Bir Flavanone bir Flavonol Biyosentezi Bir-pot Bienzymatik Cascade Kurarak

Bu protokolü kullanarak, flavanone'lerden bir tencerede çok sayıda flavonol üretebiliriz. Bu teknik emek ve zaman tasarrufu, son derece uygun maliyetli ve kontrol edilmesi kolay, bu yüzden büyük bir sanayileşme potansiyeline sahiptir. Evet, bu yöntem diğer ikincil metabolitlerin ekonomik üretimi hakkında bilgi sağlayabilir, ancak uygulandığında bazı değişiklikler gerekir.

O genellikle hiçbir şey ya da çok düşük verim alırsınız. Benim tavsiyem buz üzerinde rekombinant enzimler işlemek ve enzimlerin stok çözeltisi% 10 gliserin eklemek. Çünkü sadece görsel gösteri yoluyla yeni bir el, deneyin başarılı bir şekilde yürütülmesini etkileyen önemli ayrıntıları ve gerçeği anlayabilir.

Önce arabellek hazırlayın. Tris-baz uygun miktarda eriterek iki kez sentetik tampon olun, sodyum askorbat, de-iyonize suya alfa ketoglutarik asit, ve çözeltiye gliserol uygun miktarda pipet. PH'ı 7,2'ye ayarlamak için hidroklorik asit eklemek ve iyonize su ekleyerek hacmi ayarlamak için bir pipet kullanın.

İki kez sentetik tamponu ileride kullanılmak üzere dört santigrat derecede saklayın. Sonra deiyonize suda demir sülfat heptahidrat eriterek 100 kez stok çözeltisi olun. Metanolflavonoid eriterek 25 milimoler flavonoid bir stok çözüm olun ve eksi 20 santigrat derece de çözüm saklayın.

En kritik adım sentetik bir sistem kurmaktır. Bir flavanondan flavanol üretmek için sentetik bir sistem kurmak için, ilk bu tabloda listelenen reaktifler göre iki mililitrelik bir tüp sentetik sistem hazırlamak. Açık tüpü 40 santigrat derecede, 600 rpm'de kırk dakika sallayarak Bir ısı bloğuna yerleştirin.

Bundan sonra, asetik asit 10 mikrolitre ekleyerek reaksiyonu sona erdirmek, ve etil asetat 100 mikrolitre. İki saat sonra, üst organik fazı 1,5 mililitrelik bir tüpe tranfer etmek için bir pipet kullanın ve tüpü oda sıcaklığında hava kurutmak için bir kaputa yerleştirin. TLC analizini yapmak için, önce tüpleri kaputtan alın ve flavanoid tozu 160 mikrolitre metanoltüpte yeniden çözün.

Metanol 25 milimolar flavonoid stok çözeltisi seyrelterek, seri konsantrasyonları ile otantik flavonoid örnekleri hazırlayın. Yeniden çözünmüş reaksiyon örneğinin bir mikrolitresini ve otantik flavonoid örneğinin bir mikrolitresini poliamid plakasına yükleyin. Aynı plaka üzerinde otantik flavonoid diğer konsantrasyonları için aynı şeyi yapın.

Sonra bir duman kaputunda, bir çözücü sistemi ile dolu bir kromatografi silindiri örnek yüklü plaka koyun. Plakayı silindirin altına takın ve plakayı 20 dakika boyunca çözücü sisteminde çalıştırın. Oda sıcaklığında tabakları hava kurutun.

Püskürtücü şişe ile, alüminyum klorür% 1 etanolik çözeltiile plakaları sprey, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tekrar kuruyan hava takip. 254 nanometre bir UV ışığı altında plakalar üzerinde noktalar görselleştirin ve görüntü almak, daha sonra bilgisayarda, yazılım ImageJ açın. Analiz edilecek görüntüyü açmak için dosyayı tıklatın, aç' ı tıklatın.

ImageJ kullanıcı arabiriminde soldaki en dikdörtgen seçim aracını tıklatın. Görüntüdeki YG'yi fareyle anahatolarak belirtin ve ilk YG'yi etiketlemek için bire basın. Dikdörtgen seçimi fareyle birlikte bir sonraki YG'ye doğru hareket ettirin ve ikinci YG'yi etiketlemek için ikiye basın.

Diğer tüm ROI'ları iki ye basarak etiketlemek için tekrarlayın. Açılır pencerede tüm RO'lar için profil çizimleri oluşturmak için üçe basın. Ardından, ilgi nin her zirvesi için kapalı bir alan tanımlamak için taban çizgilerini bırakmak için düz çizgi seçim aracını kullanın.

ImageJ kullanıcı arabirimindeki ilgili simgeyi tıklatarak değnek aracını etkinleştirin. Açılır penceredeki tüm zirvelerin sonuçlarını görüntülemek için tepenin içini tıklatın. Ardından, Excel'de, orijinal flavonoidin TLC tabanlı standart eğrisini yapmak için açılır penceredeki gri değerleri ilgili flavonoid konsantrasyonlarına göre çizin.

Daha sonra ortaya çıkan formüle göre, bu protokolde üretilen faiz flavonoid verimi hesaplamak. Her numuneyi 0,45 mikrometre ve 0,22 mikrometre filtreden sırayla işlemek için bir şırınga kullanın. Numuneleri emme nozulu ile Bir HPLC-MS sistemine yükleyin ve c18 sütunu kullanarak numuneleri 30 santigrat derecede ayırın.

Kolonu dakikada bir mililitrede, suda yüzde 10 ila 85 hacimlik asetil nitril bir degrade ile elüate absorbe sini 200 ila 800 nanometre arasında izleyin. LC-MS analizini negatif iyon modunda, dakikada 10 litrelik kuruyan azot akışı yla 300 santigrat derece, dakikada yedi litrelik bir gaz akışıyla 250 santigrat derece, ve yerleşik bir yazılım kullanarak veri toplayın. Tek dalga boyu kromatografileri ayıklamak için nitel analiz programını açın ve dosyayı, veri dosyasını açın'ı tıklatın.

Açık veri dosyası penceresinde çözümlenecek dosyayı seçin ve dosyayı açmak için aç'ı tıklatın. Kromatogram sonuçları penceresindefareyi sağ tıklatın ve ardından açılır menüde renklendirin. Tür listesinde, diğer kromatogramları tıklatın.

Dedektör açılan kutusunda, DAD1'i seçin ve ardından kromatogram sonuçları penceresinde HPLC sonuçlarını görüntülemek için tamam'ı tıklatın. Kromatogram sonuçları penceresinin üst kısmında sabitlenmiş manuel tümleştirme simgesini tıklatın. Fare ile el ile tümleştirme analizi için gereken tepe noktası için taban çizgisi çizin.

Sonuçları görüntülemek için görünüm, tümleştirme tepe listesi'ni tıklatın. Zirve alanlarının sonuçlarını Excel'e kopyalayın ve ilgili flavonoid konsantrasyonlarına karşı otantik flavonoidin HPLC tabanlı standart eğrisini çizin, ardından bu protokolde üretilen ilgi flavonoidinin verimini elde edilen formüle göre hesaplayın. Daha sonra flavonoid bileşiklerin tam kütlesi için MS verilerini analiz etmek için tek dalga boyu kromatogramları ayıklamak için aynı prosedürleri tekrarlayın.

Kromatogram sonuçları araç çubuğundaki aralık seç simgesini tıklatın. İlginin zirvesini seçin. Seçili aralıktaki fareyi sağ tıklatın ve sonuçları MS spektrum sonuçları penceresinde görüntülemek için açılır menüdeki ekstre MS spektrumuna tıklayın.

Bu in-vitro sistemin flavanonun flavonole dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için sisteme NRN eklendi. Poliamid TLC plakaüzerinde iki yeni nokta ortaya çıktı. Bir nokta DHK benzer bir göç mesafesi gösterdi, ve diğerleri KMF benzer.

HPLC ve LC-MS tarafından yapılan daha ileri analizler, yeni kimyasalın sırasıyla 12 dakika ve 20 dakikalık bir tutma süresi gösterdiğini gösterdi, 287 ve 285'te Z'nin üzerindeki yarı moleküler iyon zirvesinde DHK ve KMF ile aynıydı. Sistemin diğer flavanonların ilgili flavonollere dönüştürülmesi için kullanılıp kullanılamayacağını belirlemek için ERD sisteme eklendi. Poliamid TLC plakası üzerinde iki yeni nokta, sırasıyla DHQ ve QRC'ye benzer bir geçiş mesafesi görüntülenmiştir.

HPLC ve LC-MS analizleri, bu yeni kimyasalların sırasıyla 10 dakika ve 16 dakikalık bir tutma süresi ve 303 ve 301'de Z'nin üzerinde yarı moleküler iyon tepe M'yi ortaya koyduğunu göstermiştir, bu da DHQ ve QRC'ninkilere tam olarak karşılık gelmektedir. Sentetik sistemi hazırlarken, son enzim eklemeniz gerekir, ve son demir sülfat ikinci ekleyin. Evet, diğer sekonder metabolitlerin ekonomik üretimi için bir rehber sağlar.