Name: DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 18 s
Description: Keşfedin, DNA elektroforezinde etidyum bromür yerine tiyazol turuncu kullanarak güvenli ve ekonomik bir görüntüleme yöntemi. Mavi ışıkla hasarsız tespit, moleküler biyoloji deneylerinde başarı şansını artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu eser Christopher Newport Üniversitesi'nden TDG için başlangıç fonlar tarafından desteklenmiştir.

1. hazırlanması jel
Not: genel Jel Elektroforez iletişim kuralları için Ayrıca bkz: P.Y. Lee, ve ark. 14.
<ol><li>Özel MIX (~ %1 w/v, yüzde belirli boyut ayrımları için çeşitli) arabelleği (yaklaşık 70 mL Mini jel (8 x 7 cm) için). Arabellekleri sık TAE (tris-asetat-EDTA, 40 mM Tris, 20 mM asetat, 1 mM EDTA, pH yaklaşık 8,6) veya TBE (tris-Bor-EDTA, 90 mM Tris, 90 mM Borat, 2 mM EDTA, pH yaklaşık 8.3) vardır).</li>
	<li>Tiyazol turuncu 1.3 μg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin.<ol>
<li>Tiyazol DMSO içinde 10.000 x hisse senedi çözüm (13 mg/mL) yapmak için turuncu geçiyoruz. Özellikle ışığa duyarlı karanlık ne zaman değil içinde kullanma kime saklayın. Bu çözüm için oda sıcaklığında stabil ~ ay; uzun süreli depolama aliquots (DMSO standart buzdolabında buz tutar) dondurarak elde. Tamamen erimeye ve kullanımdan önce dondurulmuş bir çözüm resuspend emin olun. Not: Jel de kime ile Elektroforez sonra Boyanabilen (bkz. Adım 2.6). Süre için üzerinde arasında etidyum bromür, standart Moleküler Biyoloji Laboratuvarı güvenlik önlemleri saklanması gereken bir güvenlik profili vardır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Özel, arabellek ve çözülmeye turuncu tiyazol özel karışımı mikrodalga (yaklaşık 60 s). Bu adım çok "erime" olarak adlandırılır. Girdap (5 s) gerekirse dağılmasına yardımcı olmak için. Not: İçin tercih eğer mikrodalga sonra da eklenebilir.</li>
	<li>Özel çözüm kısaca uygun bir tarak içeren jel döküm aparatı dökülen önce soğutmak izin verin.</li>
	<li>Bir jel kuvvetlendirmek özel çözüm izin verin.</li>
</ol>2. yükleme ve jel çalıştırma
<ol><li>Jel Elektroforez cihazı yerleştirmek zaten yüklü değilse.</li>
	<li>Jel yüzeyi kapsayacak şekilde çalışan arabellek (TAE veya yukarıda olarak TBE) ekleyin.</li>
	<li>Bir yükleme boya kullanarak DNA örnekleri (genellikle 10 μL) yükleyin. Bir DNA boyutlandırma merdiven için başvuru içerir.</li>
	<li>Kapak ve elektrotlar (jel kırmızı anot (pozitif) doğru çalıştırılmalıdır) ekleyin.</li>
	<li>Gerilim uygulamak (genellikle ~ 100V mini bir jel için her ne kadar jel boyut gerektirebilir jel zarar önlemek için değiştirilmiş bir gerilim) boya yükleme uygun bir mesafe seyahat etti kadar (yaklaşık 4-7 cm mini bir jel için mesafe bağlı olarak değişebilir rağmen kesin uygulama). Not: etidyum bromür ve birçok diğer DNA'ya bağlanıcı boyalar gibi tiyazol turuncu olumlu ücret uygulanır. Sonuç olarak, bu boyalar DNA electrophoresing ters yönde geçiş yapacak. Çok gelişmiş ayrılması için jel aşağı çalışan örnekler için sonunda boya zayıf boyama sonucu daha küçük DNA parçalarının ayrı. Bu durumda, jel adım 2.6 olduğu gibi lekeli. Bu durum için kime benzersiz değil, herhangi bir olumlu geri dönülebilir olarak DNA ile etkileşim boya (etidyum bromür, için de dahil olmak üzere ve diğerleri) bu davranışı sergiler hesaplanır.</li>
	<li>Eğer öncesinde döküm (Adım 1.2) jel, jel tiyazol turuncu içeren arabellekte çeker tarafından leke için eklenmedi.<ol>
<li>Yeterli arabellek (TAE veya TBE) hazırlamak 1.3 μg/mL tiyazol tamamen jel kapak ve bantları tam olana jel yumuşak ajitasyon ile emmek için turuncu içeren tespit (yaklaşık 20 dakika).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. görsel tiyazol turuncu özel jel (UV transilluminator) olarak
<ol><li>Jel Elektroforez cihazları ve UV transilluminator yere kaldırın. Dikkat: UV ışık cilt ve göz zarar veriyor. Uygun göz (gözlük) ve yüz (yüz kalkan) koruma giymek emin olun. Eller eldiven olmalıdır ve uzun kollu giyilmelidir.</li>
	<li>İstenirse, dışarı kesim DNA grup jel (daha fazla sindirim ve ligasyonu, örneğin için) istenen. Jel için UV ışık olarak kısa süreyi mümkün olduğunca eksizyonu sırasında maruz bırakmayın. UV ışığı (DNA boya ne olursa olsun) DNA zarar veriyor.</li>
	<li>DNA bir hazır kit veya protokolü15kullanarak jel dilimden ayıklayın.</li>
</ol>4. görselleştirme tiyazol turuncu özel jel (mavi ışık transilluminator veya el feneri)
<ol><li>Jel Elektroforez cihazları ve yer bir mavi ışık transilluminator (~ 470 nm maksimum emisyon dalga boyları) kaldırın. Alternatif olarak, bir mavi LED (~ 470 nm) el feneri jel (ya yukarıda veya aşağıda), yönetmen. Not: duyarlılığı bir mavi ışık transilluminator etidyum bromür ile kullanarak daha düşük olmakla birlikte, DNA etidyum bromür ile lekeli bu mavi ışık iletişim kuralını kullanan tespit edilebilir.</li>
	<li>Bir kehribar emisyon filtresi (~ 560 nm longpass, gözlük ya da Meydanı) DNA: tiyazol turuncu kompleksleri mavi ışık, Floresans görselleştirme etkinleştirme filtre uygulamak için kullanın. Not: amber emisyon filtre olmadan yoğunluğu nedeniyle DNA grupları Mavi ışıklı uyarma kaynak çok zor. Dikkat: mavi ışık akut uzun süreli (UV zıt), dokulara zarar verme yeteneği yoksun rağmen yoğun mavi ışığa maruz kalma gözleri zarar verebilir ve kehribar emisyon gözlük ya da filtre kullanılmalıdır.</li>
	<li>İsterseniz, daha fazla uygulama için jel istenilen DNA grup kesip. Not: mavi ışık DNA zarar vermez beri bu hızla bantları kesmek gerekli değildir (örneğin UV uyarma adım 3.2 kullanarak).</li>
	<li>DNA bir hazır kit veya protokolü15kullanarak jel dilimden ayıklayın.</li>
</ol>5. resim yakalama
<ol><li>Uygun uyarma ve emisyon ayarları jel görüntüleme cihaz seçin. Uyarma ve emisyon tiyazol Orange (λeski, max 510 = nm (488 nm ve 470 nm da göstermek yanı sıra UV dalga boylarında, güçlü uyarma güçlü uyarma); λem 527 = nm) ortak mavi-ışık-detectable reklama neredeyse aynıdır boya, aletler kullanılabilir filtre ayarlarını önceden ayarlamak bu yüzden. Not: Mavi-ışık-detectable ticari boyalar için bazı filtre ayarları aslında zararlı UV ışığı uyarma için kullanmak, yani bantları kesmek önce Imaging Eğer dikkatli olun. Mavi ışıklı uyarma kaynak mümkünse DNA bantları görüntüleme sonra eksize kullanın.</li>
	<li>Bir görüntüleme sistemi ile uygun süzgeçleri yokluğunda, kamera ve jel/mavi ışık uyarma kaynak arasında kehribar bir filtre yerleştirin.</li>
</ol>

<ol><li>O'Neil, C. S., Beach, J. L., Gruber, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange+as+an+everyday+replacement+for+ethidium+bromide+and+costly+DNA+dyes+for+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange as an everyday replacement for ethidium bromide and costly DNA dyes for electrophoresis.</a> Electrophoresis. 39 (12), 1474-1477 (2018).</li>
<li>McCann, J., Choi, E., Yamasaki, E., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+carcinogens+as+mutagens+in+the+Salmonella%2Fmicrosome+test%3A+assay+of+300+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of carcinogens as mutagens in the Salmonella/microsome test: assay of 300 chemicals.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (12), 5135-5139 (1975).</li>
<li>Evenson, W. E., Boden, L. M., Muzikar, K. A., O’Leary, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1H+and+13C+NMR+Assignments+for+the+Cyanine+Dyes+SYBR+Safe+and+Thiazole+Orange%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">1H and 13C NMR Assignments for the Cyanine Dyes SYBR Safe and Thiazole Orange.</a> The Journal of Organic Chemistry. 77 (23), 10967-10971 (2012).</li>
<li>Beaudet, M., Cox, G., Yue, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeaudet%2C+M+%22Molecular+Probes%2C+Inc%22">Molecular Probes, Inc</a>. , USA. WO/2005/0333342 (2005).</li>
<li>Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+induced+by+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Mutation+Research%22%5BJournal%5D)">Mutations induced by ultraviolet light.</a> Mutation Research. 571 (1-2), 19-31 (2005).</li>
<li>Cariello, N. F., Keohavong, P., Sanderson, B. J., Thilly, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+produced+by+ethidium+bromide+staining+and+exposure+to+ultraviolet+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage produced by ethidium bromide staining and exposure to ultraviolet light.</a> Nucleic Acids Research. 16 (9), 4157(1988).</li>
<li>Hartman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transillumination+can+profoundly+reduce+transformation+frequencies%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Transillumination can profoundly reduce transformation frequencies.</a> BioTechniques. 11 (6), 747-748 (1991).</li>
<li>Lee, L. G., Chen, C. H., Chiu, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazole+orange%3A+a+new+dye+for+reticulocyte+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Thiazole orange: a new dye for reticulocyte analysis.</a> Cytometry. 7 (6), 508-517 (1986).</li>
<li>Nygren, J., Svanvik, N., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interactions+Between+the+Fluorescent+Dye+Thiazole+Orange+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">The Interactions Between the Fluorescent Dye Thiazole Orange and DNA.</a> Biopolymers. , 1-13 (1998).</li>
<li>Svanvik, N., Westman, G., Wang, D., Kubista, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Up+Probes%3A+Thiazole+Orange-Conjugated+Peptide+Nucleic+Acid+for+Detection+of+Target+Nucleic+Acid+in+Homogeneous+Solution%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Light-Up Probes: Thiazole Orange-Conjugated Peptide Nucleic Acid for Detection of Target Nucleic Acid in Homogeneous Solution.</a> Analytical Biochemistry. 281 (1), 26-35 (2000).</li>
<li>Yang, P., De Cian, A., Teulade-Fichou, M. P., Mergny, J. L., Monchaud, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+Bisquinolinium%2FThiazole+Orange+Conjugates+for+Fluorescent+Sensing+of+G-Quadruplex+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Engineering Bisquinolinium/Thiazole Orange Conjugates for Fluorescent Sensing of G-Quadruplex DNA.</a> Angewandte Chemie International Edition. 48 (12), 2188-2191 (2009).</li>
<li>Fang, G. M., Chamiolo, J., Kankowski, S., Hovelmann, F., Friedrich, D., Lower, A., Meier, J. C., Seitz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+FIT-PNA+hybridization+probe+for+the+hybridization+state+specific+analysis+of+a+C+%E2%86%92+U+RNA+edit+via+FRET+in+a+binary+system%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A bright FIT-PNA hybridization probe for the hybridization state specific analysis of a C → U RNA edit via FRET in a binary system.</a> Chemical Science. 9 (21), 4794-4800 (2018).</li>
<li>Pei, R., Rothman, J., Xie, Y., Stojanovic, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-up+properties+of+complexes+between+thiazole+orange-small+molecule+conjugates+and+aptamers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Light-up properties of complexes between thiazole orange-small molecule conjugates and aptamers.</a> Nucleic Acids Research. 37 (8), e59-e59 (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), 1-5 (2012).</li>
<li>Vogelstein, B., Gillespie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparative+and+analytical+purification+of+DNA+from+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preparative and analytical purification of DNA from agarose.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Etidyum bromür uzun moleküler biyoloji laboratuarında bilinen toksisite rağmen standart bir araç olmuştur. Bu da tespit edilmeden gibi DNA zarar UV ışık gerektirmelerini yaşanıyor. Tiyazol turuncu etidyum bromür, aynı zamanda yararlı ama pahalı ticari boyalar için ucuz bir alternatif sunmaktadır.
Tiyazol turuncu faydaları böylece iki kat vardır. İlk olarak, tiyazol turuncu sadece etidyum bromür için bir yedek olarak kullanılabilir. Jelleri aynı şekilde leke (Adım 1.2) yerine kime ile EtBr için...

Bu yöntemin amacı DNA Floresans algılama için tiyazol turuncu (için) kullanarak özel jelleri belirlemektir. Onun alçak fiyat ve olumlu Emanet profil nedeniyle tiyazol turuncu lisans öğretim labs ve moleküler biyoloji, özellikle d ve klonlama performans araştırma laboratuvarları belirli fayda görebilirsiniz.
Etidyum bromür DNA tespiti özel jelleri içinde en yaygın boya kalır. Bu öncelikle çok ucuz elde edilebilir çünkü ve sadece algılama için uyarma UV ışığıyla gerektirir. Her iki etidyum bromür ve tiyazol turuncu ucuz, düşük algılama sınırları (1-2 ng/lane)1. Üzerine tiyazol turuncu artıran iki ana dezavantajları vardır etidyum bromür, ancak.
İlk olarak, tiyazol turuncu daha az mutajenik ise etidyum bromür özel işlem, nakliye ve bertaraf gereksinimleri, alkil2 ' dir (3-4 x daha az Ames testi mutajenik)3,4 ve genellikle ile bertaraf ortak kimyasal atık.
İkinci olarak, etidyum bromür algılama için UV ışık gerektirir. Tiyazol turuncu UV ışığı istenirse benzer şekilde kullanabilirsiniz, ancak aynı zamanda mavi ışık ile tespit edilebilir. UV ışığı, yaygın olarak kullanılan, birkaç belirgin dezavantajları vardır. İlk olarak, insan cilt ve göz zarar veriyor. UV ışık eğitimli profesyoneller tarafından güvenle kullanılabilir ise, kaza sonucu deri ya da göz zararlardan (işlevsel olarak sunburns için benzer) laboratuvar UV ışık özellikle deneyimsiz bilim adamları ile nadir değildir. İkinci olarak, UV ışık son derece aşağı akım deneyler (örneğin ligasyonu ve dönüştürme)1,6,7başarısını azaltan DNA örnekleri5' e, zarar veriyor. Kime mavi ışık ile algılama sağlar (λeski, max 510 = nm (488 nm ve 470 nm da göstermek güçlü uyarma)), hangi Deri Hasari neden olmaz veya DNA hasar (herhangi bir yoğun ışık hala gözlere zararlı olabilir, ancak), her iki bilim adamı riskleri büyük ölçüde azalan ve örnek.
Etidyum bromür sadece floresan boya alternatif için değil; onun avantajı maliyetidir. İÇİN Retikülosit leke8olarak 1980'lerde keşfedildi ve yardımcı programı Floresans DNA tabanlı deneyler9,10,11,12,13bir dizi içinde buldu. Şu anda birden çok tedarikçi tarafından satılmaktadır. Etmektir üst bileşik ek, daha pahalı, mavi-ışık-detectable ticari boya ve Elektroforez, UV veya mavi ışık için algılama1kullanarak sırasında benzer şekilde davranır. Ayrıca, diğer boyalar genel Elektroforez deneyleri için EtBr ya da kime, çok düşük DNA konsantrasyonları daha duyarlı olmakla birlikte, bu tür boyalar çok bağlamlarda çok pahalı.

<table><tbody><tr><td>2 günlük DNA merdiveni</td><td>New England Biolabs</td><td>N0469S</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz (Genetik Analiz Sınıfı)</td><td>Fisher</td><td>BP1356-100</td><td></td></tr><tr><td>Mavi ışıklı el feneri</td><td>WAYLLSHINE (Amazon)</td><td>WAYLLSHINE Ölçeklenebilir Mavi LED</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc MP</td><td>Biorad</td><td>1708280</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>etidyum bromür</td><td>Fisher</td><td>BP1302-10</td><td>Karşılaştırma için, protokol için gerekli değildir</td></tr><tr><td>Jel aparatı (Owl Easy Cast)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B1A</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Qiaquick Jel ekstraksiyon kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>Güvenli Görüntüleyici Görüntüleme Gözlükleri</td><td>Invitrogen</td><td>S37103</td><td>Mavi ışıklı el feneri kullanmak için gereklidir.*</td></tr><tr><td>SafeImager 2.0 (Mavi ışık aydınlatıcı)</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Mavi ışıklı el feneri alternatif olarak kullanılabilir</td></tr><tr><td>SYBR Safe</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Karşılaştırma için, protokol için gerekli değildir</td></tr><tr><td>TAE (Tris-Asetat-EDTA)</td><td>Corning</td><td>46-010-CM</td><td></td></tr><tr><td>Tiyazol turuncu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>390062</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">*Invitrogen G6600'e gözlükler de dahildir</td></tr></tbody></table>

dna elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA Electrophoresis Using Thiazole Orange Instead of Ethidium Bromide or Alternative Dyes

Özel kullanarak DNA Jel Elektroforez Moleküler Biyoloji Laboratuvarları, boyutuna göre DNA parçalarının ayrılması sağlayan ortak bir araç olduğunu. Ayrılıktan sonra DNA boyama tarafından görüntülenmiştir. Bu makalede tiyazol leke turuncu DNA kullanımı gösterilmiştir. Hassas, ucuz, UV veya (örnek zarar önlemek için) mavi ışık ile heyecanlı ve etidyum bromür daha güvenli olduğu tiyazol turuncu olumlu ortak boyama yöntemleri karşılaştırır. Zaten DNA Elektroforez deneyler etidyum bromür kullanarak çalıştırmak için donatılmış laboratuvarları genellikle boyalar ile herhangi bir ek değişiklik algılama için UV ışık kullanarak varolan iletişim kuralları, geçiş yapabilirsiniz. Mavi ışık algılama örnek zarar görmemesi için Ayrıca bir mavi ışık kaynağı ve emisyon filtre ile elde edilebilir. Zaten mavi ışık algılama için donatılmış labs sadece boya ile herhangi bir ek değişiklik varolan iletişim kuralları için geçiş yapabilirsiniz.

Tiyazol turuncu DNA, algılama arasında etidyum bromür kullanmadan ve DNA zararlı UV ışık kullanmadan sağlar. Etidyum bromür laboratuardan ortadan kaldırarak avantajlı olabilir mutajenik, olmak iyi bilinmektedir. UV ışık DNA zarar ve mavi ışık DNA zarar vermez ise dönüşüm verimliliği önemli ölçüde düşürür. Algılama sınırları arasında etidyum bromür, tiyazol portakal ve bir ortak, mavi-ışık-algılanabilir ticari DNA boya arasında benzer (şekil 1, Tablo malzemelerigörmek), tüm ü...

Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

DNA gel electrophoresis using agarose is a common tool in molecular biology laboratories, allowing separation of DNA fragments by size. After separation, ...

Bu protokol elektroforez sırasında DNA tespiti için ethidyum bromür kullanmaya kolay ve ucuz bir alternatiftir. Ethidyum bromür çıkarılarak, uv ışığı veya mavi ışık algılama için kullanılabilir. Mavi ışık DNA'ya zarar vermez, bu da alt akım deneylerinde başarı şansını artırır.Bunu denemek çok kolay. Sadece tiamit turuncu ile jeller içinde ethidium bromür değiştirmeniz gerekir. Başlamak için, tris-asetat-EDTA veya tris-borat tamponlar 70 mililitre agarose yaklaşık 0,7 gram karıştırarak% 1 mini jeller hazırlamak.Daha sonra, 10, 000X stok çözeltisi yapmak için DMSO tiazol turuncu eritin. Özellikle ışığa duyarlı olmasa da, kullanılmadığı zaman karanlıkta tiamzol turuncusaklayın. Uzun süreli depolama için, tiazol portakal-DMSO karışımı aliquots yapmak ve onları dondurmak.Sonra, mililitre başına 1.3 mikrogram son konsantrasyona tiazol portakal ekleyin ve yaklaşık 60 saniye agarose çözmek için agarose tampon ve tiamit turuncu karışımı mikrodalga. Uygun bir tarak içeren bir jel döküm aparat içine agarose karışımı dökün ve bir jel içine katılaşmak için agarose çözeltisi sağlar. Jeli yüklemek için, jeli ilk olarak elektroforez cihazına yerleştirin.Sonra jel yüzeyini kapsayacak şekilde TAE veya TBE çalışan tampon ekleyin. Sonra, yükleme boyası kullanarak, bir DNA örneğinin 10 mikrolitresini yükleyin. Referans için bir DNA boyutlandırma merdiveni ekleyin.Kapağı ve elektrotları takın ve mini jeli 100 voltta çalıştırın, ta ki yükleme boyası bir mini jel için yaklaşık 4-7 santimetre gidene kadar. Tiazol portakalı jel dökümden önce uygulanmamışsa, jeli tiamzol içeren tampona batırarak yaklaşık 20 dakika veya bantlar tam olarak tespit edilene kadar hafif ajitasyonla lekeleyin. Jeli UV transilluminator kullanarak görselleştirmek için, jeli elektroforez cihazından çıkarın ve UV transilluminator'un üzerine yerleştirin.Jeli mavi ışık transilluminator veya el feneri kullanarak görselleştirmek için, jeli mavi ışık transilluminator'un üzerine yerleştirin veya mavi LED el fenerini jelin üstünden veya altından yönlendirin. Mavi ışığı filtrelemek için kehribar emisyon filtresi kullanın, DNA tiazol turuncu komplekslerinden floresan görselleştirmesini ve boyaları korumasını sağlar. Daha fazla sindirim veya ligasyon için, jel istenilen DNA bantları kesip ve hazır bir kit veya protokol kullanarak DNA ayıklama devam.Jel görüntüleme cihazında uygun uyarma ve emisyon ayarlarını seçin. Uygun filtrelere sahip bir görüntüleme sistemi yokluğunda, kamera ile jel mavi ışık uyarma kaynağı arasına bir kehribar filtre yerleştirin. Algılama limitleri ethidium bromür arasında benzer, tiazol turuncu, ve ortak bir mavi-ışık tespit edilebilir ticari DNA boyası, her üç boya için algılama sınırı bir mini jel şerit başına bir ila iki nanogram olmak.Bir kısıtlama sindirim Thiazolturuncu lekeli agarose jel bir UV veya mavi ışık transilluminator veya mavi ışık el feneri ile heyecanlı zaman tespit edilebilir. Tiayzol portakalı ethidyum bromürden daha az tehlikeli görünse de eldiven ve gözlük gibi standart kişisel koruyucu ekipmanlar hala giyilmelidir.

dna-electrophoresis-using-thiazole-orange-instead-ethidium-bromide-or

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Agaroz jel elektroforez ile DNA parçalarının ayrılması için temel bir protokol tarif edilmektedir.

DNA kırıntıları Ayrılma Agaroz Jel Elektroforezi

Biz son zamanlarda basit bir bakteriyel tespiti için floresan assay "mix-ve-okuma" kurmak için uygulanabilir Flourogenik DNAzyme probları üretmek için yeni bir yaklaşım bildirdin. Bu özel DNA sondaları böylece floresans sinyali kuşağa bakteriyel algılama çevirme belirli bakteri tarafından üretilen ham hücre dışı karışımı (CEM) varlığında, bir kromofor-değiştirilmiş-DNA RNA kimerik substratın bölünme katalize. Bu yazıda, "RFD-EC1" ifade belirli bir DNAzyme prob modeli bakterinin tespiti için...

Flourogenik DNAzymes kullanarak Bakterilerin Tespiti

Bu videoda, kızılötesi floresan etiketli DNA probları kullanarak protein-DNA etkileşimlerini tespit etmek için elektroforetik hareketlilik kaydırma testini gösteriyoruz. Protein DNA probuna bağlandığında, yavaşça hareket eden ve jel üzerinde kaymış bir bant olarak görünen büyük bir kompleks oluşturur.

Transkripsiyon Faktörü-DNA Komplekslerinin Tespiti için Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi

Biz renkli çökeltilerin zıt üç farklı mRNA dağıtım desen eşzamanlı ve belirli algılama izin bozulmamış Drosophila embriyolar bir çoklu hedef kromojenik tüm montaj in situ hibridizasyon (MC-DİLERİZ) prosedürü açıklar.

Çoklu hedef Kromojenik Tüm montaj<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme Gen İfade Etki karşılaştırılması için<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Transkripsiyon faktörü (TF) DNA bağlanmasını etkileyen kodlamayan genetik varyantları tanımlamak için stratejik bir plan ve protokol sunuyoruz. Genotipe bağlı TF DNA bağlanmasının elektroforetik hareketlilik kayma testi (EMSA) ve DNA afinite çökeltme testi (DAPA) analizi için ayrıntılı bir deneysel protokol sağlanmıştır.

Elektroforetik Hareketlilik Assay (EMSA) ve Shift kullanarak Fonksiyonel Olmayan kodlama Genetik Türevleri için tarama DNA afinite Yağış Deneyi (DAPA)

RNA parçalayan DNAzime, üreaz ve manyetik boncuklardan yararlanan modifiye bir turnusol testi kullanarak E. coli'nin kolorimetrik tespiti için bir protokol açıklıyoruz.

Turnusol Testi kullanarak Bakterilerin Kolorimetrik Tespiti

Biz burada önemli bir biyolojik soruyu çözmek için bir vaka çalışması olarak kızılötesi floresan boya etiketli DNA probları ile birlikte saflaştırılmış SOX-2 proteinleri kullanılarak floresan Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Tahliller (FEMSA) optimize edilmiş bir protokol açıklar.

Kızılötesi Floresan Boya-etiketli oligonükleotidler kullanılarak Elektroforetik Hareketlilik Kaydırma Testi için optimize Protokol

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

Bu yöntem bir SYBR yeşil jel ıslatarak seçici boyama ve jelleri içinde DNA'ın miktar sağlar ben / Nitro mavi Tetrazolium çözüm ve sonra güneş ışığı ya da mavi bir ışık kaynağına maruz. Bu işlem görünür bir çökelti oluşturur ve alan kullanımı için ideal hale neredeyse hiçbir ekipman.

DNA Formazan yağış mavi ışığa maruz tarafından indüklenen esas alarak yöntemini boyama

DNA molekülleri floresan mikroskopi için boyama bir deney sırasında görüntüleyebilmesi için bir bilim adamı sağlar. Burada sunulan yönteminde DNA molekülleri ile floresan boyalar önceden lekeli ve metilasyonu ve sigara metilasyonu hassas enzimleri ile sindirilir.

DNA ile bir siyanür boya olabilir olmak sindirilmiş enzimleri ile lekeli belirleme

Burada RNA Mango aptamers ı, II, III veya IV ile etiketlenmiş görüntü Rnas 'ında doğal veya denatüre Poliakrilamid jel elektroforezi (Page) jelleri kullanarak hassas, hızlı ve ayrımcılık sonrası jel boyama yöntemi sunuyoruz. Standart sayfa jeller çalıştırdıktan sonra, Mango-Tagged RNA kolayca TO1-biotin ile lekelenmiş ve daha sonra yaygın olarak kullanılabilir floresan okuyucular kullanılarak analiz edilebilir.

Polyacrylamide jeller içinde Mango-Tagged RNA floresan görselleştirme bir Poststaining yöntemi ile

Keşfedin, DNA elektroforezinde etidyum bromür yerine tiyazol turuncu kullanarak güvenli ve ekonomik bir görüntüleme yöntemi. Mavi ışıkla hasarsız tespit, moleküler biyoloji deneylerinde başarı şansını artırır.

DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma

Daha fazla video keşfet