Name: Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Keşfedin flavanondan flavonol biyosentezi için tek kaplı bienzimatik kaskad yöntemini. Bu protokol, biyokimya ve gıda biliminde endüstriyel uygulamalar için verimli, maliyet etkin ve kolay kontrol edilebilir bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Yangzhou Üniversitesi Özel Olarak Atanan Profesör Start-up Fonları, Jiangsu Özel Olarak Atanan Profesör Başlangıç Fonları, Jiangsu Eyaleti'ndeki Altı Yetenek Tepeleri Projesi (Grant No. 2014-SWYY-016) tarafından finanse edilen bir Proje tarafından finansal olarak desteklendi. Jiangsu Yüksek Öğretim Kurumlarının (VeterinerHenhenk) Öncelikli Akademik Program Gelişimi. Biz Flavonoidler HPLC ve MS analizleri için Yangzhou Üniversitesi Test Merkezi teşekkür ederiz.

<ol><li>Falcone Ferreyra, M. L., Rius, S. P., Casati, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoids%3A+biosynthesis%2C+biological+functions%2C+and+biotechnological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Flavonoids: biosynthesis, biological functions, and biotechnological applications.</a> Frontiers in Plant Science. 3, 222(2012).</li>
<li>Fang, F., Tang, K., Huang, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+of+flavonol+synthase+and+flavonol+contents+during+grape+berry+development%5BTitle%5D)+AND+%22European+Food+Research+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Changes of flavonol synthase and flavonol contents during grape berry development.</a> European Food Research and Technology. 237 (4), 529-540 (2013).</li>
<li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anthocyanins+and+flavonols+are+responsible+for+purple+color+of+Lablab+purpureus+%28L.%29+sweet+pods%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Anthocyanins and flavonols are responsible for purple color of Lablab purpureus (L.) sweet pods.</a> Plant Physiology and Biochemistry. 103, 183-190 (2016).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+flavonol-based+anti-prostate+cancer+agents%3A+Design%2C+synthesis%2C+and+evaluation+in+cell+models%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+%26+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">A new class of flavonol-based anti-prostate cancer agents: Design, synthesis, and evaluation in cell models.</a> Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 26 (17), 4241-4245 (2016).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Wnt+signaling+activity+for+growth+suppression+induced+by+quercetin+in+4T1+murine+mammary+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">Regulation of Wnt signaling activity for growth suppression induced by quercetin in 4T1 murine mammary cancer cells.</a> International Journal of Oncology. 43 (4), 1319-1325 (2013).</li>
<li>Kimura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidant+activities+and+structural+characterization+of+flavonol+O-glycosides+from+seeds+of+Japanese+horse+chestnut+%28Aesculus+turbinata+BLUME%29%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Antioxidant activities and structural characterization of flavonol O-glycosides from seeds of Japanese horse chestnut (Aesculus turbinata BLUME).</a> Food Chemistry. 228, 348-355 (2017).</li>
<li>Cassidy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+dietary+anthocyanin+and+flavonol+intakes+are+associated+with+anti-inflammatory+effects+in+a+population+of+US+adults%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Higher dietary anthocyanin and flavonol intakes are associated with anti-inflammatory effects in a population of US adults.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 102 (1), 172-181 (2015).</li>
<li>Chao, H. C., Tsai, P. F., Lee, S. C., Lin, Y. S., Wu, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Myricetin-Containing+Ethanol+Solution+on+High-Fat+Diet+Induced+Obese+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of Myricetin-Containing Ethanol Solution on High-Fat Diet Induced Obese Rats.</a> Journal of Food Science. 82 (8), 1947-1952 (2017).</li>
<li>Serban, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Quercetin+on+Blood+Pressure%3A+A+Systematic+Review+and+Meta-Analysis+of+Randomized+Controlled+Trials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Effects of Quercetin on Blood Pressure: A Systematic Review and Meta-Analysis of Randomized Controlled Trials.</a> Journal of the American Heart Association. 5 (7), (2016).</li>
<li>Nakagawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+memory+recall+by+quercetin+in+rodent+contextual+fear+conditioning+and+human+early-stage+Alzheimer%27s+disease+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Improvement of memory recall by quercetin in rodent contextual fear conditioning and human early-stage Alzheimer's disease patients.</a> Neuroreport. 27 (9), 671-676 (2016).</li>
<li>Muthukrishnan, S. D., Kaliyaperumal, A., Subramaniyan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+determination+of+flavonoids%2C+carotenoids+and+chlorophyll+concentration+in+Cynodon+dactylon+%28L.%29+by+HPLC+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Product+Research%22%5BJournal%5D)">Identification and determination of flavonoids, carotenoids and chlorophyll concentration in Cynodon dactylon (L.) by HPLC analysis.</a> Natural Product Research. 29 (8), 785-790 (2015).</li>
<li>Agar, O. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+Studies+on+Phenolic+Composition%2C+Antioxidant%2C+Wound+Healing+and+Cytotoxic+Activities+of+Selected+Achillea+L.+Species+Growing+in+Turkey%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Comparative Studies on Phenolic Composition, Antioxidant, Wound Healing and Cytotoxic Activities of Selected Achillea L. Species Growing in Turkey.</a> Molecules. 20 (10), 17976-18000 (2015).</li>
<li>Yang, R. Y., Lin, S., Kuo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content+and+distribution+of+flavonoids+among+91+edible+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22Asia+Pacific+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Content and distribution of flavonoids among 91 edible plant species.</a> Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition. 17, 275-279 (2008).</li>
<li>Tang, L. J., Zhang, S. F., Yang, J. Z., Gao, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Synthetic+Methods+of+Flavones%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New Synthetic Methods of Flavones.</a> Chinese Journal of Organic Chemistry. 24 (8), 882-889 (2004).</li>
<li>Lu, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+luteolin+and+kaempferol+%28author%27s+transl%29%5BTitle%5D)+AND+%22Yao+Xue+Xue+Bao%22%5BJournal%5D)">Synthesis of luteolin and kaempferol (author's transl).</a> Yao Xue Xue Bao. 15 (8), 477-481 (1980).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+Optimization+of+an+In+vitro+Multienzyme+Synthetic+System+for+Production+of+Kaempferol+from+Naringenin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Development and Optimization of an In vitro Multienzyme Synthetic System for Production of Kaempferol from Naringenin.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 66 (31), 8272-8279 (2018).</li>
<li>Malla, S., Pandey, R. P., Kim, B. G., Sohng, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regiospecific+modifications+of+naringenin+for+astragalin+production+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Regiospecific modifications of naringenin for astragalin production in Escherichia coli.</a> Biotechnology and Bioengineering. 110 (9), 2525-2535 (2013).</li>
<li>Zhu, S., Wu, J., Du, G., Zhou, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+synthesis+of+eriodictyol+from+L-tyrosine+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Efficient synthesis of eriodictyol from L-tyrosine in Escherichia coli.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (10), 3072-3080 (2014).</li>
<li>Trantas, E., Panopoulos, N., Ververidis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+engineering+of+the+complete+pathway+leading+to+heterologous+biosynthesis+of+various+flavonoids+and+stilbenoids+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Metabolic engineering of the complete pathway leading to heterologous biosynthesis of various flavonoids and stilbenoids in Saccharomyces cerevisiae.</a> Metabolic Engineering. 11 (6), 355-366 (2009).</li>
<li>Miyahisa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+biosynthesis+of+flavones+and+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combinatorial biosynthesis of flavones and flavonols in Escherichia coli.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 71 (1), 53-58 (2006).</li>
<li>Leonard, E., Yan, Y., Koffas, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+expression+of+a+P450+flavonoid+hydroxylase+for+the+biosynthesis+of+plant-specific+hydroxylated+flavonols+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+Engineering%22%5BJournal%5D)">Functional expression of a P450 flavonoid hydroxylase for the biosynthesis of plant-specific hydroxylated flavonols in Escherichia coli.</a> Metabolic Engineering. 8 (2), 172-181 (2006).</li>
<li>Koopman, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+production+of+the+flavonoid+naringenin+in+engineered+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">De novo production of the flavonoid naringenin in engineered Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 11, 155(2012).</li>
<li>Winkel-Shirley, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flavonoid+biosynthesis.+A+colorful+model+for+genetics%2C+biochemistry%2C+cell+biology%2C+and+biotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Flavonoid biosynthesis. A colorful model for genetics, biochemistry, cell biology, and biotechnology.</a> Plant Physiology. 126 (2), 485-493 (2001).</li>
<li>Duan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthesis+and+engineering+of+kaempferol+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Cell+Factories%22%5BJournal%5D)">Biosynthesis and engineering of kaempferol in Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbial Cell Factories. 16 (1), 165(2017).</li>
<li>Cheng, Q., Xiang, L., Izumikawa, M., Meluzzi, D., Moore, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+total+synthesis+of+enterocin+polyketides%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Enzymatic total synthesis of enterocin polyketides.</a> Nature Chemical Biology. 3 (9), 557-558 (2007).</li>
<li>Connolly, M. A., Clausen, P. A., Lazar, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+RNA+from+plant+tissue+using+trizol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of RNA from plant tissue using trizol.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+from+cells+and+tissues+by+Acid+phenol-guanidinium+thiocyanate-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA from cells and tissues by Acid phenol-guanidinium thiocyanate-chloroform extraction.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+cDNA+Libraries+Stage+1%3A+Synthesis+of+First-strand+cDNA+Catalyzed+by+Reverse+Transcriptase%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of cDNA Libraries Stage 1: Synthesis of First-strand cDNA Catalyzed by Reverse Transcriptase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directional+cloning+into+plasmid+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directional cloning into plasmid vectors.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Cloned+Genes+in+E.+coli+Using+IPTG-inducible+Promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Expression of Cloned Genes in E. coli Using IPTG-inducible Promoters.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Histidine-tagged+Proteins+by+Immobilized+Ni2%2B+Absorption+Chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Purification of Histidine-tagged Proteins by Immobilized Ni2+ Absorption Chromatography.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (1), (2006).</li>
<li>Halbwirth, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+flavonoid+enzyme+activities+in+tissues+of+fruit+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Measuring flavonoid enzyme activities in tissues of fruit species.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 4983-4987 (2009).</li>
<li>Prescott, A. G., Stamford, N. P., Wheeler, G., Firmin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+properties+of+a+recombinant+flavonol+synthase+from+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Phytochemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro properties of a recombinant flavonol synthase from Arabidopsis thaliana.</a> Phytochemistry. 60 (6), 589-593 (2002).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Pek çok çalışma, sağlık ve gıda endüstrisindeki potansiyel uygulamaları nedeniyle flavonollerin türemesi üzerine odaklanmıştır. Ancak, organik çözücüler ve kimyasal sentez kullanarak geleneksel bitki çıkarma flavonolüretiminde kullanımını kısıtlayan içsel dezavantajları vardır. Burada, bir in vitro bienzymatik kaskad kurarak bir tencerede bir flavanone flavonol üretmek için ayrıntılı bir yöntem rapor. Bu protokoldeki kritik adımlar şunlardır: 1) yüksek aktivite ile saf rekombinant enzimler elde ve 2) bir pot bienzimatik ...

Flavonoller bitki flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır ve bitkigeliştirme ve pigmentasyon 1,2,3katılır. Daha da önemlisi, bu bileşikler sağlık açısından yararlı faaliyetleri geniş bir yelpazede sahip, anti-kanser gibi4,5, anti-oksidatif6, anti-inflamatuar7, antiobezite8, anti-hipertansif9 , ve bellek hatırlama özellikleri10, bu bitki kaynaklı ikincil metabolitleri üzerinde çalışmalar çok sayıda yol açan. Geleneksel olarak, bu bileşikler esas olarak organik çözücüler kullanılarak bitki çıkarma elde edilir. Ancak, bitkilerde çok düşük içeriği nedeniyle11,12,13, en flavonoller için üretim maliyeti yüksek kalır, hangi sağlık ve gıda uygulamaları üzerinde büyük kısıtlamalar empoze Sanayi.
Son yıllarda, bilim adamları flavonoidler 14,15türetmek için yöntemler oldukça sayıda geliştirdik. Ancak, bu karmaşık moleküllerin kimyasal sentezi içsel dezavantajları çeşitli sahip16. Sadece toksik reaktifler ve aşırı reaksiyon koşulları gerektirir, ama aynı zamanda bir hedef flavonoid bileşik üretmek için birçok adım14,17. Ayrıca, bu stratejide bir diğer önemli sorun aktif flavonoid moleküllerin chiral sentezidir. Bu nedenle, kimyasal sentez ihrama yoluyla ticari bir ölçekte flavonoidler üretmek için ideal bir strateji değildir16,17.
Son zamanlarda, bilim adamları flavonoid biyosentez için bir yol ile mühendislik mikroplartarafından bu karmaşık doğal bileşikler üretmek için umut verici bir alternatif strateji geliştirdik18,19,20, 21.000 , 22, hangi başarıyla bitkilerde deşifre edilmiştir23. Örneğin, Duan ve ark kaempferol üretmek için tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisiae içine biyosentetik bir yol tanıttı (KMF)24. Malla ve ark.flavanone 3-hidroksilaz (f3h),flavonol synthase(fls1)ve UDP-glukoz:flavonoid 3-O-glukoziltransferaz UGT78K1 genleri ile tanıştırarak, glikozile flavonol, bir glikozile flavonol üretti Escherichia coliBL21(DE3)17. Oldukça az paradigma olmasına rağmen, tüm genetiği değiştirilmiş mikroplar hücresel bir platformun karmaşıklığı, yapay olarak sentezlenen genetik elementler ve konaklar arasındaki uyumsuzluk, inhibitör nedeniyle ilgi ürünleri üretmek konak hücrelere karşı hedef ürünlerin etkisi ve tasarlanmış bir hücresel sistemin kendisi istikrarsızlığı16.
Flavonoid üretimi için umut verici bir alternatif strateji in vitro multienzymatik bir basamak kurmaktır. Cheng ve ark. enterocin poliketides başarıyla bir pot25tam bir enzimatik yol montajı ile sentezlenebilir bildirdin. Bu hücre içermeyen sentetik strateji bir mikrobiyal üretim fabrikasının kısıtlamaları afordan ve böylece büyük miktardabazı flavonoidler üretmek için mümkün 16 .
Son zamanlarda, naringenin dönüştürmek için bir bienzim sentetik sistem geliştirdik (NRN) kmf içine bir pot16. Burada, bu sistemi büyük ayrıntılarla ve ürünlerin analizinde yer alan yöntemlerle tanımlıyoruz. Ayrıca bu sistemi eriodictyol'dan NRN ve quercetin (QRC) kmf üretmek için kullanan iki örnek salıyoruz. Buna ek olarak, flavonoidlerin biyosentezinde bu yöntemin önemli adımlarını ve gelecekteki araştırma yönlerini tartışıyoruz.

<table><tbody><tr><td>2 kez; Pfu MasterMix</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0717A</td> Agilent 1200 Serisi RRLC sistemi ile <td>yüksek kaliteli genlerin PCR amplifikasyonu</td></tr><tr><td>Agilent 6460 Üçlü Dört Kutuplu LC/MS sistemi</td><td>ile Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>HPLC/MS ile flavonoidlerin analizi için bir ekipman</td></tr><tr><td>Agilent MassHunter Workstation (sürüm B.03.01)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td><td>Agilent 6460 Üçlü Dört Kutuplu LC/MS sistemi ile Agilent 1200 Serisi RRLC sisteminden veri toplama yazılımı</td></tr><tr><td>dihidrokaempferol</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>91216</td><td>naringenin dihidroquercetin'den kaempferol üretmek için ara ürün</td></tr><tr><td></td><td>Sichuan İl Standart Madde Merkezi Çin Bitkisel Tıbbı</td> için <td>PCS0371</td><td>eriodictyol'dan quercetin üretmek için ara ürün</td></tr><tr><td>DNA Temizleme Kiti</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2301</td><td>PCR ile güçlendirilmiş veya jel ile saflaştırılmış DNA</td></tr><tr><td>eriodictyol</td><td>Shanghai Yuan Ye Biotechnology Co., Ltd.'nin saflaştırılması</td><td></td><td>Quercetin</td></tr><tr><td>Escherichia coli BL21 (DE3)</td> üretmek için B21160 <td>substratı</td><td>Hedef genleri ifade etmek için</td> <td>CW0809</td> bakteri suşu</tr><tr><td> Escherichia coli DH5 ve alfa;</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0808</td><td>plazmid proliferasyonu için bakteri suşu</td></tr><tr><td>FreeZone 1 Litre Tezgah Üstü Dondurarak Kurutma Sistemi</td><td>Labconco Corporation</td><td>7740020</td><td>organik çözücü içinde çözünmüş flavonoidlerin dondurularak kurutulması için bir ekipman</td></tr><tr><td>Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW2302</td><td>bir agaroz jelden bir DNA bandının saflaştırılması</td></tr><tr><td>Jel Görüntüleme Sistemi</td><td>Şanghay Tanon Bilim & Teknoloji Ltd. Şti.</td><td>Tanon- 2500</td>, bir <td>poliamid TLC plakası üzerinde bir agaroz jel veya flavonoid nokta üzerinde DNA bandının görselleştirilmesi için bir ekipman</td></tr><tr><td>GenElute Plazmid Miniprep Kiti</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC</td><td>PLN350-1KT</td>, <td>plazmitlerin mini hazırlığı,</td></tr><tr><td>kaempferol</td><td>Sigma-Aldrich Co., LLC</td>, <td>60010</td>, <td>nihai reaksiyon ürünü ve standart madde</td></tr>, <tr><td>MassHunter Quanlitative Analysis (versiyon B.01.04)</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>N/A</td>, <td>HPLC/LC/MS verilerinin analizi için bir yazılım</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-8000-GL</td>, <td>DNA / RNA konsantrasyonunun belirlenmesi için bir ekipman</td></tr><tr><td>naringenin</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC</td><td>N5893</td><td>kaempferol</td></tr><tr><td>Ni-IDA Agaroz Reçinesi</td> üretmek için substrat <td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0010</td><td></td></tr><tr><td>Hedef genlerin klonlanması ve eksprese edilmesi için</td>His etiketli füzyon proteinleri<td>pET-32a(+)</td><td>Novagen</td><td>69015-3</td></tr><tr><td>plazmidinin saflaştırılması plazmit dizilimi</td><td>GENEWIZ Suzhou</td><td>N/A</td><td>rekombinant plazmitlerin dizilimi</td></tr><tr><td>primer sentezi</td><td>GENEWIZ Suzhou</td><td>N/A</td><td>PCR primerlerinin sentezi</td></tr><tr><td>quercetin</td><td>Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co.,Ltd.</td><td>Q111273</td><td>son reaksiyon ürünü ve standart madde</td></tr><tr><td>SuperRT cDNA Sentez Kiti</td><td>Beijing CoWin Biotech Co., Ltd</td><td>CW0741</td><td>toplam RNA'dan cDNA'nın ilk zincirinin sentezi</td></tr><tr><td>T4 DNA Ligaz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0016</td> bir <td>ekin doğrusallaştırılmış bir vektör DNA'ya bağlanması</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td>toplam RNA'nın</td></tr> <tr><td>izolasyonuVector NTI Advance</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12605099</td><td>PCR primer tasarımı ve DNA dizi analizi için bir yazılımdır</td></tr><tr><td>Xcalibur v2.0.7</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td>, <td>HPLC verilerinin analizi için bir yazılım</td></tr></tbody></table>

bir flavanone bir flavonol biyosentezi bir-pot bienzymatik cascade kurarak

Biosynthesis of a Flavonol from a Flavanone by Establishing a One-pot Bienzymatic Cascade

Flavonoller çeşitli biyolojik ve farmakolojik aktivitelere sahip flavonoidlerin önemli bir alt sınıfıdır. Burada, bir flavonol in vitro enzimatik sentezi için bir yöntem sağlar. Bu yöntemde, Atf3h ve Atfls1, flavonollerin biyosentetik yolu iki anahtar genler, klonlanmış ve Escherichia coliaşırı ifade edilir. Rekombinant enzimler bir yakınlık sütunu ile saflaştırılır ve daha sonra belirli bir sentetik tampon da bienzimatik basamak kurulur. Bu sistemde iki flavonol örnek olarak sentezlenir ve TLC ve HPLC/LC/MS analizleri ile belirlenir. Yöntem diğer yaklaşımlar üzerinde flavonoller türeyen belirgin avantajlar görüntüler. Bu zaman ve emek tasarrufu ve son derece uygun maliyetli. Reaksiyonun doğru bir şekilde kontrol edilmesi kolaydır ve böylece seri üretim için ölçeklendirilir. Hedef ürün, sistemdeki basit bileşenler sayesinde kolayca saflaştırılabilir. Ancak, Bu sistem genellikle bir flavanon bir flavonol üretimi ile sınırlıdır.

F3H ve FLS1, Şekil1'de gösterildiği gibi bitkilerde flavanonun flavonole dönüştürülmesinde iki önemli anahtar enzimdir. Bir flavanone bir flavonol üretmek için bir in vitro biyosentetik sistem geliştirmek için, Atf3h (GenBank katılım no. NM_114983.3) ve Atfls1 (GenBank katılım no. NM_120951.3) genleri 4 haftalık A. thaliana fidelerinden prokaryotik ekspresyon vektörü pET-32a(+) içine klonlandı. Rekombinant plazmidler E. coli</em...

Bir flavonol türevi sağlık ve gıda sektöründe uygulanması için çok önemlidir. Burada, flavanondan bir flavonolün biyosentezi için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz ve diğer yaklaşımlara göre önemli adımları ve avantajlarını tartışıyoruz.

Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak

Flavonols are a major subclass of flavonoids with a variety of biological and pharmacological activities. Here, we provide a method for the in vitro ...

Bu protokolü kullanarak, flavanone'lerden bir tencerede çok sayıda flavonol üretebiliriz. Bu teknik emek ve zaman tasarrufu, son derece uygun maliyetli ve kontrol edilmesi kolay, bu yüzden büyük bir sanayileşme potansiyeline sahiptir. Evet, bu yöntem diğer ikincil metabolitlerin ekonomik üretimi hakkında bilgi sağlayabilir, ancak uygulandığında bazı değişiklikler gerekir.O genellikle hiçbir şey ya da çok düşük verim alırsınız. Benim tavsiyem buz üzerinde rekombinant enzimler işlemek ve enzimlerin stok çözeltisi% 10 gliserin eklemek. Çünkü sadece görsel gösteri yoluyla yeni bir el, deneyin başarılı bir şekilde yürütülmesini etkileyen önemli ayrıntıları ve gerçeği anlayabilir.Önce arabellek hazırlayın. Tris-baz uygun miktarda eriterek iki kez sentetik tampon olun, sodyum askorbat, de-iyonize suya alfa ketoglutarik asit, ve çözeltiye gliserol uygun miktarda pipet. PH'ı 7,2'ye ayarlamak için hidroklorik asit eklemek ve iyonize su ekleyerek hacmi ayarlamak için bir pipet kullanın.İki kez sentetik tamponu ileride kullanılmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Sonra deiyonize suda demir sülfat heptahidrat eriterek 100 kez stok çözeltisi olun. Metanolflavonoid eriterek 25 milimoler flavonoid bir stok çözüm olun ve eksi 20 santigrat derece de çözüm saklayın.En kritik adım sentetik bir sistem kurmaktır. Bir flavanondan flavanol üretmek için sentetik bir sistem kurmak için, ilk bu tabloda listelenen reaktifler göre iki mililitrelik bir tüp sentetik sistem hazırlamak. Açık tüpü 40 santigrat derecede, 600 rpm'de kırk dakika sallayarak Bir ısı bloğuna yerleştirin.Bundan sonra, asetik asit 10 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu sona erdirmek, ve etil asetat 100 mikrolitre. İki saat sonra, üst organik fazı 1,5 mililitrelik bir tüpe tranfer etmek için bir pipet kullanın ve tüpü oda sıcaklığında hava kurutmak için bir kaputa yerleştirin. TLC analizini yapmak için, önce tüpleri kaputtan alın ve flavanoid tozu 160 mikrolitre metanoltüpte yeniden çözün.Metanol 25 milimolar flavonoid stok çözeltisi seyrelterek, seri konsantrasyonları ile otantik flavonoid örnekleri hazırlayın. Yeniden çözünmüş reaksiyon örneğinin bir mikrolitresini ve otantik flavonoid örneğinin bir mikrolitresini poliamid plakasına yükleyin. Aynı plaka üzerinde otantik flavonoid diğer konsantrasyonları için aynı şeyi yapın.Sonra bir duman kaputunda, bir çözücü sistemi ile dolu bir kromatografi silindiri örnek yüklü plaka koyun. Plakayı silindirin altına takın ve plakayı 20 dakika boyunca çözücü sisteminde çalıştırın. Oda sıcaklığında tabakları hava kurutun.Püskürtücü şişe ile, alüminyum klorür% 1 etanolik çözeltiile plakaları sprey, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tekrar kuruyan hava takip. 254 nanometre bir UV ışığı altında plakalar üzerinde noktalar görselleştirin ve görüntü almak, daha sonra bilgisayarda, yazılım ImageJ açın. Analiz edilecek görüntüyü açmak için dosyayı tıklatın, aç' ı tıklatın.ImageJ kullanıcı arabiriminde soldaki en dikdörtgen seçim aracını tıklatın. Görüntüdeki YG'yi fareyle anahatolarak belirtin ve ilk YG'yi etiketlemek için bire basın. Dikdörtgen seçimi fareyle birlikte bir sonraki YG'ye doğru hareket ettirin ve ikinci YG'yi etiketlemek için ikiye basın.Diğer tüm ROI'ları iki ye basarak etiketlemek için tekrarlayın. Açılır pencerede tüm RO'lar için profil çizimleri oluşturmak için üçe basın. Ardından, ilgi nin her zirvesi için kapalı bir alan tanımlamak için taban çizgilerini bırakmak için düz çizgi seçim aracını kullanın.ImageJ kullanıcı arabirimindeki ilgili simgeyi tıklatarak değnek aracını etkinleştirin. Açılır penceredeki tüm zirvelerin sonuçlarını görüntülemek için tepenin içini tıklatın. Ardından, Excel'de, orijinal flavonoidin TLC tabanlı standart eğrisini yapmak için açılır penceredeki gri değerleri ilgili flavonoid konsantrasyonlarına göre çizin.Daha sonra ortaya çıkan formüle göre, bu protokolde üretilen faiz flavonoid verimi hesaplamak. Her numuneyi 0,45 mikrometre ve 0,22 mikrometre filtreden sırayla işlemek için bir şırınga kullanın. Numuneleri emme nozulu ile Bir HPLC-MS sistemine yükleyin ve c18 sütunu kullanarak numuneleri 30 santigrat derecede ayırın.Kolonu dakikada bir mililitrede, suda yüzde 10 ila 85 hacimlik asetil nitril bir degrade ile elüate absorbe sini 200 ila 800 nanometre arasında izleyin. LC-MS analizini negatif iyon modunda, dakikada 10 litrelik kuruyan azot akışı yla 300 santigrat derece, dakikada yedi litrelik bir gaz akışıyla 250 santigrat derece, ve yerleşik bir yazılım kullanarak veri toplayın. Tek dalga boyu kromatografileri ayıklamak için nitel analiz programını açın ve dosyayı, veri dosyasını açın'ı tıklatın.Açık veri dosyası penceresinde çözümlenecek dosyayı seçin ve dosyayı açmak için aç'ı tıklatın. Kromatogram sonuçları penceresindefareyi sağ tıklatın ve ardından açılır menüde renklendirin. Tür listesinde, diğer kromatogramları tıklatın.Dedektör açılan kutusunda, DAD1'i seçin ve ardından kromatogram sonuçları penceresinde HPLC sonuçlarını görüntülemek için tamam'ı tıklatın. Kromatogram sonuçları penceresinin üst kısmında sabitlenmiş manuel tümleştirme simgesini tıklatın. Fare ile el ile tümleştirme analizi için gereken tepe noktası için taban çizgisi çizin.Sonuçları görüntülemek için görünüm, tümleştirme tepe listesi'ni tıklatın. Zirve alanlarının sonuçlarını Excel'e kopyalayın ve ilgili flavonoid konsantrasyonlarına karşı otantik flavonoidin HPLC tabanlı standart eğrisini çizin, ardından bu protokolde üretilen ilgi flavonoidinin verimini elde edilen formüle göre hesaplayın. Daha sonra flavonoid bileşiklerin tam kütlesi için MS verilerini analiz etmek için tek dalga boyu kromatogramları ayıklamak için aynı prosedürleri tekrarlayın.Kromatogram sonuçları araç çubuğundaki aralık seç simgesini tıklatın. İlginin zirvesini seçin. Seçili aralıktaki fareyi sağ tıklatın ve sonuçları MS spektrum sonuçları penceresinde görüntülemek için açılır menüdeki ekstre MS spektrumuna tıklayın.Bu in-vitro sistemin flavanonun flavonole dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için sisteme NRN eklendi. Poliamid TLC plakaüzerinde iki yeni nokta ortaya çıktı. Bir nokta DHK benzer bir göç mesafesi gösterdi, ve diğerleri KMF benzer.HPLC ve LC-MS tarafından yapılan daha ileri analizler, yeni kimyasalın sırasıyla 12 dakika ve 20 dakikalık bir tutma süresi gösterdiğini gösterdi, 287 ve 285'te Z'nin üzerindeki yarı moleküler iyon zirvesinde DHK ve KMF ile aynıydı. Sistemin diğer flavanonların ilgili flavonollere dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için ERD sisteme eklendi. Poliamid TLC plakası üzerinde iki yeni nokta, sırasıyla DHQ ve QRC'ye benzer bir geçiş mesafesi görüntülenmiştir.HPLC ve LC-MS analizleri, bu yeni kimyasalların sırasıyla 10 dakika ve 16 dakikalık bir tutma süresi ve 303 ve 301'de Z'nin üzerinde yarı moleküler iyon tepe M'yi ortaya koyduğunu göstermiştir, bu da DHQ ve QRC'ninkilere tam olarak karşılık gelmektedir. Sentetik sistemi hazırlarken, son enzim eklemeniz gerekir, ve son demir sülfat ikinci ekleyin. Evet, diğer sekonder metabolitlerin ekonomik üretimi için bir rehber sağlar.

biosynthesis-flavonol-from-flavanone-establishing-one-pot-bienzymatic

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Asimetrik ferrosen türlerinin sentezi, çözüm teknikleri kullanılarak zordur.  Bu rapor, katı faz sentezi yoluyla gerçekleştirilen kolay ve temiz reaksiyonlar kullanılarak bir ferrosen-biyotin biyokonjugatı üretmek için gerçekleştirilen yöntemlere odaklanmaktadır.  Bir tiolat parçasının dahil edilmesinin, altın yüzeyler üzerinde hareketsizleştirme yeteneği kazandırdığı gösterilmiştir.

Katı Faz Reçine-tabanlı Metodoloji aracılığıyla Asimetrik Ferrosen Türetilmiş Bio-konjuge Sistemleri Sentetik Metodoloji

İyonik sıvılar (IL'ler), yüksek diastereoseçiciliklerde ve iyi verimlerde 1,6-ketoesterlere hızlı, basit ve ucuz erişime aracılık eder. Reaksiyon protokolü sağlamdır ve 1,6-ketoesterler, basit bir filtrasyon protokolünden sonra gram ölçeğinde elde edilebilir. Ayrıca, 1,6-ketoesterler, hidrokarbon çözücülerde güçlü jelatörlerdir.

İyonik Sıvılar ARACILI 1,6-Ketoester son derece Stereoseçici Sentezi: Düşük Molekül Ağırlıklı Gelators Yeni Bir Sınıf Rapid Erişim etkinleştirilmesi A Üç bileşenli Tepki

Kiral amino alkoller çok yönlü kullanım için iskele organik sentezinde moleküllerdir. L-lizin başlayarak, biz sentez amino alkoller-diastereoselective C-H oksidasyon karboksilik asit yan tarafından karşılık gelen hidroksil amino asitin bölünme ardından dioxygenase tarafından katalize birleştiren bir enzimatik cascade tepki bir dekarboksilaz.

Enzimatik Cascade reaksiyonlardan L-lizin Amino kiral alkoller sentezi için

Enantiyomerik zenginleştirilmiş bispiro [γ-butirolakton-pyrrolidin-4, 4'-pyrazolone] iskeletler asimetrik olarak basit organocatalytic 1,3-dipolar cycloaddition tepki ile sentezlenmiş.

Verimli α-Imino γ-Lactones Organocatalytic Cycloadditions ve Alkylidene Pirazolonlar ile ilaç gibi Bispirocyclic İskele İnşaatı

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

CO2 dönüşümleri karmaşık moleküllerin sentezi için tek potiki adımlı bir prosedür içinde gerçekleştirilir. Seçici 4 e- hidroborane redüktörü ile CO2 azaltılması daha sonra yoğuşma reaksiyonu veya karbene aracılı C-C kaplin üretimi dahil bir reaktif ve çok yönlü bis (boril)asetal ara sağlar.

Çok Yönlü CO2 Karmaşık Ürünlere Dönüşümler: Tek potlu İki Aşamalı Strateji

Metaliçermeyen fotokatalizör olarak cercosporin kullanan azot içeren heterodöngülerin sentezi için yeni rotalar geliştirilmiştir.

Cercosporin-Photocatalyzed [4+1]- ve [4+2]-Hafif Koşullarda Azoalkenlerin Annülasyonları

Claisen-Schmidt yoğuşma reaksiyoni, metin köprülü konjuge bisiklik aromatik bileşiklerin üretimi için önemli bir metodolojidir. Aldol reaksiyonunun baz aracılı bir varyantı kullanılarak, genellikle ucuz ve operasyonel olarak basit sentetik bir yaklaşımla bir dizi floresan ve/ veya biyolojik olarak ilgili moleküle erişilebilir.

Claisen-Schmidt Yoğuşma Yaklaşımı Kullanılarak pH Bağımlı Pyrazole, Imidazol ve İzinolon Dipyrrinone Flor Floroforlarının Sentezi

Biyouyumlu lignin mikro ve mikron altı partiküllerin sentezi ve karakterizasyonu için yeni, basit metodolojileri açıklıyoruz. Bu formülasyonlar, heteropolimerin kullanımı için kolay bir yaklaşımın yanı sıra biyotıp, farmasötik teknoloji ve gıda endüstrisinde potansiyel uygulanabilirliği olan çok işlevli taşıyıcı matrislerin rasyonel tasarımı için bir alternatif sağlar.

Yeni Alkali Lignin Mikro-/Submikron Partiküllerinin Yeşil Sentezi, Karakterizasyonu, Kapsüllenmesi ve Salınım Potansiyelinin Ölçülmesi

Bu çalışmada, kinolin bazlı İyonik Sıvının (IL), yani 1-Heksadesilkinolin-1-ium bromür {[C16quin]Br}'nin yeşil sentezini, kinolini fazla miktarda 1-Bromoheksadekan ile karıştırarak ve Nükleer Manyetik Rezonans ve Kızılötesi spektroskopik ölçümler kullanılarak ayrıntılı karakterizasyonunu açıklıyoruz.

Kinolin Bazlı İyonik Sıvının Yeşil Sentezi

Keşfedin flavanondan flavonol biyosentezi için tek kaplı bienzimatik kaskad yöntemini. Bu protokol, biyokimya ve gıda biliminde endüstriyel uygulamalar için verimli, maliyet etkin ve kolay kontrol edilebilir bir alternatif sunar.

Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak

Daha fazla video keşfet