliklerini sergilediğini düşündürmektedir. Spinal ve kranial motor nöronlar patolojik mutasyonlar taşıyan kontrollü iPSC'lerden veya iPSC'lerden elde edilebilir ve bu hücreler tez modeli olarak veya ilaç taraması için kullanılabilir. Yöntemimiz, farklı motor nöron ünitelerinin ALS'den neden farklı olarak etkilendiğini anlamamıza yardımcı olmak için kullanılabilir.

conversion-human-induced-pluripotent-stem-cells-ipscs-into-functional

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

OCT4 bir retrovirüs-aracılı ektopik ifadesi ile insan kaynaklı hücreler pluripotent kök (iPSCs) üretmek için bir yöntem olup, SOX2, KLF4 ve MYC tarif edilmektedir. GFP dayanarak insan iPSC koloniler tespit etmek pratik bir yolu da tartışılmaktadır.

GFP Retroviral Vector kullanarak İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin (iPSCs) içine İnsan somatik hücreleri yeniden programlama

Bu video, soya özgü transkripsiyon faktörlerinin ektopik ekspresyonu ile PiggyBac transpozon sistemi ile insan iPSC'lerinin transfeksiyonu yoluyla motor nöronlar üretme prosedürünü göstermektedir.

İnsan iPSC'lerinde PiggyBac Transpozon Aracılı Gen Düzenleme: PiggyBac Transpozon Sistemi Kullanılarak İnsan iPSC'lerine İlgilenilen Geni Entegre Etme Prosedürü

Bu video, insan iPSC'lerini motor nöronlara ayırma sürecini göstermektedir. Gerekçe, belirli transkripsiyon faktörlerini ifade etmek için genetik olarak değiştirilmiş iPSC'lerin kullanılmasını içerir. Doksisiklin içeren bir ortamda kültürlendiğinde, bu antibiyotik transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonunu tetikler, böylece motor nöron progenitörlerine iPSC farklılaşmasını teşvik eder. Nihayetinde, progenitörler, olgun ve işlevsel motor nöronlar elde etmek için nöronal bir ortamda kültürlenir.

Tasarlanmış İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Fonksiyonel Motor Nöronlara Farklılaşması

Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi otolog nakli türetilmesi için ilginç umutları sağlar. Ancak, pluripotent devlet ve zahmetli yeniden farklılaşma yoluyla ilerleme hala klinik çeviri engellemektedir. Burada erişkin insan fibroblast türetme ve uyarılmış nöral progenitör hücrelerin içine doğrudan dönüşüm ve nöral soy içine sonradan farklılaşmayı açıklar.

Yetişkin İnsan Fibroblastları türetilmesi ve Genişletilebilir Sinir Progenitör Hücreler içine Doğrudan Dönüşüm

Piramidal nöronlar dendritik dikenleri memeli beyin korteksinde en uyarıcı sinaps sitelerdir. Bu yöntem, uyarılmış pluripotent kök hücrelerinden elde edilen insan kortikal piramidal glutamaterjik nöronları omurga morfolojileri 3D kantitatif analiz açıklanır.

İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin türetilmiş Piramidal Nöronlar gelen Dendritik Spine Üç boyutlu Niceleme

Bu çalışmada, viral olmayan bir transpozon sistemi kullanarak fare amniyotik sıvı hücrelerinden indüklenmiş pluripotent kök hücreler üretiyoruz.

Bir Transpozon Sistemi Kullanılarak Fare Amniyotik Sıvı Hücreleri pluripotent kök hücrelerin üretimi

Protokol, çevresel kan mononükleer hücrelerin yeniden programlanması ile sinirsel kök hücrelerini Sendai virüs enfeksiyonu, dopaminerjik nöronlar içine inscs farklılaşma, tek taraflı-lesioned içine da öncüleri transplantasyon teşvik sunar Parkinson hastalığı fare modelleri ve PD tedavisi için iNSC-türetilen DA öncüleri güvenlik ve etkinliğini değerlendirilmesi.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Bu makalede, bir tezgah üstü 3D süspansiyon biyoreaktöründe insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevli nöronların üretimi için bir protokol açıklanmaktadır.

Üç Boyutlu Süspansiyon Biyoreaktöründe İnsan Nörojenin 2-İndüklenebilir Nöronların Üretimi

Biz insan nöronal atalarıdır ve sinir onarımı için gelişmekte olan MSS nöronal hücre tipleri büyük bir arz türetme sağlayan küçük moleküller ile tanımlanan koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan neuroblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Nöronal atalarıdır ve Nöronlar Verimli türetilmesi

Keşfedin, insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerini PiggyBac vektörleriyle fonksiyonel motor nöronlara dönüştürme yöntemini. Bu protokol, ALS gibi motor nöron hastalıklarının modellenmesi ve ilaç taraması için hızlı bir yaklaşım sunar.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü (Video) | JoVE Journal

Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

Daha fazla video keşfet