Multispectral görüntüleme akışı sitometrisi kullanarak In vitro micronucleus assay gerçekleştirmek için otomatik bir yöntem

Görüntü akışı tabanlı mikronükleus tsay, düşük iş akışı ve olayların görsel teyidi nin olmaması da dahil olmak üzere otomatik mikroskopi ve konvansiyonel akış sitometrisi gibi yöntemlerin çeşitli sınırlamalarının üstesinden gelebilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, genotoksisiteyi ve sitotoksisiteyi belirlemek için gerekli tüm olayların mikroskop slaytları oluşturmaya gerek kalmadan otomatik olarak görüntülenebilen, tanımlanabilen ve puanlandırılabilmesidir. Clastogens ve / veya aneugens hücre maruziyeti için, bir T25 şişesi ve kontrol kültürleri için su bir mililitre uygun hücre kültürü ortamının dokuz mililitre deneysel hücrelerin beşinci yedi ila sekiz kez 10 ilgi kimyasal bir milimetre ekleyin.

Şişeleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle üç saat boyunca kuluçkaya yatırın ve hücreleri şişe başına 15 mililitrelik polipropilen tüpe aktarın. Santrifüj ile hücreleri toplamak ve yeni T25 kültür şişeleri tohumlama için tüp başına taze kültür orta 10 mililitre pelet resuspend. Sonra mililitre başına üç mikrogram nihai bir konsantrasyon elde etmek için her şişe için sitokasin B stok konsantrasyonu 150 mikrolitre ekleyin.

Şişeleri, Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü yönergelerinin önerdiği gibi, 1,5 ila iki katına eşit bir iyileşme süresi için kuvöze iade edin. İyileşme süresinin sonunda, kültürleri santrifüj için 15 mililitrelik polipropilen tüplere aktarın ve peletleri 75 milimolar potasyum klorür beş mililitrede yeniden askıya alın. Üç kez ters çevrilerek hafifçe karıştırın ve numuneleri yedi dakika boyunca dört santigrat derecede kuluçkaya yatırın.

Kuluçka sonunda, her numuneye yüzde dört formalin iki mililitre ekleyin ve üç ters ile hafifçe karıştırın. Hücreleri santrifüj le toplamadan önce 10 dakika boyunca numuneleri dört dereceye geri verin. peletleri 100 mikrolitre taze %4 formalin ile 20 dakika boyunca yeniden askıya alın.

Kuluçka sonunda, sabit hücreleri beş mililitre yıkama tamponu içinde merkezlendirme ile tüp başına yıkama tamponu yıkayın ve tüp başına yıkama tampon 100 mikrolitre pelet resuspend. Daha sonra, bir hemositometre saymak için bireysel 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpler için örnekleri aktarın. Mililitre Başına 100 mikrogram beş mikrolitre Ekleyin Hoechst 33342 başına 1.0 x 10 mililitre başına altı hücre ve 10 mikrolitre mililitre Başına 500 mikrolitre mililitre RNase başına 100 mikrolitre tüp başına örnek başına.

37 santigrat derece ve yüzde beş karbondioksit 30 dakikalık kuluçka sonra, bir mikrocentrifuge örnekleri santrifüj ve her tüp ten supernatant tüm ama 30 mikrolitre çıkarın. Daha sonra kabarcık oluşumunu neden değil dikkat, dikkatle örnekleri askıya alın. Kabarcıklar yeniden süspansiyon üzerine görünürse, yavaşça onları kaldırmak için tüp flick.

Örnekleri multispektral görüntüleme akış sitometrisi ile çalıştırmak için, önce 405 nanometre lazeri açın ve lazer gücünü 10 miliwatt'a ayarlayın. Yan dağılım lazeri de dahil olmak üzere diğer tüm lazerleri devre dışı bırak ve brightfield'ı bir ve dokuz numaralı kanallara ayarlayın. Büyütme kaydırıcısının 60x olarak ayarladığını, yüksek duyarlılık modunun seçildiğini ve görüntü galerisinde yalnızca bir, yedi ve dokuz kanalda görüntülenin.

Dağılım çizimini tıklatın ve X eksenindeki tüm popülasyon ve alan M01'i seçin. Y ekseninde en boy oranı M01'i seçin ve tek hücrelerin etrafında bir bölge çizmek için kare bölgeye tıklayın. Bu bölgeye tek hücreleri adlandırın ve bölgeleri seçmek için çizime sağ tıklayın.

Tek hücre bölgesini vurgulayın ve X koordinatlarını 100 ve 900, Y koordinatlarını 0,75 ve bir olarak değiştirin. Edinme parametrelerini ayarlayın ve dosya adını ve hedef klasörünü belirtin. Daha sonra olay sayısını 20,000'e değiştirin, DNA pozitif popülasyonunu seçin ve ilk örneği çalıştırın.

IDEAS'ta bir veri dosyasını açmak için, Dosya Yı Aç Sihirbazı'nı başlatmak için Çözümle Başla'yı tıklatın ve istediğiniz ham resim dosyasını seçmek için göz atın. Ardından İleri'yi tıklatın ve resim galerisindeki binucleated hücreye göz atın. Maske oluşturmak için, ilgi alanı görüntüsünü seçmek ve analiz sekmesini açmak için tıklatın.

LevelSet'i seçmek için Maskeler, Yeni ve İşlev'i tıklatın. Maske altında, M07 ve Orta Düzey Maske'yi seçin ve kontur ayrıntıları ölçeğini üçe ayarlayın. Ardından Iki kez Tamam'ı tıklatın.

Binucleated hücre özelliklerini tespit etmek için Çözümsekmesini açın ve Özellikler ve Yeni'yi seçin. Özellik Türü için Spot Sayısı'nı seçin. Maske için, son binucleated maskeyi seçin ve bağlantı özelliğini dörde ayarlayın, ardından adı Spot Count BNC olarak değiştirin ve özellik değerlerini hesaplamak için Tamam'ı tıklatın ve kapatın.

Bir nokta sayısı binucleated hücre histogram için, histogram tıklayın ve ana popülasyon olarak non-apoptopic seçin. X ekseni özelliği için, Spot Sayısı BNC'yi seçin ve Tamam ve doğrusal bölgeyi tıklatın, ardından Bim Two boyunca bir bölge çizin ve bu bölgeye 2N adını verin. Mikronükleus maskesi oluşturmak için, görüntü galerisinden mikronükleus içeren binucleated hücre seçin ve Analiz sekmesinde maskeleri açın.

Nokta tanımlama maskesi oluşturmak için yeni ve işlev'i tıklatın ve Spot'u seçin. Parlak radyo düğmesinin seçildiğini onaylayın ve maske altında M07'yi seçin. Spot'u Hücre Arka Planı Oranına ve Minimum Yarıçap'ı ikiye ayarlayın ve Maksimum Yarıçapı altıya ayarlayın.

Maskeyi soldaki listeye eklemek için Tamam ve Tamam'ı tıklatın, sonra başka bir maske oluşturmak için Yeni'yi tıklatın. Spot M07 Kanal yedi Parlak iki altı iki maske tıklayın ve maske tanımına eklemek için aşağı ok tıklayın ve Ve ve değil işleçleri tıklatın. Maske tanımına genişlemiş aralık maskesi eklemek için aşağı ok'u tıklatın.

Çok çekirdekli bir popülasyon maskesi oluşturmak için Çözümleme, Maskeler, Yeni ve İşlev'i tıklatın. İşlev altında Aralık'ı seçin. Maske'nin altında, Havza Dilate Set M07 Channel07, Orta, üç, iki'yi seçin ve görüntüyü Kanal 07'ye görüntülemek üzere ayarlayın.

Minimum ve maksimum alan değerlerini sırasıyla 135 ve 5000 olarak ayarlayın ve minimum ve maksimum en boy oranı değerlerini sırasıyla 0,4 ve bir olarak ayarlayın. Tamam'ı tıklatın ve ad alanında, METNI POLY maskesini okumak için değiştirin, ardından Tamam ve Kapat'ı tıklatın. Özel bir görünüm oluşturmak için Resim Galerisi Özellikleri düğmesini tıklatın, Bileşikler sekmesini açın ve Yeni'yi tıklatın.

Ad altında, Kanal 01'den Kanal 07'ye girin. Resim Ekle'yi tıklatın ve Resim'in altında Kanal 01'i seçin ve yüzdeyi 100 olarak ayarlayın. Yeniden Resim Ekle'yi tıklatın ve görüntünün altında Kanal 07'yi seçin ve yüzdeyi 100 olarak ayarlayın.

Görünüm sekmesini tıklatın, Yeni'yi tıklatın ve Ad'ın altında BNC ve MN maskelerini girin. Ardından Sütun Ekle'yi tıklatın ve Resim türünün altında Kanal 01'i ve Maske'nin altında Yok'u seçin. Sütun Ekle'yi tıklatın ve Resim Türü'nün altında Kanal 07'yi seçin ve Maske'nin altında Yok'u seçin.

Sütun Ekle'yi tıklatın, Bileşik radyo düğmesini tıklatın ve ardından özel görünümü tamamlamak için Tamam'ı tıklatın. Görünüm aşağı çekme menüsüne tıklayın ve BNC ve MN maskeleri görünümünü tıklatın. Maskeleri gizle düğmesini tıklatın.

Önemli olayları sıralamak için Raporlar sekmesini açın ve İstatistik Raporu Tanımla'yı tıklatın, ardından yeni pencerede Sütun Ekle'yi tıklatın. İstatistikler altında binucleated hücre sayıları istatistiklerini eklemek için, Sayı'yı seçin ve Seçili Popülasyon'un altında BNC popülasyonu seçin, ardından istatistiği listeye eklemek ve şablonu kaydetmek için İstatistik Ekle'yi tıklatın. Tüm istatistikler listeye eklendikten sonra Kapat'ı tıklatın, ardından Tamam'ı tıklatın ve ardından veri analizi şablonuna kaydedin.

Ara gelen dosyaları toplu olarak işlemek için, Araçlar menüsü altında Toplu Veri Dosyaları'nı tıklatın ve yeni pencerede Toplu İş Ekle'yi tıklatın. Toplu iş partisine eklemek için deneme dosyalarını seçmek için Dosya Ekle'yi tıklatın ve şablon veya veri analizi dosyası seç seçeneğinin altındaki Klasörü Aç düğmesini tıklatın. Kaydedilmiş şablona göz atın ve açın.

Geçerli pencereyi kapatmak için Tamam'ı tıklatın. Ardından, tüm dosyaların toplu işlemesini başlatmak için Toplu İş gönder'i tıklatın. Burada, binükleli hücreleri tanımlamak için seçilen dört panel gösterilmiştir.

Bu bivariate plots ve histogramlar binükleated hücrelerin seçimi yanı sıra benzer dairesellik, alanlar ve yoğunlukları ile iki çekirdekleri olan ve iyi birbirinden ayrılmış bu hücrelerin belirlenmesini sağlar. Bu Brightfield ve Hoechst görüntüleri, yanı sıra binucleated hücre ve mikronükleus maskeleri, kimlik ve binucleated hücreleri ve mikronükleus numaralandırma kolaylaştırmak. Nokta sayısı özelliğinin uygulanması mononükleer, trinükleer ve kuadranükleer hücreleri tanımlamak için polinükleatlı maske kullanır.

Tri ve kuadranükleer hücrelerin sayısı daha sonra sitotoksisite hesaplaması için gerekli polinükleatlı hücrelerin son sayısını elde etmek için özetlenebilir. Burada, endojen kolşisin, klastojen mitomisin C ve negatif kontrol mannitol için protokolün geçerliliğini göstermek için temsili genotoksisite ve sitotoksisite değerleri gösterilmiştir. Hücrelerin uygun bir DNA lekesi konsantrasyonu yla etiketlanması, yüksek kaliteli görüntü yakalamayı sağlamak ve tüm önemli olayların kolayca tespit edilebilmesine ve puanlanmasına izin vermek için önemlidir.

Bu teknikler aynı zamanda radyasyon biyodosimetrisi için mikronükleus töz için de geçerlidir, hangi radyasyona maruz kalmış olabilir bireylerde doz tahmini sağlar.