Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama

Bu protokol insanların endotel hücre morfolojisini ve bölgelerdeki moleküllerin farklı sıvı kesme stresi altında ifade sini analiz lerine yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı sıvı kesme stresi altında vasküler endotel hücrelerinin doğrudan değerlendirilmesi sağlar. Bu işlemi gerçekleştirirken, önemli adımlar taze hazırlanmış paraformaldehit kullanmak ve iyi bir perfüzyon gerçekleştirmek için vardır.

Bu yordamı, metin protokolünde açıklandığı gibi 12 haftalık bir C57BL/6 farenin anestezisi ile başlayın. Kuyruğu hafifçe çimdikleyerek uygun anesteziyi onaylayın. Farenin patilerini yapışkan bantla kağıt havlu yığınına bantlayın.

Pİşir ile farenin deri tutun ve toraks üstüne karın makas bir çift ile deri kesti. Karın boşluğuaçın, göğüs kafesinin altında, keskin bir makas ile. Göğüs kafesini forsepsle kaldırın ve diyaframı kesin.

Sonra göğüs kafesini kesip göğüs boşluğunu ortaya çıkar. Vena kavasını karaciğerin hemen üstündeki makasla kesin. Basınç beş dakika boyunca arterağacı perfuse, mililitre heparin başına 40 birim içeren önceden soğutulmuş normal salin ile, sol ventrikül yoluyla, akciğerler ve karaciğer soluk hale gelene kadar.

Daha sonra PBS'de önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit ile dört dakika perfuse. Aort maruz kalana kadar tüm kasları, organları ve yağları çıkarın. Fareyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.

Hassas forceps ve hassas makas bir çift açıkça bir diseksiyon mikroskop altında aort ortaya çıkarmak için kullanın, ve aort boyunca bağ dokusu kaldırmak, mümkün olduğunca temiz. Bir çift hassas makasla kalpten çölyak gövdesine kadar göğüs aortunu inceleyin. Aortu PBS ile altı santimetrelik hücre kültürü yemeğine yerleştirin.

Kesme aort uzunlamasına açık, ilk küçük eğri boyunca, ve daha sonra aort kemer üç dalları açmak için mikroskalsors kullanın, innominate dahil olmak üzere, ortak karotis sol, ve düz segment karşılanana kadar büyük eğri boyunca sol subklavian arter. 10 dakika PBS% 1 polioksietilen sekizli fenil eter ile aort permeabilize. Daha sonra 12 iyi hücre kültür plaka, oda sıcaklığında bir saat için% 2.5 polisorbat 20 içeren tris-tamponlu tuzlu% 10 normal keçi serumu ile aort bloke.

Sonraki mililitre tavşan anti-VCAM1 başına beş gram içeren engelleme tampon aort kuluçka, ve mililitre sıçan anti-VE-Cadherin başına beş gram, dört derece santigrat gecede. Numuneyi yıkama solüsyonuyla üç kez duruladıktan sonra, floresan konjuge ikincil antikorları oda sıcaklığında bir saat boyunca uygulayın ve karanlık bir yerde tutarak. Yıkama çözeltisini üç kez daha durulayın.

Aortu DAPI ile 10 dakika boyunca ters boyayın, karanlık bir yerde tutarak. Daha sonra lekeli aortu üç kez yıkadıktan sonra durulayın. Aortu lümenal yüzeyi aşağı doğru bir kapak kaymasıüzerine yerleştirin ve daha önce kapak fişinin üzerine düşmüş olan antifade montaj çözeltisine yavaşça yerleştirin.

Numuneyi düz tutmak için aortu hafifçe gerin. Kapak fişini ters çevirin ve cam kaydırak üzerine koyun. Numune ve cam arasında herhangi bir hava kabarcıkları önlemek için dikkat edin.

Bir lazer tarama konfokal mikroskop ile aort inceleyin. Image-Pro Plus yazılımı ile en face görüntülerinde istenilen bölgeden farklı kanalların renk yoğunluklarını analiz edin. En yüz immünofloresans fare aort vasküler endotel hücrelerinin boyama görüntüleri gösterilir.

En yüz immünofluoresence vasküler hücre ahezyon proteini bir, ve ve-Kadherin ile bir endotel belirteci olarak ifade, fare aort farklı bölgelerinden değişen akış desenleri altında gösterilir. DAPI da daha iyi görselleştirme için hücre çekirdekleri göstermek için counterstained oldu. Mikroskop altında Z yığınları ile bakarken, endotel ve düz kas hücreleri kolayca hücre çekirdeği morfolojisi ile ayırt edilebilir.

Endotel hücre çekirdekleri oval şekilli ve mil şeklinde daha büyük, düz kas hücre çekirdekleri. VCAM-1'in ekspresyonu, aksat kemerinin daha az eğrilik altında, aort kemerinin daha az eğrilikaltında, aort kemerinin daha büyük eğriliğinde ve torasik aortta daha fazla eğrilik te ve bozuk aortta daha fazla olduğu görüldü. Burada fare aortunun daha az eğrilik alanları d-akış alanları olarak gösterilir ve daha büyük eğrilik ve torasik.

Doğru modifikasyon ile bu teknik vasküler geçirgenliğin analizine ve endotel hücre intimasında makromoleküllerin konumuna da uygulanabilir.