Name: Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Öğrenin, ekz-vivo konfokal mikroskopi ile fare lenf nodlarındaki T ve B hücrelerinin lokalizasyonunu görselleştirmeyi. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını ve floresan ilaçların biyodagılımını incelemek için güvenilir bir teknik sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma NIH (R01 AI43458 - H.L.W.) tarafından desteklenmiştir.

Protokol Harvard Tıp Fakültesi Hayvanlar Daimi Komitesi ve Brigham ve Kadın Hastanesi, protokol 2016N000230 tarafından onaylandı.
1. Deney için kullanılan fareler
<ol><li>Antikor karışımı nı yönetmek için B6 arka planında 8 haftalık erkek ve dişi fareler kullanın.</li>
	<li>Ex vivo bütün LN görüntülemenin muhabir farelere antikor karışımı uygulanmadan uygulanıp uygulanamayacağını belirlemek ve antijen ibraz da dahil olmak üzere mononükleer hücrelerin varlığını araştırmak için CX3CR1GFP1 GFP/WTCCR2RFP/WT farelerini kullanın hücreler ve fagositler ve LN'deki dağılımları. NOT: CX3CR1GFP/WTCCR2RFP/WT muhabiri farelerde sırasıyla CX3CR1 ve CCR2 organizatörleri kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ve kırmızı floresan protein (RFP) vardır. Muhabir fareler antikor karışımı enjeksiyonu ile veya olmadan kullanılabilir. Bir muhabir fare antikor karışımı enjeksiyon için referans4 bakın. Antikan enjekte edilmezse ameliyata devam edin.</li>
</ol>2. Antikor karışımı hazırlama ve enjeksiyon
NOT: Adım 1.1'de açıklanan fareler üzerinde bu adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Seyreltik 1:10 parlak menekşe (BV) 421 anti-CD4 (GK1.5; 0.2 mg/mL), 1:10 parlak mavi (BB) 515 anti-CD19 (1D3; 0.2 mg/mL) ve 1:20 phycoerythrin (PE) anti-F4/80 (T45-2342; 0.2 mg/mL) pbs uygun son hacmi ile iç uyluk içine enjekte etmek (için görüntü inguinal) veya pençe ped içine (görüntü popliteal için) lenf. NOT: İzotip olarak kullanın: BV421 Mouse IgG2b, k İzotip Kontrolü (R35-38; 0.2 mg/mL); PE Rat IgG2a, κ İzotip Kontrolü (R35-95; 0.2 mg/mL); BB515 Rat IgG2a, κ İzotip Kontrolü (R35-95; 0.2 mg/mL). Boyama antikor değiştirerek, doğru isotip kullanın.</li>
	<li>LN'yi görüntülemek için, antikor karışımının 100 μL'sini alttan iç uyluk içine enjekte edin (Şekil1A). Alternatif olarak, 50 μL'lik antikor karışımını pençe yastığına enjekte ederek popliteal LN (Şekil2A). Hassas 1 mL İnsülin şırıngalar kullanın, (İnsülin U-100) boyutu 0.30 mm × 13 mm (30 gauge × 1/2 inç) iğne ile. NOT: Inguinal LN boyama enjeksiyonunun subkutan olduğundan ve intraküler (i.m.) olmadığından emin olun, çünkü i.m. uygulaması yapılırsa antikor karışımı düzgün bir şekilde boşaltılmayacaktır.</li>
	<li>Antikor karışımı enjeksiyonundan önce hayvanları anestezi etmeyin.</li>
	<li>Organları çıkarmak için en az 3 saat (inguinal dLN) ve 12 saat (popliteal dLN) sonrası enjeksiyon için bekleyin.</li>
	<li>LN hücre etiketleme tamamen parlak menekşe veya parlak mavi gibi büyük polimer floresan boyalar kullanılarak gözlenen değilse, alternatif olarak floresan izotiyoyanat (FITC), PE ve allofikokokyanin (APC) dahil olmak üzere küçük floresan kullanın.</li>
</ol>3. Inguinal drenaj lenf düğümü kaldırmak için cerrahi prosedür
<ol><li>Co2 boğulma sıyrık ve ardından servikal çıkış kullanarak ötenazi fareleri.</li>
	<li>Yapışkan bant ile akrilik aşamada fareler immobilize ve kesi etrafında kürk birikimini önlemek için karın derisine bir pamuklu bez ile mineral yağ uygulayın (Şekil1B). Kürk kaldırma gerekli değildir.</li>
	<li>Mikrocerrahi kavisli makas (11,5 cm) ve mikrocerrahi kavisli forceps (12,5 cm) ile pubis'ten ksifoid sürecine kadar mikrocerrahi eğri kesit (Şekil1C)kullanarak orta hat kesisini gerçekleştirin.</li>
	<li>Karın kaslarını deriden ayırın ( Şekil1D).</li>
	<li>Dikey kesi hattının üst ve alt kısmında yatay deri kesileri yapmak ilgi tarafında deri flepleri oluşturmak için (antikor karışımı enjeksiyon tarafına göre) ve lenf düğümü görselleştirmek için cilt flep (Şekil1E).</li>
	<li>Cilt kapağını akrilik plakaya bantlayın (Şekil 1F).</li>
	<li>Mikrocerrahi kavisli forsepsler kullanarak inguinal drenaj lenf düğümü çıkarın (Şekil 1F). Lenf düğümü cilt altında bir transaklı, genellikle bilobular, küre olarak görünür.</li>
</ol>4. Popliteal drenaj lenf düğümü kaldırmak için cerrahi prosedür
<ol><li>Co2 boğulma sıyrık ve ardından servikal çıkış kullanarak ötenazi fareleri.</li>
	<li>Yapışkan bant ile akrilik aşamada eğilimli bir pozisyonda fareler immobilize ve buzağı ve diz bir pamuk lu bez ile mineral yağ uygulayın (Şekil2A-D).</li>
	<li>Topuktan dize kadar baldırda orta hat kesisi gerçekleştirin (Şekil 2E,F).</li>
	<li>Buzağı kaslarını deriden ayırın ( Şekil2F,G).</li>
	<li>Popliteal fossa maruz (Şekil 2G). Popliteal lenf nodu popliteal fossa bir transaklı küre olarak görünür.</li>
	<li>Mikrocerrahi kavisli forseps (Şekil2G)kullanarak popliteal lenf nodünü çıkarın.</li>
	<li>Alternatif olarak, fareyi supine pozisyonunda ters çevirin ve popliteal LN çıkarılması için pazı femoris ve semitendinosus arasındaki popliteal fossa'ya yaklaşArak baldırın topuktan dizine kadar olan kısmı ayrıştırMa deriden kas. NOT: Popliteal fossa diz ekleminin arkasında bulunan sığ bir depresyondur. Popliteal lenf düğümlerini görmek için dikkatlice açın.</li>
</ol>5. Lenf nodu hazırlığı
<ol><li>Tüm organı cam alt (35 mm x 10 mm) içeren bir kültür kabına yerleştirin ve mikrocerrahi kavisli forceps kullanarak organı çevreleyen yağı çıkarın (Şekil1G-I ve Şekil 2H).</li>
	<li>Yemeğin ortasındaki organı merkezileştirin (Şekil 1J ve Şekil 2H).</li>
	<li>Hassas görev silecekleri bir parça ile organ kapağı ve oda sıcaklığında tuzlu ile ıslatılmış tutmak 0.9% veya Fosfat Tampon Çözeltisi (Şekil1K-M ve Şekil 2H). NOT: Çıkarıldıktan sonra lenf bezlerinin yıkanması veya kaputta lenf nodunu çıkarılmasının yapılması gerekli değildir.</li>
</ol>6. Ex-vivo konfokal mikroskopi (Görüntüleme)
<ol><li>Petri kabını ters konfokal mikroskop yuvasına yerleştirin (Şekil 1N ve Şekil 2H).</li>
	<li>Bir konfokal mikroskop altında görüntü nns (Şekil 1O ve Şekil 2H).</li>
	<li>İlk olarak, 4x veya 10x hedefi ile konfokal mikroskobun konvansiyonel ışığını kullanarak doğru odak elde edin. Daha sonra ışık fonksiyonundan lazer moduna geçin. NOT: Konfokal mikroskop 4x nesnel içermiyorsa, odak 10x hedefi kullanılarak mükemmel bir şekilde elde edilebilir.</li>
	<li>Bu görsellerde gösterilen görüntülerde kullanılanlar gibi floresan etiketli antikorlardan otofloresan vespesifik olmayan lekeleri gidermek için izotip lekeli, lekeli veya floresan olmayan bir numune (Tablo 1) kullanarak lazer gücünü, mahsup ve kazancını ayarlayın el yazması (BV-421 anti-CD4, BB515 anti-CD19 ve PE anti-F4/80).</li>
	<li>Lenf düğümünde ilgi alanında sırasıyla mikrometrik ve savaş arabası kullanarak Z ve XY pozisyonlarını ayarlayın.</li>
	<li>LN yapısı ve hücresel dağılıma odaklanan 4x, 10x ve 20x hedefleri altında görüntüler edinin. 1024 x 1024 piksel tanımı kullanın. NOT: Hayvan başına amaç başına farklı alanlarda en az beş görüntü edinin.</li>
	<li>Kanalları ayırmak, ölçek ve ilgi çekici renkler eklemek ve 3B görünümü yeniden oluşturmak için görüntü yazılımını kullanarak görüntüleri analiz edin.</li>
</ol>

<ol><li>Willard-Mack, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+structure%2C+function%2C+and+histology+of+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal structure, function, and histology of lymph nodes.</a> Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).</li>
<li>Tas, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+antibody+affinity+maturation+in+germinal+centers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualizing antibody affinity maturation in germinal centers.</a> Science. 351, 1048-1054 (2016).</li>
<li>David, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+Mass+Cytometry+and+Imaging+Analysis+Reveals+Origin%2C+Location%2C+and+Functional+Repopulation+of+Liver+Myeloid+Cells+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Combination of Mass Cytometry and Imaging Analysis Reveals Origin, Location, and Functional Repopulation of Liver Myeloid Cells in Mice.</a> Gastroenterology. 151, 1176-1191 (2016).</li>
<li>Rezende, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gammadelta+T+cells+control+humoral+immune+response+by+inducing+T+follicular+helper+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">gammadelta T cells control humoral immune response by inducing T follicular helper cell differentiation.</a> Nature Communications. 9, 3151(2018).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+triple-fluorescent+mouse+strain+allows+a+dynamic+and+spatial+visualization+of+different+liver+phagocytes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Anais+da+Academia+Brasileira+de+Ciencias%22%5BJournal%5D)">Generation of a triple-fluorescent mouse strain allows a dynamic and spatial visualization of different liver phagocytes in vivo.</a> Anais da Academia Brasileira de Ciencias. 91 (suppl 1), e20170317(2019).</li>
<li>Ajami, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+mass+cytometry+reveals+distinct+populations+of+brain+myeloid+cells+in+mouse+neuroinflammation+and+neurodegeneration+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell mass cytometry reveals distinct populations of brain myeloid cells in mouse neuroinflammation and neurodegeneration models.</a> Nature Neuroscience. 21, 541-551 (2018).</li>
<li>Becher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+analysis+of+the+murine+myeloid+cell+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">High-dimensional analysis of the murine myeloid cell system.</a> Nature Immunology. 15, 1181-1189 (2014).</li>
<li>McElroy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+LYVE-1+antibody+to+image+dynamically+lymphatic+trafficking+of+cancer+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescent LYVE-1 antibody to image dynamically lymphatic trafficking of cancer cells in vivo.</a> Journal of Surgical Research. 151, 68-73 (2009).</li>
<li>Gerner, M. Y., Casey, K. A., Kastenmuller, W., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell+and+antigen+dispersal+landscapes+regulate+T+cell+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell and antigen dispersal landscapes regulate T cell immunity.</a> The Journal of Experimental Medicine. 214, 3105-3122 (2017).</li>
<li>Hauser, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+germinal-center+B+cell+migration+in+vivo+reveals+predominant+intrazonal+circulation+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Definition of germinal-center B cell migration in vivo reveals predominant intrazonal circulation patterns.</a> Immunity. 26, 655-667 (2007).</li>
<li>Allen, C. D., Okada, T., Tang, H. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+germinal+center+selection+events+during+affinity+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging of germinal center selection events during affinity maturation.</a> Science. 315, 528-531 (2007).</li>
<li>Arnon, T. I., Horton, R. M., Grigorova, I. L., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+splenic+marginal+zone+B-cell+shuttling+and+follicular+B-cell+egress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualization of splenic marginal zone B-cell shuttling and follicular B-cell egress.</a> Nature. 493, 684-688 (2013).</li>
<li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li>
<li>Cinamon, G., Zachariah, M. A., Lam, O. M., Foss, F. W. Jr, Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicular+shuttling+of+marginal+zone+B+cells+facilitates+antigen+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Follicular shuttling of marginal zone B cells facilitates antigen transport.</a> Nature Immunology. 9, 54-62 (2008).</li>
<li>Pereira, J. P., An, J., Xu, Y., Huang, Y., Cyster, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabinoid+receptor+2+mediates+the+retention+of+immature+B+cells+in+bone+marrow+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Cannabinoid receptor 2 mediates the retention of immature B cells in bone marrow sinusoids.</a> Nature Immunology. 10, 403-411 (2009).</li>
<li>Nakagaki, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+metabolic+shifts+during+neonatal+development+reprogram+liver+identity+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Immune and metabolic shifts during neonatal development reprogram liver identity and function.</a> Journal of Hepatology. (6), 1294-1307 (2018).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Roozendaal, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conduits+mediate+transport+of+low-molecular-weight+antigen+to+lymph+node+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Conduits mediate transport of low-molecular-weight antigen to lymph node follicles.</a> Immunity. 30, 264-276 (2009).</li>
<li>Sarder, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-near-infrared+multiphoton+microscopy+interrogates+intact+tissues+at+deeper+imaging+depths+than+conventional+single-+and+two-photon+near-infrared+excitation+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">All-near-infrared multiphoton microscopy interrogates intact tissues at deeper imaging depths than conventional single- and two-photon near-infrared excitation microscopes.</a> Journal of Biomedical Optics. 18, 106012(2013).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Moleküler biyoloji ve yüksek boyutlu immünofenotiotipleme de dahil olmak üzere diğer teknikler ile görüntüleme kombinasyonu kendi doğal bağlamda bağışıklık hücrelerini araştırmak için yeteneğimizi geliştirdi. Aslında, diğer yaklaşımlar doku sindirimi ve hücre izolasyonu gerektirebilir iken - doku bütünlüğünün kaybına yol açabilir - in vivo veya ex vivo görüntüleme kullanımı coğrafi bir şekilde farklı hücre alt tipleri araştırmada büyük bir avantaj sağlar3 , 16. H...

Lenf düğümleri (LNs) doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtları köprü önemli işlevi ile vücutta yaygın olarak mevcut oval şekilli organlardır. NNs yabancı parçacıklar ve kanserli hücreleri tanımlamak için onlara karşı bir bağışıklık yanıtı monte etmek için lenf filtre1. Antijen sunan hücreler (AAP' ler), T hücreleri ve B hücreleri yabancı parçacıkları ve kanserli hücreleri ortadan kaldırmak için antijene özgü antikorlar (humoral bağışıklık) ve sitotoksik lenfositler (hücresel bağışıklık) oluşturmak için birlikte çalışır2. Böylece, lenfatik sistemde mevcut bağışıklık hücrelerinin dinamikleri anlamak aşı gelişimi ve kanser immünoterapisi için önemli etkileri olacaktır.
Yeni konfokal ve süper çözünürlüklü mikroskoplar da dahil olmak üzere güçlü mikroskopların ortaya çıkışı, farklı bağışıklıkhücre popülasyonlarının doğal ortamlarında nasıl davranışlarını anlamada olağanüstü bir ilerleme sağladı 3. Floresan proteinleri belirlihedeflerinkontrolü altında ifade eden genetiği değiştirilmiş farelerle sondaların bir kombinasyonunu kullanarak birkaç eşzamanlı hücre alt tipini görüntülemek artık mümkün . Aslında, kitle sitometri ve multi-parametrik akış analizi de dahil olmak üzere yüksek boyutlu teknikler, sağlık ve hastalık 6 farklı bağışıklık hücresi bölümleme ve işlevsellik hakkındaki bilgimizi genişletmek için çok önemli olmuştur6, 7. Ancak, bu teknikler için örnek hazırlamak için, dokular sindirim gerekir ve hücreler hücre süspansiyonları analiz edilecek doğal ortamdan ayrılır. Bu sınırlamaları aşmak ve biyolojide daha iyi bir çeviri sağlamak için, burada önerilen protokolün amacı gelişmiş hız, doku yararı ile stok konfokal mikroskoplar kullanarak ex vivo bütün lenf düğümleri görüntü için basit bir metodoloji uygulamaktır konvansiyonel immünoffloresan boyama ile karşılaştırıldığında yapı koruma ve hücre canlılığı. Bu yaklaşımı kullanarak, γδ T hücreleri için eksik fareler göstermek başardık, Patojenlere karşı konak erken savunmadahil T lenfosit bir alt türü 4, yabani tip fareler ile karşılaştırıldığında folikülleri ve T hücre bölgeleri tehlikeye var. Bu bulgular, γδ T hücrelerinin lenfoid organların homeostazında ve humoral immün yanıtta kritik bir rol oynadığını gösterdiğimiz bir çalışma sürdürmemizi sağladı4. Ayrıca, bu protokol, sondalar ve antikorlar lenf düğümü ulaşmak için fizyolojik bir yol sağlar, onlar deri altı uygulanır ve doku lenfatik dolaşım yoluyla dağıtmak gibi, yerinde etiketleme kullanılan önceki raporlar üzerine bina lenfatik ilişkili yapıları görselleştirmek için antikorlar ile8,9, germinal merkezi dinamikleri10,11,12, ve hedefleri kolayca kan akışı için erişilebilir13 ,14,15.

<table><tbody><tr><td>BV421 anti-CD4</td><td>BD Horizon</td><td>562891</td><td>GK1.5; 0.2 mg mL -1</td></tr><tr><td>BB515 anti-CD19</td><td>BD Horizon</td><td>564509</td><td>1D3; 0.2 mg mL -1</td></tr><tr><td>BB515 Sıçan IgG2a, &kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD Horizon</td><td>564418</td><td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>BV421 Fare IgG2b, K İzotip Kontrolü</td><td>BD Horizon</td><td>562603</td><td>R35-38 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Cellview kültür kabı</td><td>Greiner-Bio</td><td>627861</td><td>35x10 mm cam tabanlı</td></tr><tr><td>İnsülin şırıngaları</td><td>BD Plastipak-İnsülin</td><td></td> <td>U-100</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimtech Bilim Markası</td><td>7557</td><td>boyut 21 x 20 cm / kutu başına 100 yaprak</td></tr><tr><td>Mikrocerrahi kavisli forseps</td><td>WEP Cerrahi Aletler</td><td>özel yapım</td><td>12,5 cm</td></tr><tr><td>Mikrocerrahi kavisli makas</td><td>WEP Cerrahi Aletler</td><td>özel yapım</td><td>11,5 cm</td></tr><tr><td>İğne</td><td>BD PrecisionGlide-30</td><td></td> <td>ölçer ve süreler; &frac12; inç</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Te + A1R konfokal kafa</td><td>Nikon</td><td>-</td> <td>ana 4 lazer çizgisi (405, 488, 543 ve 647 nm) ile yüklü</td></tr> <tr><td>PE anti-F4 / 80</td><td>BD Pharmigen</td><td>565410</td><td>T45-2342; 0.2 mg mL -1< / sup</td></tr><tr><td>>PE Sıçan IgG2a, & kappa; İzotip Kontrolü</td><td>BD Pharmigen</td><td>553930</td><td>R35-95; 0.2 mg mL-1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 konfokal mikroskop</td><td></td> <td>Ana 4 lazer çizgisi (405, 488, 543 ve 647 nm) ile</td> <td>Zeiss</td> yüklü</tr></tbody></table>

ex-vivo konfokal mikroskopi ile lenf nodal yapısı nın ve hücresel lokalizasyonun görselleştirilmesi

Visualizing Lymph Node Structure and Cellular Localization using Ex-Vivo Confocal Microscopy

Lenf düğümleri (LNs) organlar vücuda yayılmış, doğuştan gelen bağışıklık yanıtları adaptif bağışıklık ile bağlayabilirsiniz nerede. Aslında, LNs stratejik lenfdamarların yolunda interposed, LN tüm yerleşik bağışıklık hücreleri ile doku antijenleri samimi temas sağlayan. Böylece, hücresel kompozisyon, dağılım, yer ve etkileşim ex vivo bütün LN görüntüleme kullanarak anlamak vücudun yerel ve sistemik bağışıklık yanıtları koordine nasıl bilgi katacak. Bu protokol, geleneksel konfokal mikroskoplar ve stok reaktifleri kullanılarak çok tekrarlanabilir ve kolay bir metodoloji sağlayan floresan etiketli antikorların in vivo uygulamasının ardından bir ex vivo görüntüleme stratejisi göstermektedir. Antikorların deri altı enjeksiyonu ile, geleneksel immünoreskans mikroskobu tekniği ile potansiyel olarak zarar görebilir doku yapılarını etkilemeden, nn'lerin boşaltılmasında farklı hücre popülasyonlarının etiketedilmesi mümkündür.

Bu el yazması, bu organlardaki belirli hücre popülasyonlarını lekelemek için floresan etiketli antikorların enjeksiyonundan sonra yapılarına zarar vermeden inguinal ve popliteal lenf düğümlerini çıkarma tekniklerini göstermektedir (Şekil1 ve Şekil 2 ).
BV421 anti-CD4 ve BB515 anti-CD19 ve konfokal görüntüleme analizi ile LN hücrelerinin immünetiketleme güçlü kombinasyonu inguinal ve popliteal NNs T hücrelerinin lokalizasyonu tanımlana...

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Lymph nodes (LNs) are organs spread within the body, where the innate immune responses can connect with the adaptive immunity. In fact, LNs are ...

Bu tekrarlanabilir ve protokolü gerçekleştirmek kolay in-vivo lenf düğümü görüntüleme stratejisi lokal sekonder lenfoid organlara floresan etiketli antikorların drenaj izlemek için kullanır. Bu tekniğin gösterilmesi, protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesini kolaylaştıracak yordamın belirli bir görselleştirmesine olanak tanır. Bu herkes tarafından yapılabilir çok basit ve basit bir tekniktir.Tek zorlu yönü bazı eğitim gerektiren fare işleme, . Bu teknik, geleneksel floresan boyama yöntemlerine göre geliştirilmiş bir hız dokusu eforunun korunması ve hücre canlılığının yararınadır. Prosedürü niçin eğitime tabi tutulacağı, laboratuvarteknisyeni Bruna Tatematsu olacak.İlgi antikorları seyreltmek, uygun florofores konjuge, inguinal lenf nodu görüntüleme için PBS 100 mikrolitre, ya da popliteal lenf nodu görüntüleme için PBS 50 mikrolitre. Inguinal lenf nod görüntüleme için, bir mililitre insülin şırınga içine antikor kokteyl 100 mikrolitre yük, yarım inç iğne 30 gauge ile donatılmış, ve subkutan deneysel farenin iç uyluk içine antikorenjekte. Popliteal lenf nod görüntüleme için, deneysel hayvanın bir pençe ped içine subkutan olarak antikor kokteyl 50 mikrolitre enjekte.Sonra hayvanı ev kutusuna geri ver. Inguinal drenaj lenf düğümü hasat için, enjeksiyondan en az üç saat bekledikten sonra, yapışkan bant ile akrilik aşamada fare immobilize ve karın cilde mineral yağ uygulayın. Standart mikrocerrahi makas ve mikrocerrahi kavisli forceps pubis gelen ksifoid sürecine karın bir orta hat deri kesi yapmak ve deriden karın kas ayrıştırmak için kullanın.Enjeksiyon tarafında cilt flepleri oluşturmak için dikey kesi hattının üst ve alt kısmında yatay deri kesiler yapmak ve lenf düğümü görselleştirmek için cilt geri çekmek. Cilt flebini akrilik plakaya sabitle ve yarı saydam, genellikle bilobular küresel inguinal drenaj lenf nodu çıkarmak için forseps kullanın. Popliteal drenaj lenf düğümü hasat için, enjeksiyondan en az 12 saat sonra, akrilik aşamada eğilimli pozisyonda fare immobilize.Hayvanın enjekte edilen tarafında buzağı ve diz mineral yağ uygulayın. Daha sonra, topuktan diz e doğru baldırda bir orta hat kesi yapın ve baldır kaslarını deriden ayırın. Popliteal fossa ortaya çıkarmak.Popliteal lenf düğümü fossa içinde yarı saydam bir küre olarak görünür. Sonra, mikrocerrahi kavisli forseps ile lenf düğümü çıkarın. Görüntüleme için lenf düğümü hazırlamak için, bir cam alt ile 35 tarafından 10 milimetrelik kültür çanak tüm organları yerleştirin ve doku çevreleyen herhangi bir yağ kaldırmak için forseps kullanın.Yemeğin ortasında organ ortalayın ve tuzlu batırılmış hassas görev silecek bir parça ile doku kapağı. Ex vivo görüntüleme için, ters konfokal mikroskop yuvasında çanak konumlandırmak ve doğru odak elde etmek için konfokal mikroskop ve 4-10X objektif konvansiyonel ışık kullanın. Işık işlevinden lazer moduna geçin ve lazer gücünü ayarlamak için izotop lekeli, lekesiz veya floresan olmayan bir örnek kullanın, ofset, ve otomatik floresan ve herhangi bir belirtilmemiş boyama kaldırmak için kazanç.Lenf nodül yapısına ve hücresel dağılıma odaklanan ve 1024 x 1024 piksel tanımı nı kullanan 4, 10 ve 20X hedefleri altında görüntüler edinin. Ardından, kanalları ayırmak, ilgi alanı nın ölçeğini ve renklerini eklemek ve 3B görünümü yeniden oluşturmak için uygun bir görüntüleme analizi yazılımı programı kullanın. Anti-CD4 ve anti-CD19 antikorları ve konfokal görüntüleme analizi ile lenf nodül hücrelerinin immünetiketleme güçlü kombinasyonu inguinal lenf düğümleri içinde T ve B hücrelerinin lokalizasyonu sağlar.Popliteal lenf düğümlerinde, inguinal dokuda olduğu gibi, B hücre folikülleri T hücre popülasyonları ile çevrilidir, lenf nodunun bir özelliği. Bu görüntülerde de görüldüğü gibi fagositler enjekte edilen antikorları içselleştirmez, bu da B ve T hücre boyamasının spesifik olduğunu gösterir. Ayrıca, etiketlemenin yeniden rekonstrüksiyonu, T ve B hücre boyamanın örtüşmediğini gösterir ve bu da boyamanın özgüllüğünü doğrular.Monosellüler hücreler inguinal lenf düğümü boyunca gözlenir, subkapsüler sinüs de dahil olmak üzere. CX3XR1 ifade mononükleer hücrelerin çoğunluğu ile, CCR2 ve CXCR31CCR2 çift pozitif hücreleri izledi. Popliteal lenf nodunda hücre dağılımı ve hücre fenotiplerinin aynı paterni gözlenir.Her iki lenf düğümleri de lenfositler tarafından işgal mononükleer hücre reseptör ekspresyonu olmadan karanlık bölgeler sergiler. Ayrıca, mononükleer hücreler lenf düğümlerinin iç bölgesinde kıt, bu hücrelerin öncelikle lenf düğümü subkapsüler sinüs işgal gösteren, dokunun dış bölgelerinde konsantre kalan. Antikor karışımı tam olarak lenfatik sistem için deri altı doku içine enjekte edilmesi gerekir düzgün lenf düğümü ne antikorları drenaj.Bu yöntem floresan etiketli ilaçların biyodağıtımına ve floresan etiketli nano partiküllerin hücre hedefleme çalışmalarına uygulanabilir.

visualizing-lymph-node-structure-cellular-localization-using-ex-vivo

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı...

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Bu videoda, farenin arka bacaklarından popliteal drenaj lenf düğümlerini toplamak için bir diseksiyon tekniği gösterilmektedir. Lenf düğümleri, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasında köprü kurmada kritik bir rol oynar ve korunmuş bir doku yapısı ve hücresel canlılık ile sağlam lenf düğümlerinin toplanması, lokal ve sistemik bağışıklık tepkilerinin incelenmesine yardımcı olabilir.

Ex Vivo Görüntüleme için Murin Popliteal Drenaj Lenf Nodlarının Çıkarılması İçin Bir Diseksiyon Yöntemi

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Bu iletişim kuralı insan akciğer tümörü dilimleri içinde fluorescently eşleşmiş antikorlar ile etiketli görüntü ikamet tümör infiltre CD8 T hücreleri bir yöntem açıklanır. Bu teknik CD8 T hücre göç confocal mikroskobu kullanarak gerçek zamanlı analiz izin verir.

Ex Vivo İnsan akciğer tümörü içinde ikamet CD8 T lenfositlerin görüntüleme Confocal mikroskobu kullanma dilim

Bir protokol hafif levha floresan mikroskobu ile doku temizleme birleştirerek sunulmaktadır (LSFM) lenfatik damarlar ve lenf düğümleri üç boyutlu ve hücresel çözünürlük görüntüleri elde etmek için (LNs) beyin omurilik sıvısı toplama (BOS) ve spinal epidural sıvı.

IDISCO+ ve Hafif Sac Floresan Mikroskobu ile Vertebral Lenfatik Vaskülatür ve Drenajın Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada, birden fazla nörolojik hastalıkta önemli rol oynayan fare meningeal lenfatik damarlarının (MLV) değerlendirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolün amacı, hem izleyici drenajının işlevsel değerlendirmesini hem de dorsal MLV ağının ayrıntılı morfolojik karakterizasyonunu mümkün kılan entegre bir yöntem sağlamaktır.

Meningeal Lenfatiklerin Değerlendirilmesi İçin Entegre Protokol: Cisterna Magna enjeksiyonu, Lenf Düğümleri Görüntüleme, Meningeal Diseksiyon ve Bütün-Montaj Boyama

Öğrenin, ekz-vivo konfokal mikroskopi ile fare lenf nodlarındaki T ve B hücrelerinin lokalizasyonunu görselleştirmeyi. Bu yöntem, bağışıklık yanıtlarını ve floresan ilaçların biyodagılımını incelemek için güvenilir bir teknik sunar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet