Name: Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Keşfedin, Candida albicans biyofilm büyümesini 635 nm kırmızı ışık fototerapisi ile nasıl düzenleyebilirsiniz. Bu yöntem, biyofilm direncini kırmak ve klinik uygulamalar için tedavi süresini kısaltmak amacıyla geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada gelişimi için Dr Paula da Silveira, Dr Cecília Atem Gonçalves de Araújo Costa, Shawn M. Maule, Shane M. Maule, Dr Malvin N. Janal ve Dr. Iriana Zanin teşekkür ederim. Ayrıca Dr Alexander ö. Johnson (UCSF) Bu çalışmada analiz zorlanma bağış için kabul.

1. Kültür medya hazırlanması
<ol><li>Sabouraud dekstroz agar (SDA) hazırlayın. 65 g kloramfenikol (50 mg/L) 1000 ml distile su ile SDA askıya alma. Orta tamamen erimesi için kaynatın. Tarafından 30 dk. serin ile 45-50 ° c 15 PSI (121 ° C), ısıyla sterilize Mix iyi ve SDA 20 mL steril Petri tabak içine dökün (Boyut: 100 x 15 mm).</li>
	<li>6,7 g YNB ve 18 g dekstroz 1000 ml ultrasaf su karışımı ile 100 mM glikoz ile desteklenmiş Maya azot temel (YNB) orta hazırlayın. Bir karıştırıcı kullanarak karıştırın ve 0,22 µm vakum filtre sistemi kullanarak orta sterilize.</li>
	<li>10.4 g RPMI 1640 ve 3-(N-morpholino) 34.32 gr karıştırılarak RPMI hazırlamak propanesulfonic asit (paspas) 1000 mL ultrasaf su için. Isı olmadan bir karıştırıcı karışımı ve pH 7'ye 1 N NaOH (Ekle 2 g NaOH ultrasaf su 50 ml) ekleyerek ayarlayın. 0,22 µm vakum filtre sistemi kullanarak orta sterilize.</li>
</ol>2. ön inoculum ve inoculum
<ol><li>C. albicans SN425 mikroorganizma −80 ° C dondurucudan kaldırmak ve ortam sıcaklığında erimek izin verin. Petri takıma kloramfenikol (50 mg/L) ile SDA içeren yemekleri hisse senedi kültürünün 10 µL tohum. Petri yemekler tükenmesiyle 37 ° C'de 48 h için kuluçkaya.</li>
	<li>Kuluçka 48 saat sonra temel (YNB) orta 100 mM glikoz ile desteklenmiş ve tükenmesiyle 37 ° C'de öncesi inoculum için 16 h için kuluçkaya Maya azot 10 mL 10 kolonileri C. albicans ekleyin.</li>
	<li>Bir 1:10 ile 100 mM glikoz takıma taze YNB orta içine starter kültürler sulandrarak inoculums 16 h, hazırlamak için kuluçka sonra (9 mL YNB seyreltilmiş starter kültür 1 mL) oranı. İlk optik yoğunluk (OD) 540 ölçmek nm.</li>
	<li>Suşları orta günlük büyüme aşaması ulaşmak ve 540, son OD ölçmek kadar inoculums tükenmesiyle 37 ° C'de 8 h için kuluçkaya nm. Orta günlük büyüme faz (8 h, şekil 1' deki büyüme eğrileri dayalı) inoculums OD olup olmadığını denetlemek için ilk OD dan son OD çıkarma.</li>
	<li>107 hücreleri mL-1ile bir inoculum ulaşmak için inoculum 5500 x gde 5 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant atın ve tüpler hacmi yarısı inoculum konsantre ol.</li>
</ol>3. biyofilm oluşumu ve fototerapi
<ol><li>İnoculum 1 mL 24-şey polistiren tabakta wells için ekleyin. Tükenmesiyle 37 ° C'de hücre adezyon kuyu dibine izin vermek 90 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Tutarlı olmayan bir kırmızı kullanın (bkz. Tablo reçetesi) 635 ± 10 nm dalga boyu ve 1,460 mW cm−2bir sabit çıkış gücü ile ışık kaynağı olarak ışık.</li>
	<li>Bir güç ölçüm ışığı güç yoğunluğunu ölçmek için kullanın. Uygulanan parlak pozlama 87.6 J cm-2, pozlama yaklaşık 1 dakika için eşdeğer olduğunu. Enerji yoğunluğu (J/cm2) formülünü kullanın = güç yoğunluğu (W/cm2) x ışınlama zaman (s). Bir mesafe 5 mm arasında ışık kaynağı ve biyofilm örnek ısınma önlemek için geçerlidir.</li>
	<li>Pozitif kontrol biyofilmler % 0.12 klorheksidin 1 dakika ile ve negatif kontrol biyofilmler %0,89 ile tedavi NaCl 1 dk için.</li>
	<li>Seanslarınızdan sonra iki kez %0,89 NaCl çözeltisi ile tüm biyofilmler yıkayın.</li>
	<li>1 mL RPMI 3 ile (N-morpholino) tamponlanmış 1640 ekleyin propanesulfonic asit (paspas) pH 7 biyofilmler için ve 37 ° C'de plakaları gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Adımları için 3.6 3.2, yıkamak gibi biyofilmler %0,89 ile iki kez sabah aynı tedavileri uygulamak NaCl, yeni RPMI BEZLERİ (1 mL, pH 7) kuyu için arabelleğe alınmış ekleyin ve 37 ° C'de tükenmesiyle kuluçkaya</li>
	<li>6 h sonra aynı gün biyofilmler kırmızı ışığa maruz bırakmayın. Pozitif kontrol biyofilmler % 0.12 klorheksidin 1 dakika ile ve negatif kontrol biyofilmler %0,89 ile tedavi NaCl 1 dk için. Seanslarınızdan sonra biyofilmler %0,89 NaCl çözeltisi ile iki kez yıkayın.</li>
	<li>Tekrarlamak belgili tanımlık merdiven 3.2-3,8 biyofilm gelişiminin 48 h ulaşmak kadar. Not: Temel olarak, bir tedavi sabah olacak ve diğeri öğleden sonra aynı gün (6 h apart) olacak.</li>
</ol>4. işlem
<ol><li>1 mL steril %0,89 ekleyin NaCl kuyu için de bir pipet ucu kullanarak--dan tırmalamak tarafından biyofilm kaldırmak için. Kaldırılan biyofilm için steril bir tüp ekleyin.</li>
	<li>Başka bir 1 mL steril %0,89 ekleyin NaCl de. Bunu tekrar sıfırdan ve aynı tüp için toplam hacmi 2 mL süspansiyon ekleyin.</li>
	<li>Koloni oluşturan birimler (CFU)<ol>
<li>Şiddetle girdap biyofilm süspansiyon 1 dk için. Biyofilm süspansiyon, bir aliquot olarak 0.1 mL seri seyreltme için kullanın.</li>
		<li>10-1 10-4 %0,89 NaCl çözeltisi içinde biyofilm süspansiyon sulandırmak.</li>
		<li>Her seyreltme SDA plakaları için 50 μL tohum ve plakaları için 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Kolonilerin sayımı ve formül CFU/mL uygulamak koloniler x 10n sayısı = / q (n = seyreltme; q numaralı seribaşı hacmi =).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kuru ağırlığı<ol>
<li>Tartmak ve microcentrifuge tüpler etiket.</li>
		<li>Biyofilm süspansiyon, 0.1 mL kuru ağırlığı (biyokütle) belirlenmesi için kullanın.</li>
		<li>Mutlak etanol 1 mL 0.1 mL biyofilmler bir aliquot için ekleyin ve 18 h için-20 ° C'de saklayın. 18 h sonra santrifüj kapasitesi 10.000 x g 10 min için de.</li>
		<li>Süpernatant atmak, tüpler örnekleri için bir hafta kuru ve microcentrifuge tüpleri tekrar tartmak için bir desiccator yerleştirin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Suda çözünen polisakkaritler (WSPs) ve alkali çözünür polisakkaritler (ASP)
	<ol>
<li>Biyofilm süspansiyon, şiddetle girdap birim (1,8 mL) 1 dk ve 4 ° C'de 10 dakika 5.500 × g , santrifüj için kalan üzerinden Süpernatant yeni bir tüp içinde depolamak ve çökelti steril ultrasaf su (5.500 × g, 10 min 4 ° C'de) ile hücre dışı matriks çözünmez bileşenleri içeren iki kez hücre ile yıkayın.</li>
		<li>Çözünmez içeriği yeniden 1,8 mL steril ultrasaf su askıya alma.</li>
		<li>Suda çözünen polisakkaritler (WSPs) Not: Bu deney bir duman Hood gerçekleştirin.<ol>
<li>Saklı süpernatant, 1 mL suda çözünen polisakkaritler (WSPs) miktar için saklıdır.</li>
			<li>1 dk. için saklı süpernatant lunaparkçı. Sonra steril tüpler aktarmak ve %2.5 95 etanol hacimleri ekleyin. Tüpler-20 ° c WSPs yağış için 18 h için saklayın.</li>
			<li>18 h sonra 9.500 x g 4 ° C'de 20 dk için de tüpler santrifüj kapasitesi Santrifüjü sonra supernatants atın.</li>
			<li>Üç kez ile % 75 etanol örnekleri yıkama ve granül kuruması. Pelet 1 mL steril ultrasaf su ile yeniden askıya alma ve fenol sülfürik asit yöntemini kullanarak WSP ölçmek.</li>
			<li>% 0.1 glikoz (0,01 g glikoz ultrasaf su 10 ml) için standart eğri'yi kullanın (0, 2.5, 5, 10, 15, 20 ve 25 µL glikoz tüp başına).</li>
			<li>200 µL % 5 fenol (% 90 fenol ultrasaf su 47.3 ml 2.7 mL) örnek 200 µL oluşan bir cam tüp ekleme veya standart eğri (örnek başına nüsha) nokta ve dikkatli bir şekilde karıştırın.</li>
			<li>Sülfürik asit 1 mL tüp ekleyip karıştırın. Reaksiyon için 20 dk bekleyin ve bir Spektrofotometre kullanarak örnekleri ölçmek (490 nm).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Alkali çözünür polisakkaritler (ASP) Not: Bu deney bir duman mahallede gerçekleştirin.<ol>
<li>Çözünmez yeniden askıya alınmış tutarından ASP'lerin belirlenmesi için 1 mL ayırın. Her biyofilm süspansiyon (13.000 x g, 4 ° C'de 10 dakika) aliquots santrifüj kapasitesi.</li>
			<li>Dikkatli her tüpün süpernatant kaldırın. O zaman örnekleri granül kuru vakum yoğunlaştırıcı üzerinde yer.</li>
			<li>Granül tartmak ve NaOH 1 N (NaOH 2 g ultrasaf su 50 ml) kuru ağırlığının 1 mg başına 300 µL ekleyin. Onları 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya ve 13.000 × g 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
			<li>İhtiyatlı bir pipet ve transfer supernatants Pelet Bakımı microcentrifuge tüpler için toplamak.</li>
			<li>Bir kez daha, granül oluşan tüpler 1 N NaOH eşit bir birim eklemek ve tekrarlamak ayni merdiven aynı derecede yukarıda ASP çıkış için.</li>
			<li>Kuluçka için 2 h sonra örnekleri (13.000 x g 10 dk) santrifüj kapasitesi, dikkatle supernatants toplamak ve daha önce toplanan supernatants ekleyin.</li>
			<li>Üçüncü çıkarılması için tekrarlamak ayni merdiven olarak yukarıda, ama bu sefer, örnekleri Santrifüjü önce 2 h için kuluçkaya değil.</li>
			<li>Daha sonra üç birim % 95 etanol her örnek için ekleyin. O zaman, örnekleri −20 ° C yağış ASP için 18 h için stok.</li>
			<li>Tüpler (9500 × g için 4 ° C'de 20 dk) santrifüj kapasitesi ve supernatants atın.</li>
			<li>Her Pelet üç kez % 75 etanol ile yıkama ve kuruması (aynı işlemleri yaptım WSP için). Granül eşit 1 N NaOH ile ilk çıkarma hacmi yeniden askıya.</li>
			<li>Örnekleri miktar fenol sülfürik kullanarak ASP için okumak (WSP analiz gelince aynı).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sardi, J. C. O., Scorzoni, L., Bernardi, T., Fusco-Almeida, A. M., Mendes Giannini, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+species%3A+current+epidemiology%2C+pathogenicity%2C+biofilm+formation%2C+natural+antifungal+products+and+new+therapeutic+options%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Candida species: current epidemiology, pathogenicity, biofilm formation, natural antifungal products and new therapeutic options.</a> Journal of Medical Microbiology. 62 (Pt 1), 10-24 (2013).</li>
<li>Harriott, M. M., Noverr, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Candida+albicans+and+Staphylococcus+aureus+form+polymicrobial+biofilms%3A+effects+on+antimicrobial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Candida albicans and Staphylococcus aureus form polymicrobial biofilms: effects on antimicrobial resistance.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3914-3922 (2009).</li>
<li>Srinivasan, A., Lopez-Ribot, J. L., Ramasubramanian, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overcoming+antifungal+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today+Technologies%22%5BJournal%5D)">Overcoming antifungal resistance.</a> Drug Discovery Today Technologies. 11, 65-71 (2014).</li>
<li>Finkel, J. S., Mitchell, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+Candida+albicans+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic control of Candida albicans biofilm development.</a> Nature Reviews Microbiology. 9 (2), 109-118 (2011).</li>
<li>Zarnowski, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+entries+in+a+fungal+biofilm+matrix+encyclopedia%5BTitle%5D)+AND+%22MBio%22%5BJournal%5D)">Novel entries in a fungal biofilm matrix encyclopedia.</a> MBio. 5, e013333 (2014).</li>
<li>Mitchell, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+participation+in+biofilm+matrix+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Community participation in biofilm matrix assembly and function.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4092-4097 (2015).</li>
<li>Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Andes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fungal+super+glue%3A+the+biofilm+matrix+and+its+composition%2C+assembly%2C+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Fungal super glue: the biofilm matrix and its composition, assembly, and functions.</a> PLoS Pathogens. 12, e1005828(2016).</li>
<li>Dai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+light+rescues+mice+from+potentially+fatal+Pseudomonas+aeruginosa+burn+infection%3A+efficacy%2C+safety%2C+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Blue light rescues mice from potentially fatal Pseudomonas aeruginosa burn infection: efficacy, safety, and mechanism of action.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 57 (3), 1238-1245 (2013).</li>
<li>de Sousa, D. L., Lima, R. A., Zanin, I. C., Klein, M. I., Janal, M. N., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+twice-daily+blue+light+treatment+on+matrix-rich+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effect of twice-daily blue light treatment on matrix-rich biofilm development.</a> PLoS One. 10 (7), e0131941(2015).</li>
<li>Fontana, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antibacterial+effect+of+photodynamic+therapy+in+dental+plaque-derived+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Periodontal+Research%22%5BJournal%5D)">The antibacterial effect of photodynamic therapy in dental plaque-derived biofilms.</a> Journal of Periodontal Research. 44 (6), 751-759 (2009).</li>
<li>Donlan, R. M., Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+survival+mechanisms+of+clinically+relevant+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms.</a> Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).</li>
<li>Panariello, B. H. D., Klein, M. I., Pavarina, A. C., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+genes+TEC1+and+EFG1+in+Candida+albicans+influences+extracellular+matrix+composition+and+biofilm+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Inactivation of genes TEC1 and EFG1 in Candida albicans influences extracellular matrix composition and biofilm morphology.</a> Journal of Oral Microbiology. 9 (1), 1385372(2017).</li>
<li>Gulati, M., Lohse, M. B., Ennis, C. L., Gonzalez, R. E., Perry, A. M., Bapat, P., Valle Arevalo, A., Rodriguez, D. L., L, D., Nobile, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+culturing+and+screening+of+Candida+albicans+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In vitro culturing and screening of Candida albicans biofilms.</a> Current Protocols in Microbiology. 50 (1), e60(2018).</li>
<li>Roberts, A. E., Kragh, K. N., Bjarnsholt, T., Diggle, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+limitations+of+in+vitro+experimentation+in+understanding+biofilms+and+chronic+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The limitations of in vitro experimentation in understanding biofilms and chronic infection.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (23), 3646-3661 (2015).</li>
<li>Kucharíková, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., Bujdáková, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detailed+comparison+of+Candida+albicans+and+Candida+glabrata+biofilms+under+different+conditions+and+their+susceptibility+to+caspofungin+and+anidulafungin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin.</a> Journal of Medical Microbiology. 60 (Pt 9), 1261-1269 (2011).</li>
<li>Weerasekera, M. M., Wijesinghe, G. K., Jayarathna, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+media+profoundly+affect+Candida+albicans+and+Candida+tropicalis+growth%2C+adhesion+and+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias++Do++Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Culture media profoundly affect Candida albicans and Candida tropicalis growth, adhesion and biofilm development.</a> Memórias Do Instituto Oswaldo Cruz. 111 (11), 697-702 (2016).</li>
<li>Kadosh, D., Johnson, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+the+Candida+albicans+filamentous+growth+program+by+relief+of+transcriptional+repression%3A+a+genome-wide+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Induction of the Candida albicans filamentous growth program by relief of transcriptional repression: a genome-wide analysis.</a> Molecular biology of the cell. 16 (6), 2903-2912 (2005).</li>
<li>Paschoal, M. A., Lin, M., Santos-Pinto, L., Duarte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+antimicrobial+chemotherapy+on+Streptococcus+mutans+using+curcumin+and+toluidine+blue+activated+by+a+novel+LED+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Medical+Science%22%5BJournal%5D)">Photodynamic antimicrobial chemotherapy on Streptococcus mutans using curcumin and toluidine blue activated by a novel LED device.</a> Lasers in Medical Science. 30 (2), 885-890 (2015).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Başarılı C. albicans biyofilm kültürü için en kritik adımlar şunlardır: 1) öncesi inoculum ve inoculum ile 100 mM glikoz; tamamlanmaktadır YNB orta yapmak 2) 90 dk yapışma aşama için dikkatli bir şekilde iki kez wells %0,89 ile yıkayın için beklemek NaCl hücrelerin; non yapıştırılır kaldırmak için ve 3) RPMI orta RPMI hif büyüme teşvik edecek bu yana biyofilm oluşumu, başlatmak için yapıştırılan hücrelere eklemek için. Aneuploidies C. albicanskültür oluşabilir. Sonuç olarak, fazla yedi gün 4 ° C'de ve h...

Diyabet, immünsüpresif tedavi uygulamaları, HIV enfeksiyonu, AIDS salgınının, invaziv klinik yordamlar ve son yıl içinde geniş spektrumlu antibiyotik tüketimi artan insidansı Candida albicans insidansı artmıştır hastalıkları1,2ilgili. C. albicans enfeksiyonları sık biyofilm geliştirilmesi için ilgili ve kandidiyazis veya candidemia1,2gibi sistemik bulgular gibi klinik bulgular neden olabilir. Bir biyofilm büyümenin en önemli virülans faktörlerin ekstraselüler polisakkarit matris olarak tanımlanmıştır. Biyofilm oluşumu için varolan antifungal ilaçlar, çevresel stres ve konak immün mekanizmalar3direncini artırmak için işbirliği yapmaktadır.
C. albicans biyofilm büyüme maya hücreleri substrat yüzey ve hyphal büyüme yoluyla yayılması ve ardından bir substrat erken bağlılığı planktonik hücre ile başlar. Son biyofilm büyüme neyin maya benzeri geliştirme bastırılır, hyphal geliştirme genişletir ve hücre dışı matriks biyofilm4içine alır olgunlaşma aşama aşamadır. C. albicans exopolysaccharides (EPS) matris mannan-glukan karmaşık5,6oluşturmak için etkileşim. Exopolysaccharides etkileşim biyofilmler uyuşturucu7karşı savunma için önemlidir. Bu nedenle, EPS C. albicans hücre dışı matriks gelen azalma oral kandidiyaz denetim için yeni antibiofilm protokolleri gelişimini desteklemek.
Fotodinamik antimikrobiyal kemoterapi (anlaşma) bir antimikrobiyal olarak uygulanmış ve ışık büyüme, gelişme ve çeşitli organizmalar8 davranışını düzenler. ANLAŞMA belirli bir dalga boyu ve bir ışık emici photosensitizer9görünür ışığında uygular. Ancak, dezenfeksiyon biyofilm Penetran zorlukları alt etkinlik10neden vardır. Terapötik ajanlar başarısızlığı tamamen biyofilmler sızmaya biyofilmler geleneksel antimikrobiyal tedavi3,5zaman zaman karşı koymak bir nedenidir. Kapalı mikrobiyal hücreleri devre dışı bırakmak hücre dışı matriks nüfuz antimicrobials gerekir; Yine de, EPS düzeylerini taşıma biyofilm içine isteyen veya matris kendisi ile antimikrobiyal yanıt11etkileyen böyle moleküller için diffusional bir engel karakterize.
ANLAŞMA dezavantajları göz önüne alındığında, ışık tek başına kullanımı değerli bir gelişme olarak ortaya çıkıyor. Tedavi günde iki kez mavi ışık ile önemli ölçüde üretiminde EPS çözünmez Streptococcus mutans çoğunlukla biyofilm inhibe ön veriler saptandı. EPS çözünmez azalma tarafından mavi ışık biyofilm büyüme azalmış. Yine de, kırmızı ışık C. albicans biyofilmler kullanarak fototerapi sonucunu azdır. Bu nedenle, bu soruşturmanın amacı büyüme ve C. albicans biyofilm düzenlenmesi kırmızı ışık kullanarak ne şekilde fototerapi etkiler değerlendirmek için oldu. İki kez günlük tedavi için biz canlılığı, ilgili yanıtları sağlayan bir kolay ve tekrarlanabilir biyofilm modeli sağlamak için bizim laboratuvar 's önceki iletişim kuralları9,12 adapte kuru ağırlık ve ekstraselüler polisakkaritler kırmızı ışık tedavisi. sonra tutarları Aynı iletişim kuralını diğer tedaviler test etmek için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>Kloreksidin% 20 & nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9394</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroz (D-Glikoz) Susuz</td><td>Fisher Kimyasal</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 200 kanıt</td><td>Decon Laboratuvarları</td><td>DSP-MD.43</td><td></td></tr><tr><td>LumaCare LC-122 A ve nbsp;</td><td>LumaCare Tıp Grubu, Newport Beach, CA, ABD&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>Kimyasal S641-500</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Fisher Biyoreaktifleri&nbsp;</td><td>BP 359-500</td><td></td></tr><tr><td>Fenol %5</td> <td>Milipore Sigma</td><td>843984</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640, kloramfenikol ile desteklenmiş 3- (N-morfolino)</td> <td>Sigma</td><td>R7755</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud dekstroz agar ile tamponlanmış, kloramfenikol</td><td>Acumedia</td><td>7306A</td><td></td></tr><tr><td>Sülfürik asit ile</td> desteklenmiş;<td>Fisher Chemical</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Maya azot bazı&nbsp;</td><td>Difco</td><td>DF0392-15-9</td><td></td></tr><tr><td>3- (N-morfolino) propansülfonik asit MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr> <tr><td>&nbsp; 24 oyuklu polistiren plaka&nbsp;</td><td>Şahin</td><td>353935</td><td></td></tr></tbody></table>

kırmızı ışık düzenlemek candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Burada, başına harcırah kırmızı ışık tedavi Candida albicans biyofilm büyüme üzerine sonuçlarını değerlendirmek için bir protokol mevcut. C. albicans SN425 planktonik büyüme artırmak için Maya azot Bankası medyada inoculums büyüdü. Biyofilm oluşumu için amino asit yüksek konsantrasyonda var, RPMI 1640 medya biyofilm büyüme yardımcı olmak için uygulandı. 48 h biyofilmler tutarlı olmayan bir ışık cihazı ile günde 1 dk süreyle tedavi (kırmızı ışık; dalga boyu 635 = nm; enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2=). Olumlu denetim (PC), % 0.12 klorheksidin (CHX) uygulandı ve bir negatif kontrol (NC), %0.89 NaCl biyofilmler için uygulandığı gibi. Birimleri (CFU), oluşturan colony kuru ağırlık, çözünür ve çözünmez exopolysaccharides tedaviler sonra sayısal. Kısaca, burada sunulan iletişim kuralı basit, tekrarlanabilir ve canlılığı, ilgili yanıtlar kırmızı ışık tedavisi. sonra kuru ağırlık ve ekstraselüler polisakkarit tutarları sağlar

Şekil 2 görüntüler sonuçları günlük10 C. albicans CFU/mL kırmızı ışık ile başına yolculuğunu tedaviler sonra 1 dk. kırmızı ışık günlük10 CFU/mL NC karşılaştırıldığında önemli ölçüde azaltılmış (p = 0,004). Şekil 3 günlük tedaviler sonra C. albicans biyofilmler biyokütle (mg) sonuçlarını sunar. Tüm gruplar için NC göre biyolojik kütle gösterdi tedavi (p = 0.000) ve kırmızı ışık içinde belgi...

Burada, Candida albicans biyofilm büyüme üzerine kırmızı ışık uygulama sonucu değerlendirmek için bir protokol mevcut. 635 nm dalga boyu ve enerji yoğunluğu 87.6 J·cm-2 , tutarlı olmayan kırmızı ışık aygıtla Candida albicans biyofilmler 48 h için büyüme boyunca uygulandı.

Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Candida immünosyonlu konaklarda yaygın mantar enfeksiyonunun en sık nedenidir. Terapötik ajanların matris yüzünden biyofilme tam olarak sızmaması, biyofilmlerin geleneksel tedavilere direnmesinin nedenlerinden biridir. Protokolümüz, kırmızı ışıkta kullanarak fototerapinin Candida albicans biyofilmlerinin büyümesini ve düzenlenmesini nasıl etkilediğini değerlendiriyor.Bu çalışmada kullanılan gerinim in hücre dışı matriks karakterize olduğundan ve ışık cihazı diğer planktonik mikroorganizma süspansiyonlarına ve biyofilmlere başarıyla uygulandığından, uygulanan yöntemler iyi belirlenmiştir. Bu cihazın en büyük avantajı tedavi süresinin azalmasıdır, bu da onu klinik uygulamalar için daha görünür hale getirir. Candida albicans culturing zaman antikorlar elde edilebilir farkında olun.Bu nedenle, yedi günden eski koloniler kullanmamak, plakaları dört santigrat derecede başlatmamak ve mevcut plakalardan hücreleri yeniden çizgile mesken etmemek önemlidir. Aynı şekilde, bir gerginlik bir gecede büyüme 18 saat önce kullanılmalıdır. İlk kez bir spektrofotometre kullanırken, optik yoğunluk değerleri ile ilişkilendirmek için, ilk birim sayıları koloni çiftlik elde etmek önemlidir.Bu nedenle, deneyler mililitre başına 10 ila yedi hücrenin ilk hücre konsantrasyonunda büyüme fazının ortasını kullanmaya başlayacaktır. Bu hücre konsantrasyonunun en bağımlı ve kararlı madde biyofilmlerini sağladığı gösterilmiştir. Başlamak için, SDA 65 gram askıya, Kloramphenicol litre başına 50 miligram ile takviye, içinde 1, bir kabın distile su mililitre.Orta yıtamamen eritmek için kabı kaynamak için bir ısıtıcının üzerine yerleştirin. Sonra bir cam şişe için medya aktarın. Şişe üzerine kapağı yerleştirin, ama şişe havalandırma yapabiliyor sağlamak için tamamen vida yok.Çözeltiyi 15 PSI ve 121 santigrat derecede 30 dakika sterilize etmek için şişeyi bir otoklava yerleştirin. Yaklaşık 45 santigrat derece ye kadar çözeltiyi soğutun. İyi karıştırmak için tek kullanımlık, steril pipet ve steril Petri plakaları içine SDA 20 mililitre pipet kullanın.YNB orta hazırlamak için, 100 milimolar glikoz ile takviye, mix 6.7 YNB gram ve dekstroz 1, bir beher ultra saf su mililitre 18 gram. Kabın içine bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırmak için bir karıştırmak için bir karıştırma kayış üzerine beher koyun. Sterilize etmek için ortamı 0,22 mikrometrelik vakum filtre sisteminden filtreleyin.RPMI-1640 10,4 gram ve MOPS 34 gram karıştırarak RPMI orta hazırlayın, ultra saf su 1.000 mililitre. Isı olmadan bir karıştırıcı karıştırın ve normal bir sodyum hidroksit ekleyerek PH yedi ayarlayın. 0,22 mikrometrevakum filtre sistemi kullanarak ortamı sterilize edin.İlk olarak, ortam sıcaklığında Mikroorganizma Candida albicans SN 425 çözülme. Kloramfenikol ile desteklenen, Daha önce hazırlanmış SDA içeren Petri kapları üzerinde stop kültürünün 10 mikrolitre tohum. Petri yemeklerini aerobik olarak 37 derecede 48 saat kuluçkaya yatırın.Pre-inoculum için Petri kaplarından Candida albicans 10 kolonileri almak ve 10 ynb orta mililitre içeren bir santrifüj tüp içine yerleştirin steril bir madeni kullanın, glikoz ile birlikte. Tüpü aerobik olarak 37 derecede 16 saat kuluçkaya yatırın. Daha sonra, taze YNB orta içine bu başlangıç kültürü ekleyerek inoculums hazırlamak, glikoz ile desteklenen, seyreltme için bir ila 10 oranında.540 nanometre de ilk OD ölçmek için spektrofotometre kullanın. Inokülleri aerobik olarak 37 santigrat derecede sekiz saat kuluçkaya yatırın ve son OD'yi 540 nanometrede ölçün. İnoküllerin OD'sinin orta günlük büyüme aşamasında olup olmadığını kontrol etmek için ilk OD'den son OD'yi çıkarın.Mililitre başına yedi hücreye 10 tane bir inokül elde etmek için, inoculumu 5 dakika 5,500 kez G.'de sentrifuge sodyum hipoklorit içeren bir kabın içine dökün ve inoculumu önceki hacmin yarısına yoğunleştirmek için taze YNB ekleyin. 24 kuyu polistiren plakanın her kuyuya bir mililitre inokül ekleyin. 37 derecede 90 dakika boyunca aerobik olarak kuluçkaya yatırın ve hücrenin kuyuların dibine yapışmasını bekleyin.Pozitif kontrol biyofilmleri için biyofilmleri bir mililitre %0.12 klorheksidin ile bir dakika tedavi edin. Negatif kontrol için, bir dakika boyunca biyofilmleri bir mililitre steril, %0.89 sodyum klorür ile tedavi edin. Daha sonra, yapışık olmayan hücreleri kaldırmak için steril 0,89% sodyum klorür bir mililitre ile, iki kez, bir dakika her kuyuyı yıkayın.Daha sonra tutarlı olmayan bir kırmızı ışığı açın ve ışığın güç yoğunluğunu ölçmek için bir güç ölçer kullanın. Santimetre kare başına 87,6 joule enerji yoğunluğu gereksinimine göre pozlama süresini belirleyin. Plakayı kırmızı ışığın altına yerleştirin.Numunenin ısınmasını önlemek için ışık kaynağı ile biyofilm arasındaki mesafeyi beş mililitreye kadar tutun. Bir dakika maruz kaldıktan sonra, her kuyuya bir mililitre sterilize RPMI ortamı ekleyin ve tabakları gece boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Sabahları, rpmi orta ile altı saat boyunca aynı yıkama, ışık tedavisi, pozitif ve negatif kontrol tedavileri ve kuluçka tekrarlayın.Yine, biyofilmleri iki kez yıkayın, kırmızı ışığa maruz kınıyor ve pozitif ve negatif kontrol uygulamaları yapın. Kuyularda çözelti aspire ve RPMI orta ekleyin. 48 saatlik biyofilm gelişimine ulaşana kadar kuluçka, yıkama, ışık tedavisi ve pozitif ve negatif kontrol tedavilerini tekrarlayın.Işleme başlamak için, orta atın ve steril bir mililitre ekleyin, kuyuya% 0.89 sodyum klorür, ve kuyudan biyofilm çizik için bir pipet ucu kullanın. Çıkarılan biyofilmi steril bir tüpe aktarın. Bir mililitre steril, %0.89 sodyum klorür daha ilave edin.Tekrar çizin ve aynı tüp için süspansiyon ekleyin, 2 mililitre toplam hacmi için. Bir dakika lığına biyofilm süspansiyonuna şiddetle girdap. CFU analizi için, biyofilm süspansiyonundan her seyreltme için %0,89 sodyum klorür çözeltisi içeren 900 mikrolitrelik bir mikro santrifüj tüpüne 0,1 mililitrelik bir aliquot aktarın.Biyofilm çözeltisini 10'dan negatif e, 10'dan negatif dörde, tuzlu çözeltide seyreltin. SDA plakaları için her seyreltme 50 mikrolitre tohum ve 48 saat boyunca 37 santigrat derece plakalar kuluçka. Kolonileri say ve formülü uygulayın.Kuru ağırlık analizi için, ilk tartmak ve etiket mikro santrifüj tüpler. Tüplere 0,1 mililitre biyofilm süspansiyonu ve bir mililitre mutlak etanol ekleyin ve 18 saat boyunca negatif 20 santigrat derecede saklayın. Sonra, 10 dakika için 10,000 kez G santrifüj.Supernatant atın ve bir hafta boyunca örnekleri kurutmak için bir kurutucu tüpler yerleştirin. Mikro santrifüj tüplerini tekrar tartın ve biyokütle ağırlığını elde etmek için çıkarma yapın. Bu deneyde, Candida albicans biyofilmbir dakika için kırmızı ışık ile diem tedaviler başına sonra, CFU sodyum klorür ile tedavi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, azaltıldı.Candida albicans biyokütlesinin günlük tedaviler sonrası elde edilen sonuçları, kırmızı ışıktedavi edilen grubun klorheksidin ile tedavi edilen pozitif kontrol grubunda gözlenen biyokütlede benzer bir azalma gösterdiğini göstermektedir. İki grup da birbiriyle istatistiksel benzerlik gösterdi. Her ikisi de biyokütle azalma gösterdi iken, sodyum klorür ile tedavi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında.Düşük miktarda Candida albicans çözünür ve çözünmez EPS, pozitif kontrol gözlendi, negatif kontrol ile karşılaştırıldığında. İstatistiksel olarak anlamlı olmasa da, kırmızı ışığın diem uygulaması başına eps çözünür ve EPS çözünmez miktarlarını sayısal olarak azalttı. Negatif kontrol ve kırmızı ışık tedavi grubu, istatistiksel benzerlik gösterdi.Uygulamanın tam sürelerini belirlemek için tedaviye başlamadan önce bir güç ölçer kullanarak ışığın güç yoğunluğunu ölçmek. Bu adımlar, enerji yoğunluğunun her zaman santimetre karesi olan 87,6 joule olmasını garanti ediyor. Daha önce atıfta bulunulan formülü kullanın.Ölçüm, ışıktan plakaşişesine kadar beş milimetre lik bir ölçüm le yapılır. Fototerapi ve antifungal ilaçlar arasındaki bir ilişki kırmızı ışık ile ön tedavi, ilaç uygulaması takip kontrol etmek için incelenebilir, biyofilm içine ilaç penetrasyonu artırır. Günde iki kez tedavi için, kırmızı ışık tedavisinden sonra canlılık, kuru ağırlık ve hücre dışı polisakkarit miktarları ile ilgili cevaplar veren kolay ve tekrarlanabilir biyofilm modeli sağlayarak laboratuvarımızın protokollerini uyarladık.Protokol geneldir ve kırmızı ışığa ek olarak, ilaçlar, diğer ışıklar veya ışık ve ilaçların kombinasyonu da dahil olmak üzere diğer tedavileri test etmek için kullanılabilir. Mikroorganizmalarla çalışmak için güvenlik gözlükleri, düğme laboratuvar önlüğü ve nitro eldivenler gibi özel ekipmanlar gerekmektedir.

daily-phototherapy-with-red-light-to-regulate-candida-albicans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz 3D nano-biyofilm oluşan yüksek yoğunluklu mikroarray platformu...

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Kaynak: Zhao, K. ve diğerleri. 5-aminolevulinik asit aracılı fotodinamik tedavinin Staphylococcus aureus biyofilmi üzerindeki etkisini incelemek için in vitro model. J. Vis. Exp. (2018)Video, Gram-pozitif bakteriyel biyofilmler üzerindeki antibakteriyel etkileri değerlendirmek için fotodinamik bir tedavi protokolünü gösteriyor. Biyofilmler dört gruba ayrılır: ikisi fotosensitator öncül alır, ikisi ise bir tampon alır. Hepsi karanlıkta kuluçka yapılır, ardından bir öncül işlenmiş gruba ve bir...

Fotosensitator öncüsü kullanılarak bakteriyel biyofilmlerin ışıkla aktif tedavisi

Candida albicans biyofilmlerinin iç özelliklerini görüntülemek ve ölçmek için, kırılma indisi eşleştirmesi ile açıklığa kavuşturulan sabit bozulmamış numuneler hazırlıyoruz. Daha sonra, optik kesit mikroskopisi biyofilmin tam kalınlığı na rağmen üç boyutlu görüntü verilerini elde etmek için kullanılabilir.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

İlaca dirençli Candida albicans'ın artan insidansı dünya çapında ciddi bir sağlık sorunudur. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı savaşmak için bir strateji sunabilir. Bu protokol, in vitro olarak çoklu ilaca dirençli C. albicans suşu üzerinde Gül bengal aracılı aPDT etkinliğini tanımlamaktadır.

Candida albicans'ı İnhibe Etmek için Gül Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi

Antikorların C. tropicalis tarafından oluşturulan biyofilmler üzerindeki etkilerini incelemek için 2,3-bis (2-metoksi-4-nitro-5-sülfofenil)-5-karboksanil-2H-tetrazolyum (XTT) indirgeme testi kullanan 96 kuyucuklu mikrotitrek plaka bazlı bir protokol burada açıklanmıştır. Bu in vitro protokol, potansiyel yeni antifungal bileşiklerin biyofilmlerdeki Candida türü hücrelerinin metabolik aktivitesi üzerindeki etkisini kontrol etmek için kullanılabilir.

Antikorların Candida tropicalis Biyofilmleri Üzerindeki Etkisini Değerlendirmek için Çözünür Tetrazolyum Bazlı İndirgeme Testi

Bu protokol, oral kandidiyazisin bir fare modelinde antimikrobiyal Fotodinamik Terapinin (aPDT) uygulanmasını açıklar. aPDT, suda çözünür bir kurkuminoid ve mavi LED ışık karışımı kullanılarak gerçekleştirildi.

Oral Kandidiyazisin Murin Modelinde Kurkuminoid Aracılı Antimikrobiyal Fotodinamik Tedavi

Candida spp. ilaç direncinde minyon kolonilerin önemi tam olarak araştırılmamıştır. Antimikrobiyal fotodinamik tedavi (aPDT), ilaca dirençli mantar enfeksiyonlarına karşı umut verici bir strateji sunmaktadır. Bu çalışma, gül bengal aracılı aPDT'nin Candida glabrata'yı etkili bir şekilde deaktive ettiğini ve küçük kolonileri indükleyerek benzersiz bir prosedür sunduğunu göstermektedir.

Rose Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi ile Candida glabrate'de Minyon Kolonilerin İndüksiyonu

405 nm mavi ışık LED cihazı, kolajen bazlı sentetik cilt modelinde değerlendirildiğinde geniş bir yara patojenlerine karşı antimikrobiyal etkinlik göstermektedir. Bu basitleştirilmiş in vitro yaklaşım, ışık temelli antimikrobiyal tedavilerin erken aşama değerlendirmesi için tekrarlanabilir ve etik açıdan uygulanabilir bir alternatif sunar.

Kolajen Bazlı Sentetik Cilt Modeli Kullanarak Yara Patojenlerini Bastırmak İçin Mavi Tışık LED Cihazının Araştırılması

Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem...

İzleme Oluşumu ve Antifungal Duyarlılık Testi için 96 Şey microtiter Levha tabanlı Yöntemi Candida albicans Biyofilmler

Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.

Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi

Keşfedin, Candida albicans biyofilm büyümesini 635 nm kırmızı ışık fototerapisi ile nasıl düzenleyebilirsiniz. Bu yöntem, biyofilm direncini kırmak ve klinik uygulamalar için tedavi süresini kısaltmak amacıyla geliştirilmiştir.

Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Daha fazla video keşfet