Insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin (iPSCs), PiggyBac vektörler kullanarak fonksiyonel spinal ve kranial motor nöronlara dönüşümü

Motor nöronların farklı alt tipleri üretme olasılığı özellikle amotrofik lateral skleroz gibi modern motor nöron hastalıklarının modelilmesi için önemlidir. Bu yöntem, kısa bir zaman diliminde ve arınma adımı olmadan spinal veya kranial kimliği olan motor nöronlar için son derece katı olan hücre popülasyonlarının edinimisağlar. Basitleştirilmiş kültür durumu altında indüklenen pluripotent kök hücrelerden veya iPSC insan motor nöronların üretimi motor nöron hastalıkları için ilaç tarama kolaylaştırabilir.

Programlama transkripsiyon faktörü indüklenebilir ifade nöronal gibi başka bir hücre tipleri oluşturmak için kullanılabilir, iskelet kası, ve bir iPSC deposundan glial hücreler. NIL ve NIP iPSC hat üretimi için, 37 santigrat derecede 5 ila 10 dakika hücre bölünmesi reaktifi ile hücreleri tedavi etmeden önce kalsiyum ve magnezyumiçermeyen PBS ile insan iPSC kültürünü durulayın. Hücreler kültür kabından çıkmaya başladığında, hücreleri elle üç ila dört kez ayırmak için p1000 pipetkullanın.

Hücreleri 15 mililitrelik bir tüpe aktarın ve son hacmi 10 mililitreye kadar getirin ve taze PBS'yi kalsiyum ve magnezyum olmadan sayın. Santrifüj ile altıncı hücrelere bir kez 10 toplayın ve elektroporasyon kitinden 100 mikrolitre tampon R'de peleti yeniden askıya alın. Transpoze edilebilir vektör plazma DNA 4,5 mikrogram ve transfeksiyon için piggyBac transposase plazma DNA 0,5 mikrogram ekleyin.

Transfect ile hücre elektroporasyon sistemi üreticinin talimatlarına göre belirtilen parametreleri. Daha sonra, insan iPSC orta hücreleri tohum altı milimetre matris kaplı çanak 10 mikromolar ROCK inhibitörü Y-27632 ile desteklenmiştir. Transfeksiyondan iki gün sonra, transgenleri entegre etmemiş hücreleri seçmek için en az 7 ila 10 gün boyunca hücreleri antibiyotikte tutmak için kültür ortamına mililitre blastisdin başına 5 mikrogram ekleyin.

Kuluçka sonunda, farklı sayıda transgen ve farklı entegrasyon alanlarına sahip hücrelerden oluşan karışık bir popülasyon olarak transfected hücreleri korumak veya tek klonları izole. Daha önce açıklandığı gibi nörojenin-2 için transgen-spesifik astarlar ile RT-PCR tarafından değerlendirilecek doksisiklin indüksiyon mililitre başına bir mikrogram üzerinde transgenlerin etkili ifade sağlamak için ek bir yemek hazırlayın. Bu aşamada, roman NIL ve NIP iPSC hatları stokları da insan iPSCs için dondurucu ortamda dondurulmuş olmalıdır.

Motor nöron farklılaşması için, hücrelerin beş cilt DMEM/F12 ortamı içeren 15 mililitrelik bir tüpte toplanmasına izin vermek için gösterildiği gibi, stably transfected hücre kültürlerini ayrıştırın. Santrifüjden sonra, mikromolar ROCK inhibitörü ile desteklenen insan iPSC ortamda hücreleri resuspend sayma için. Hücreleri matris kaplı tabaklarda 6,25 kat 10 santimetre karelik bir yoğunlukta tohumlayın.

Önümüzdeki iki gün için, taze diferansiyasyon orta doksisiklin ile takviye supernatants değiştirin. Gün iki, gama sekretaz inhibitörü ile desteklenen nörobazal B27 orta orta değiştirmek, vasküler endotelyal büyüme faktörü reseptör inhibitörü, ve doksisiklin. Beşinci gün, gösterildiği gibi hücreleri ayırın ve sayım için DMEM/F12 orta dört mililitre müstakil hücreleri yeniden askıya.

Pipetleme hücrelerin tam bir dissociation için önemlidir. Üreticinin talimatlarına göre hücre dondurma ortamda motor nöron progenitors bir aliquot dondurma ve santrifüj ile hücrelerin geri kalanını toplamak. Nöronal ortamda pelet resuspend 10 mikromolar ROCK inhibitörü ile takviye.

Poliornitlamin kaplı mikroslide üzerindeki hücreleri, santimetre kare yoğunluğunda bir defadan 10'a kadar polimer kapak lı destekler. Altıncı gün, dikkatle destek yüzeyinden hücreleri ayırmadan aşağı analiz kadar kültür için inhibitör olmadan taze nöronal orta ile orta değiştirin. Pluripotency marker octamer bağlayıcı transkripsiyon faktörü dört veya OTC4 tek tip bir ekspresyon pan nöronal marker nöron özgü sınıf üç beta-tubulin TUJ1 pozitifliği yokluğunda gün sıfır hücre kültürleri ayırt gözlenebilir.

Üçüncü gün, OCT4-pozitif hücrelerin sayısında güçlü bir azalma belirgindir. Bu, TUJ1'in iPSC'leri ayırt eden bir alt kümesindeki ifadesiyle yansıtılır. Beşinci gün, TUJ1 tutarlı bir ifade ve edinsel nöronal morfoloji gösteren popülasyonda OCT4 hiçbir ifade gözlenmez.

Immünoboyama analizi motor nöron progenitor hücrelerinin rekaplama yedi gün sonrası TUJ1 ve olgun motor nöron marker kolin asetiltransferaz tek tip bir ekspresyonu ortaya koymaktadır. iPSC NIL türetilmiş nöronlar voltaj bağımlı sodyum akımlarını ve voltaj bağımlı potasyum akımlarını başarıyla görüntüler. Mevcut kelepçe yönteminde kenetlenmiş iPSC NIL türetilmiş motor nöronların %80'i, artı 60 pikoamp veya daha fazla akım darbesi enjekte edildiğinde sivri trenleri tetikleyebilir.

Kaydedilen hücrelerin %50'sinden fazlasında tekrarlayan ateşleme sağlamak için gereken minimum akım artı 40 pikoam, yaklaşık eksi 38 milivolt luk bir başak eşiği ve yaklaşık sekiz hertz'in 40 pikoamp'ında ortalama ateşleme sıklığına sahiptir ve bu da iPSC NIL kaynaklı spinal motor nöronların olgun nöronların tipik fonksiyonel özelliklerini sergilediğini düşündürmektedir. Spinal ve kranial motor nöronlar patolojik mutasyonlar taşıyan kontrollü iPSC'lerden veya iPSC'lerden elde edilebilir ve bu hücreler tez modeli olarak veya ilaç taraması için kullanılabilir. Yöntemimiz, farklı motor nöron ünitelerinin ALS'den neden farklı olarak etkilendiğini anlamamıza yardımcı olmak için kullanılabilir.