Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama
20 Ağustos 2019
Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.
Bu protokol insanların endotel hücre morfolojisini ve bölgelerdeki moleküllerin farklı sıvı kesme stresi altında ifade sini analiz lerine yardımcı olur. Bu tekniğin en büyük avantajı, farklı sıvı kesme stresi altında vasküler endotel hücrelerinin doğrudan değerlendirilmesi sağlar. Bu işlemi gerçekleştirirken, önemli adımlar taze hazırlanmış paraformaldehit kullanmak ve iyi bir perfüzyon gerçekleştirmek için vardır.
Bu yordamı, metin protokolünde açıklandığı gibi 12 haftalık bir C57BL/6 farenin anestezisi ile başlayın. Kuyruğu hafifçe çimdikleyerek uygun anesteziyi onaylayın. Farenin patilerini yapışkan bantla kağıt havlu yığınına bantlayın.
Pİşir ile farenin deri tutun ve toraks üstüne karın makas bir çift ile deri kesti. Karın boşluğuaçın, göğüs kafesinin altında, keskin bir makas ile. Göğüs kafesini forsepsle kaldırın ve diyaframı kesin.
Sonra göğüs kafesini kesip göğüs boşluğunu ortaya çıkar. Vena kavasını karaciğerin hemen üstündeki makasla kesin. Basınç beş dakika boyunca arterağacı perfuse, mililitre heparin başına 40 birim içeren önceden soğutulmuş normal salin ile, sol ventrikül yoluyla, akciğerler ve karaciğer soluk hale gelene kadar.
Daha sonra PBS'de önceden soğutulmuş %4 paraformaldehit ile dört dakika perfuse. Aort maruz kalana kadar tüm kasları, organları ve yağları çıkarın. Fareyi bir kesme mikroskobunun altına yerleştirin.
Hassas forceps ve hassas makas bir çift açıkça bir diseksiyon mikroskop altında aort ortaya çıkarmak için kullanın, ve aort boyunca bağ dokusu kaldırmak, mümkün olduğunca temiz. Bir çift hassas makasla kalpten çölyak gövdesine kadar göğüs aortunu inceleyin. Aortu PBS ile altı santimetrelik hücre kültürü yemeğine yerleştirin.
Kesme aort uzunlamasına açık, ilk küçük eğri boyunca, ve daha sonra aort kemer üç dalları açmak için mikroskalsors kullanın, innominate dahil olmak üzere, ortak karotis sol, ve düz segment karşılanana kadar büyük eğri boyunca sol subklavian arter. 10 dakika PBS% 1 polioksietilen sekizli fenil eter ile aort permeabilize. Daha sonra 12 iyi hücre kültür plaka, oda sıcaklığında bir saat için% 2.5 polisorbat 20 içeren tris-tamponlu tuzlu% 10 normal keçi serumu ile aort bloke.
Sonraki mililitre tavşan anti-VCAM1 başına beş gram içeren engelleme tampon aort kuluçka, ve mililitre sıçan anti-VE-Cadherin başına beş gram, dört derece santigrat gecede. Numuneyi yıkama solüsyonuyla üç kez duruladıktan sonra, floresan konjuge ikincil antikorları oda sıcaklığında bir saat boyunca uygulayın ve karanlık bir yerde tutarak. Yıkama çözeltisini üç kez daha durulayın.
Aortu DAPI ile 10 dakika boyunca ters boyayın, karanlık bir yerde tutarak. Daha sonra lekeli aortu üç kez yıkadıktan sonra durulayın. Aortu lümenal yüzeyi aşağı doğru bir kapak kaymasıüzerine yerleştirin ve daha önce kapak fişinin üzerine düşmüş olan antifade montaj çözeltisine yavaşça yerleştirin.
Numuneyi düz tutmak için aortu hafifçe gerin. Kapak fişini ters çevirin ve cam kaydırak üzerine koyun. Numune ve cam arasında herhangi bir hava kabarcıkları önlemek için dikkat edin.
Bir lazer tarama konfokal mikroskop ile aort inceleyin. Image-Pro Plus yazılımı ile en face görüntülerinde istenilen bölgeden farklı kanalların renk yoğunluklarını analiz edin. En yüz immünofloresans fare aort vasküler endotel hücrelerinin boyama görüntüleri gösterilir.
En yüz immünofluoresence vasküler hücre ahezyon proteini bir, ve ve-Kadherin ile bir endotel belirteci olarak ifade, fare aort farklı bölgelerinden değişen akış desenleri altında gösterilir. DAPI da daha iyi görselleştirme için hücre çekirdekleri göstermek için counterstained oldu. Mikroskop altında Z yığınları ile bakarken, endotel ve düz kas hücreleri kolayca hücre çekirdeği morfolojisi ile ayırt edilebilir.
Endotel hücre çekirdekleri oval şekilli ve mil şeklinde daha büyük, düz kas hücre çekirdekleri. VCAM-1'in ekspresyonu, aksat kemerinin daha az eğrilik altında, aort kemerinin daha az eğrilikaltında, aort kemerinin daha büyük eğriliğinde ve torasik aortta daha fazla eğrilik te ve bozuk aortta daha fazla olduğu görüldü. Burada fare aortunun daha az eğrilik alanları d-akış alanları olarak gösterilir ve daha büyük eğrilik ve torasik.
Doğru modifikasyon ile bu teknik vasküler geçirgenliğin analizine ve endotel hücre intimasında makromoleküllerin konumuna da uygulanabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, fare aortunun endotel hücrelerini doğrudan gözlemlemek için bir immunofloresan boyama protokolü sunmaktadır. Bu teknik, özellikle ateroskleroz gelişimi ile ilişkili olarak, farklı sıvı kayma gerilmesi koşulları altındaki bu hücrelerin hücresel ve moleküler fenotipini analiz etmek için etkilidir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Endotel hücre biyolojisi
- Ateroskleroz araştırmaları
- İmmünofloresan teknikleri
Arka Plan
- Vasküler biyolojide endotel hücrelerinin önemi
- Endotel fonksiyonunda kayma gerilmesinin rolü
- Akış modelleri ile ateroskleroz gelişimi arasındaki bağlantı
Kullanılan Yöntemler
- İmmünofloresan boyama protokolü
- Fare modeli (C57BL/6)
- Görüntüleme için konfokal mikroskopi
Temel Sonuçlar
- Floresan işaretleyiciler kullanılarak endotel hücrelerinin doğrudan değerlendirilmesi
- Türbülanslı akış alanlarında artan VCAM-1 ekspresyonu
- Endotel ve düz kas hücresi çekirdek morfolojisi arasında net ayrım
Sonuçlar
- Bu çalışma, endotel hücrelerinin hemodinamik kuvvetlere verdiği yanıtların incelenmesi için güvenilir bir yöntem sunmaktadır.
- Bulgular, vasküler biyolojinin ve aterosklerozun altında yatan mekanizmaların anlaşılması açısından önem taşımaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Yürütücü Endüstriyel Uygunluk
Fizyolojik kayma gerilimi altında bozulmamış endotelyal tek katmanların doğrudan görüntülenmesi, ateroskleroz araştırmalarındaki vasküler hedeflerin mekanistik risk analizinin yapılmasına olanak tanır. Bu yaklaşım, hemodinamik kuvvetleri in situ moleküler fenotiplerle ilişkilendirerek hedef doğrulamasındaki öngörü güvenini destekler. Genetik manipülasyon veya farmakolojik pertürbasyon gerektirmeden, erken evre patofizyolojik içgörü için hastalıkla ilgili bir sistem sağlar.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Bozulmuş akış paternlerini erken bir inflamatuar belirteç olan VCAM-1 artışıyla ilişkilendirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: VE-Cadherin gibi endojen endotelyal belirteçleri kullanarak fonksiyonel hedef doğrulaması için güvenilir ve tekrarlanabilir bir yöntem sunar.
- Öngörücü Değer: Preklinik ateroskleroz modellerinde lezyon oluşumundan önce gelen moleküler yanıtları belirleyerek portföy önceliklendirmesini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Endotelyal fenotiplerin yüksek içerikli analizi için uygun, standardize ve kantitatif immünofloresan çıktılar üretir.
- Ölçeklenebilirlik: Belirlenmiş akış koşulları altında birden fazla aortik bölgenin paralel değerlendirilmesine olanak tanıyarak karşılaştırmalı taramaya imkan verir.
- Analiz Standardizasyonu: Deneyler ve laboratuvarlar arasındaki değişkenliği en aza indirmek için tutarlı perfüzyon, bloklama ve boyama protokolleri kullanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Hastalıkla İlgililik: Plak oluşumuna eğilimli bölgelerdeki endotelyal yanıtları inceleyerek, erken aterosklerotik duyarlılığı doğrudan modeller.
- Translasyonel Süreklilik: Hemodinamik mekanobiyoloji ile insan vasküler patolojisiyle ilgili moleküler çıktıları birbirine bağlar.
- Riski Azaltılmış İlerleme: Hedeflerin in vivo etkinlik testlerinden önce, patofizyolojik kayma gerilimi altındaki düzenlemelerini doğrulayarak mekanistik risklerin azaltılmasını sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu teknik; hedef hipotez testinden fenotipik taramaya ve ardından preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle damar sistemi odaklı programlar için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Kontrollü kayma gerilimi altında endotelyal aktivasyon durumlarının doğrudan gözlemlenmesini sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Bileşiklerin veya genetik etkilerin endotelyal fenotip üzerindeki etkilerini karşılaştırmak için kantitatif, çoklu okunabilir veriler (örneğin, VCAM-1, VE-Cadherin, nükleer morfoloji) sunar.
- Analitik: Aort bölgeleri genelinde moleküler ekspresyonun istatistiksel karşılaştırmasına olanak tanıyan, mekansal olarak çözümlenmiş, yoğunluk tabanlı ölçümler sağlar.
- Translasyonel Araştırma: In vitro akış modellerini in vivo benzeri endotelyal tepkilerle ilişkilendirerek preklinik çalışmalar için öngörü değerini artırır.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla ateroskleroz, hipertansiyon veya vasküler inflamasyon projesinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir vasküler fenotipleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Hemodinamik kuvvetleri, sağlam dokudaki spesifik endotelyal moleküler fenotiplerle ilişkilendirerek mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış perfüzyon, fiksasyon ve boyama adımları aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Patofizyolojik olarak ilgili mekanik uyaranlar altında hedef etkileşimini doğrulayarak devam/durdur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Erken aterosklerotik endotelyal fenotiplerdeki düzenlemelerine dayalı olarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirmesine olanak tanır.
Uygulama Hususları
- Fare vasküler diseksiyonu, perfüzyon teknikleri ve konfokal mikroskopi konularında uzmanlık gerektirir.
- Perfüzyon ekipmanına, diseksiyon mikroskoplarına ve spektral ayırma özellikli lazer taramalı konfokal sistemlere erişime bağlıdır.
- Kullanıcılar ve merkezler arasında perfüzyon basıncı, fiksatif sıcaklığı ve antikor titrasyonunun standardizasyonunu gerektirir.
- Diğer vasküler yataklara (örneğin, karotis, koroner) uyarlama, diseksiyon ve permeabilizasyon adımlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Sadece son nokta analizi ile sınırlıdır; akış altındaki endotelyal yanıtların gerçek zamanlı dinamik görüntülemesini desteklemez.
