DNA Elektroforez tiyazol turuncu etidyum bromür veya alternatif boya yerine kullanma
31 Mart 2019
Burada, DNA tespiti Jel Elektroforez deneylerde tiyazol turuncu kullanılacak iletişim kuralı mevcut. Etidyum bromür ortadan kaldırılması tiyazol turuncu kullanılmasına ve floresan algılama UV ya da mavi ışık ile elde edilebilir.
Bu protokol elektroforez sırasında DNA tespiti için ethidyum bromür kullanmaya kolay ve ucuz bir alternatiftir. Ethidyum bromür çıkarılarak, uv ışığı veya mavi ışık algılama için kullanılabilir. Mavi ışık DNA'ya zarar vermez, bu da alt akım deneylerinde başarı şansını artırır.
Bunu denemek çok kolay. Sadece tiamit turuncu ile jeller içinde ethidium bromür değiştirmeniz gerekir. Başlamak için, tris-asetat-EDTA veya tris-borat tamponlar 70 mililitre agarose yaklaşık 0,7 gram karıştırarak% 1 mini jeller hazırlamak.
Daha sonra, 10, 000X stok çözeltisi yapmak için DMSO tiazol turuncu eritin. Özellikle ışığa duyarlı olmasa da, kullanılmadığı zaman karanlıkta tiamzol turuncusaklayın. Uzun süreli depolama için, tiazol portakal-DMSO karışımı aliquots yapmak ve onları dondurmak.
Sonra, mililitre başına 1.3 mikrogram son konsantrasyona tiazol portakal ekleyin ve yaklaşık 60 saniye agarose çözmek için agarose tampon ve tiamit turuncu karışımı mikrodalga. Uygun bir tarak içeren bir jel döküm aparat içine agarose karışımı dökün ve bir jel içine katılaşmak için agarose çözeltisi sağlar. Jeli yüklemek için, jeli ilk olarak elektroforez cihazına yerleştirin.
Sonra jel yüzeyini kapsayacak şekilde TAE veya TBE çalışan tampon ekleyin. Sonra, yükleme boyası kullanarak, bir DNA örneğinin 10 mikrolitresini yükleyin. Referans için bir DNA boyutlandırma merdiveni ekleyin.
Kapağı ve elektrotları takın ve mini jeli 100 voltta çalıştırın, ta ki yükleme boyası bir mini jel için yaklaşık 4-7 santimetre gidene kadar. Tiazol portakalı jel dökümden önce uygulanmamışsa, jeli tiamzol içeren tampona batırarak yaklaşık 20 dakika veya bantlar tam olarak tespit edilene kadar hafif ajitasyonla lekeleyin. Jeli UV transilluminator kullanarak görselleştirmek için, jeli elektroforez cihazından çıkarın ve UV transilluminator'un üzerine yerleştirin.
Jeli mavi ışık transilluminator veya el feneri kullanarak görselleştirmek için, jeli mavi ışık transilluminator'un üzerine yerleştirin veya mavi LED el fenerini jelin üstünden veya altından yönlendirin. Mavi ışığı filtrelemek için kehribar emisyon filtresi kullanın, DNA tiazol turuncu komplekslerinden floresan görselleştirmesini ve boyaları korumasını sağlar. Daha fazla sindirim veya ligasyon için, jel istenilen DNA bantları kesip ve hazır bir kit veya protokol kullanarak DNA ayıklama devam.
Jel görüntüleme cihazında uygun uyarma ve emisyon ayarlarını seçin. Uygun filtrelere sahip bir görüntüleme sistemi yokluğunda, kamera ile jel mavi ışık uyarma kaynağı arasına bir kehribar filtre yerleştirin. Algılama limitleri ethidium bromür arasında benzer, tiazol turuncu, ve ortak bir mavi-ışık tespit edilebilir ticari DNA boyası, her üç boya için algılama sınırı bir mini jel şerit başına bir ila iki nanogram olmak.
Bir kısıtlama sindirim Thiazolturuncu lekeli agarose jel bir UV veya mavi ışık transilluminator veya mavi ışık el feneri ile heyecanlı zaman tespit edilebilir. Tiayzol portakalı ethidyum bromürden daha az tehlikeli görünse de eldiven ve gözlük gibi standart kişisel koruyucu ekipmanlar hala giyilmelidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, jel elektroforezinde DNA tespiti için etidyum bromüre kolay ve düşük maliyetli bir alternatif sunmaktadır. Araştırmacılar, tiazol oranj kullanarak floresan tespiti için UV veya mavi ışık kullanabilir ve böylece deneyler sırasında DNA'nın güvenliğini artırabilirler.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Moleküler Biyoloji
- Elektroforez Teknikleri
Arka Plan
- Etidyum bromür yaygın bir DNA boyasıdır ancak DNA bütünlüğü açısından riskler taşır.
- Tiazol oranj, DNA görselleştirme için daha güvenli bir alternatif sunar.
- Floresan tespiti, zarar vermeyen mavi ışık ile gerçekleştirilebilir.
- Bu yöntem maliyet etkin ve uygulaması kolaydır.
Çalışmanın Amacı
- Etidyum bromür kullanmadan DNA tespiti için bir protokol sağlamak.
- Jel elektroforezinde tiyazol oranjın etkinliğini göstermek.
- DNA görselleştirmesi için mavi ışık kullanmanın faydalarını vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Agaroz ve uygun tamponlar kullanılarak %1'lik mini jellerin hazırlanması.
- Jellerde etidyum bromürün tiyazol oranj ile değiştirilmesi.
- UV veya mavi ışık kullanılarak floresan deteksiyonu.
- Elektroforez sonrası DNA bütünlüğünün değerlendirilmesi.
Temel Sonuçlar
- Tiazol oranj, jel elektroforezinde DNA'yı etkili bir şekilde boyar.
- Saptama işlemi mavi ışık ile güvenli bir şekilde gerçekleştirilebilir.
- Protokol basit ve tekrarlanabilirdir.
- DNA hasarının azalması sayesinde, sonraki deneylerde başarı oranlarının arttığı görülmektedir.
Sonuçlar
- Tiyazol oranj, etidyum bromüre uygulanabilir bir alternatiftir.
- Mavi ışık kullanımı, tespit sırasında DNA hasarını minimize eder.
- Bu yöntem, sonraki moleküler biyoloji deneylerinin güvenilirliğini artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulanabilirlik Özeti
DNA jel elektroforezi, örnek bütünlüğünün sonraki aşamaların güvenilirliğini doğrudan etkilediği hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerinde temel bir iş akışı olmayı sürdürmektedir. Etidyum bromürün tiazol oranj ile değiştirilmesi, saptama hassasiyetini korurken genotoksik riski azaltarak daha güvenli bileşik tarama ve öncü bileşik belirleme süreçlerini destekler. Bu durum, biyofarma Ar-Ge ekiplerinin, verimlilikten veya maliyet etkinliğinden ödün vermeden klonlama, dizileme veya fonksiyonel analizler için DNA kalitesini korumalarına olanak tanır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef doğrulamayı yanıltabilecek boyama kaynaklı artefaktlara yol açmadan, DNA fragman analizi yoluyla hipotez testine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Mevcut UV veya mavi ışık görüntüleme altyapısıyla uyumludur ve halihazırda etidyum bromür kullanan laboratuvarlar için herhangi bir protokol yeniden tasarımına gerek duymaz.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Klonlama verimliliği veya PCR ürünü doğrulamada hassas fragman analizini destekleyerek, şerit başına 1-2 ng'lık saptama sınırları ile kantitatif DNA boyutlandırması sağlar.
- Operasyonel Değer: Etidyum bromür ile ilişkili tehlikeli atık yönetimi ve özel bertaraf gereksinimlerini ortadan kaldırarak laboratuvar güvenlik uyumluluğunu kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Ligasyon, transformasyon veya transfeksiyon gibi sonraki uygulamalar için DNA bütünlüğünü koruyarak, preklinik modeller için konstrükt oluşturma başarı oranlarını artırır.
- Operasyonel Değer: Mavi ışık ile görselleştirmeye olanak tanıyarak, UV kaynaklı örnek hasarını azaltır ve tekrarlanan deneyler arasındaki yeniden üretilebilirliği artırır.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem; özellikle genetik modifikasyonlar veya tarama sonuçları değerlendirilirken, DNA analizinin hedef doğrulamaya, öncü bileşik tanımlamaya ve preklinik konstrükt geliştirmeye temel oluşturduğu keşif biyolojisi iş akışına uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Hedef doğrulaması sırasında gen düzenlemelerinin, plazmit bütünlüğünün veya PCR amplikonlarının güvenilir şekilde değerlendirilmesine olanak tanıyarak, doğru DNA fragman ayrımı ve boyutlandırmasını destekler.
- Tarama: Nükleik asit bazlı analizlerde kütüphane çeşitliliğini değerlendirmek veya hit doğrulaması yapmak için gerekli olan tekrarlanabilir, kantitatif bant görselleştirmesi sağlar.
- Analitik: Örnekler arasında karşılaştırılabilir floresan yoğunluk verileri oluşturarak, farklı deneysel koşullar altında DNA veriminin veya saflığının tutarlı bir şekilde karşılaştırılmasına imkan tanır.
- Translasyonel Araştırma: Adayların preklinik testlere aktarılması için kritik olan memeli hücresi transfeksiyonu veya viral vektör üretimi için DNA fonksiyonelliğini korur.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Elektroforez donanımı veya yazılımının yeniden kalifikasyonuna gerek kalmadan ekipler ve merkezler arasında standardize edilebilen, doğrudan ikame edilebilir bir reaktif değişimini temsil eder.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Boya kaynaklı DNA hasarını minimize ederek mekanistik belirsizliği azaltır ve hedef değerlendirmesi için kullanılan moleküler biyoloji verilerinin güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Basit saklama koşullarına sahip (alikotlanmış, dondurulmuş DMSO stok), ucuz ve tehlikesiz thiazole orange kullanarak reaktif maliyetini ve güvenlik yükünü azaltır.
- Stratejik Değer: Örnek bütünlüğünü sonraki sekanslama, klonlama veya fonksiyonel analizler için koruyarak, devam/durdur kararının güvenilirliğini artırır.
- Portföy Etkisi: DNA tabanlı veri kalitesinin, öncü optimizasyonu ve preklinik aday seçimi kriterlerini karşılamasını sağlayarak risk ayarlı ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Agaroz jel hazırlama ve elektroforez konusunda moleküler biyoloji uzmanlığı.
- Saptama için UV veya mavi ışık transilüminatörü ve kehribar emisyon filtresine sahip standart elektroforez düzeneği.
- Homojen boyama sağlamak için dondurulmuş thiazole orange-DMSO alikotlarının tutarlı şekilde çözdürülmesi ve karıştırılması.
- Yeni örnek tiplerine uyarlanırken, model sistemlerde (örneğin plazmid, genomik DNA) boyama verimliliğinin doğrulanması.
- Kısıtlama: Elektroforez sonrası boyama kullanıldığında, ön dökümlü jel yöntemlerine kıyasla ek bir adım ekleyerek boyama süresinin (20 dk) optimizasyonunu gerektirir.
