Name: Büyük Uzamsal Ölçekler Üzerinde Biyofilm Morfogenezini Açıklamak için Otomatik 3D Optik Koherens Tomografisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 s
Description: Öğrenin, optik koherens tomografi kullanarak büyük uzamsal ölçeklerde mikrobiyal biyofilmlerin üç boyutlu morfogenezini nasıl izleyeceğinizi. Bu otonom sistem, biyofilm yapısının zamana bağlı dinamiklerini invaziv olmayan şekilde analiz etmenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mauricio Aguirre Morales'e bu sistemin gelişimine katkılarından dolayı teşekkür ederiz.  İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan T.J.B.'ye finansal destek geldi.

1. Konumlandırma Cihazının Kurulumu
<ol><li>https://github.com/grbl/grbl/wiki/Connecting-Grbl'daki talimatları izleyerek konumlandırma cihazını bir mikrodenetleyici panosuna bağlayın.</li>
	<li>Mikrodenetleyiciyi USB kablosu üzerinden internet bağlantısı olan tek kartlı bir bilgisayara bağlayın ve https://gitlab.com/FlumeAutomation/GRBL_Server.git açıklandığı gibi GRBL sunucusunu kurun. Şimdi konumlandırma cihazı http://IP:5020/ barındırılan bir web sayfasından gezilebilir olmalıdır. Alternatif olarak, konumlandırma aygıtı bir Python komut dosyası ile gezinilebilir, çalışılan örnek ImagesAcquisition.ipynb ilk bölümünde gösterildiği gibi (Ek Dosya 2).</li>
</ol>2. OCT Kurulumu
<ol><li>OCT probu, uyumlu bir güvercin kuyruk tutucusu kullanarak konumlandırma cihazına monte edin. Gerekirse, objektif lens üzerinde bir daldırma adaptörü yükleyin.</li>
	<li>Bilgisayarı ve OCT baz ünitesini deneyin yanındaki bir bankta yerleştirin (örn. mikroakışkan cihazlar, akış odaları, bacalar, filtrasyon sistemleri). Optik kablonun (yaklaşık 1,8 m maksimum uzunlukta) serbestçe hareket halinde olduğundan, amaçlanan tüm konumlara ulaşacak kadar uzun olduğundan ve deneysel kuruluma müdahale etmediğinden emin olun.</li>
	<li>OCT sistemini üretici tarafından açıklandığı gibi kullanılabilir yazılımla birlikte yükleyin.</li>
	<li>https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git açıklandığı gibi otomatik OCT tarar edinimi için yazılım paketlerini yükleyin.</li>
</ol>3. Görüntü Edinimi
<ol><li>OCT sisteminde ve konumlandırma cihazında güç. Aygıtın serbestçe hareket edediğinden emin olun.</li>
	<li>Config.json dosyasını metin düzenleyicisinde açın. Config.json dosyasını, kırılma indisi (20 °C'de su için 1,33, hava için 1,00) ve elde edilen veriler ve meta veriler için hedef klasörü gibi varsayılan görüntü edinme parametresini(Tablo2) ayarlamak için edin.</li>
	<li>Config.json'dagörüş alanının (FOV) boyutunu ve B taraması başına A-taramalarının sayısını tanımlayın. NOT: Bu iki parametre, son veri kümesinin voxel'lerinin boyutunu ve çıkış dosyasının boyutunu belirler ve probun optik çözünürlüğüyle eşleşmelidir (x-y voxel boyutu optik çözünürlüğün yarısından küçük olmamalıdır). A- ve B-taramalarının sayısı, mevcut disk alanı ve işlem gücüne karşı hangi takas-off kapsanacak mekansal ölçüde etkiler.</li>
	<li>Config.json'daçıkış OCT tonu'nun sinyal sınırlarını tanımlayın. Bunlar numunenin türüne bağlıdır. Bu nedenle, bir dizi ön taramanın yoğunluk histogramlarına göre bu parametrelerin belirlenmesi önerilir. config.json'dakideğişiklikleri kaydedin.</li>
	<li>OCT sondasını ilgi çekici bir siteye yönlendirin. En iyi görüntü kalitesi için numuneyi odaklayın ve referans kolunu ve ışık kaynağı yoğunluğunu ayarlayın. Bir dizi pozisyon için bu yordamı tekrarlayın ve koordinatları not edin. NOT: Bu, bu referans noktaları etrafında sonraki otomatik OCT taşma kaydedinimi sağlayacaktır. Referans kol uzunluğu ve yoğunluğunun otomatik görüntü edinimi sırasında değiştirilemeyeceğini unutmayın.</li>
	<li>Juypter Notebook'ta ImageAcquisition.ipynb dosyasını (EkDosya2) açın. Her hücre belirli görevleri gerçekleştirmek için kod içerir ve Hücre tuşuna basarak ayrı ayrı çalıştırılabilir | Çalıştırveya Ctrl + Enter veya Shift + Enter.<ol>
<li>Gerekli kitaplıklara ve varsayılan yapılandırma parametrelerine giden yolu ayarlayın. Alternatif olarak, geçici parametrelerin yeni bir kümesi tanımlayın.
</li>
		<li>Konumlandırma cihazına bağlanın ve OCT'yi başlatma.</li>
		<li>Konumlandırma cihazını kalibre edin (yanibir "homing" gerçekleştirin).</li>
		<li>Tek taşma veya mozaik desendeki ilgi alanlarını kapsayan veri kümelerini elde ederek sayıyı ve çakışmayı belirterek (örn., 0) komşu karolar. NOT: Bellek, bilgisayar kaynağı kullanımını en iyi duruma getiren tamadan önce ayrılır. Veriler depolama alanını kaydetmek için 8 bit *.ham formatta, config.json'datanımlanan hedef klasöre, zaman damgası ve adlandırma kuralı olarak konum (yani% Y%m%d_%H%M%S_<pozisyon>) kaydedilir. OCT ayarlarını ve koordinatlarını içeren meta veriler, aynı adlandırma kuralına sahip *.srm dosyasındaki aynı klasöre kaydedilir. FOV ve çözünürlük gibi ayarlara bağlı olarak, dosya boyutu OCT tarası başına 1,5 GB'a kadar ulaşabilir.</pozisyon></li>
	</ol>
</li>
	<li>Veri toplamanın kürtajını önlemek için, yeterli boş disk alanı olduğundan emin olun veya OCT veri kümelerini sürekli olarak harici bir sabit diske taşıyın.</li>
</ol>4. Görüntü Düzeltme ve Görüntüleme
<ol><li>OCT görüntü işleme (bozulma düzeltme, arka plan çıkarma, yükseklik haritaları nın hesaplanması, yükseklik harita dikiş) çalışmış bir örnek için Jupyter dizüstü ImageProcessing.ipynb (EkDosya1) açın.</li>
	<li>Gerekirse, sahte sinyalleri dışlamak ve veri kümesini yeniden yönlendirmek için OCT taramaları ekin (biyofilm substratum üzerinde görünmelidir).</li>
	<li>Küresel sapma için doğru. Bu düz olduğu bilinen son derece yansıtıcı referans yüzeyi kullanan bir düzeltme algoritması tarafından gerçekleştirilir (örneğin, baca alt, substratum). İlk olarak, algoritma 20 × 20 dikey çizgiler düzenli OCT scan xy düzlemi boyunca aralıklı bir ızgara tanımlar. Daha sonra, her noktanın etrafında dairesel bir alan seçer ve dikey profil boyunca sinyal yoğunluklarını ortalamar (Şekil2B). Dikey profiller değiştirilmiş bir Gauss filtresi ile işlenir: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59356/59356eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> x giriş sinyali ve σ standart sapma, C gibi belirlenir ise nerede: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59356/59356eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> Referans yüzeyi, bu profillerin her birinde yerel maxima olarak yerelleştirilmiştir. Yanlış tanımlanan noktalar komşularının konumlarına göre üç boyutlu olarak filtrelenir (Şekil2C). Son olarak, tazyik lensin getirdiği bozulmayı yansıtan2. Daha sonra monte edilen yüzey, her pikseli z yönünde kaydırmak için kullanılır ve böylece düzleştirilmiş bir görüntü elde edilir. Bu algoritmanın parametreleri OCT tolasının özelliklerine göre ayarlanmalıdır.</li>
	<li>Arka plan gürültüsü için doğru. Görüntünün boş bir alanını (genellikle biyofilm üzerinde) belirleyin ve düzeltme algoritmasını kullanarak görüntünün yoğunluk değerlerinden ortalama arka plan yoğunluğunu çıkararak son düzeltilmiş BIR OCT görüntüsü (Şekil2D)üretin.</li>
	<li>3D OCT veri kümesinden bir yükseklik haritası hesapla. Bu adımda, belirli deney (örneğin, substratum) için ilgi bir referans yüzeyi ve uygun bir eşik yoğunluğu tanımlayın. Daha sonra, ikili maskenin her koordinatı (x,y) için biyofilmin kalınlığını hesaplamak ve yeni bir 2B matris (Şekil3A)atamak için yükseklik haritası hesaplama algoritmasını kullanın. Kalınlık değerleri daha sonra x ve y yönünde orijinal görüntünün boyutu 2B matris atanır. Bir görüntü, yüzeyin yüksekliğinin gri tonlama değeri olarak raporlandığı bir görüntü haline getirilir (Şekil 3B).</li>
	<li>Birkaç OCT taramasımozaik bir desenle alınırsa, satır ve sütun sayısını tanımlayın ve ilgili yükseklik haritalarını dikin. Şekil 5, açıklanan kurulumla ulaşılabilecek geniş mekansal ölçek ve çözünürlük yelpazesini kapsayan dikişli yükseklik haritalarının örneklerini sunar.</li>
</ol>

<ol><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nature reviews. Microbiology. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Flemming, H. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilms%3A+an+emergent+form+of+bacterial+life%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biofilms: an emergent form of bacterial life.</a> Nature reviews. Microbiology. 14, 563(2016).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillation+characteristics+of+biofilm+streamers+in+turbulent+flowing+water+as+related+to+drag+and+pressure+drop%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Oscillation characteristics of biofilm streamers in turbulent flowing water as related to drag and pressure drop.</a> Biotechnology and Bioengineering. 57, 536-544 (1998).</li>
<li>Stoodley, P., Lewandowski, Z., Boyle, J. D., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+migratory+ripples+in+a+mixed+species+bacterial+biofilm+growing+in+turbulent+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">The formation of migratory ripples in a mixed species bacterial biofilm growing in turbulent flow.</a> Environmental microbiology. 1, 447-455 (1999).</li>
<li>Banin, E., Vasil, M. L., Greenberg, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Natural+Academy+of+Sciences+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Iron and Pseudomonas aeruginosa biofilm formation.</a> Proceedings of the Natural Academy of Sciences U.S.A. 102, 11076-11081 (2005).</li>
<li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Microbiology. 14, 251-263 (2016).</li>
<li>Battin, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+landscapes%3A+new+paths+to+biofilm+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial landscapes: new paths to biofilm research.</a> Nature Reviews. Microbiology. 5, 76-81 (2007).</li>
<li>Neu, T. R., Lawrence, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+techniques%2C+sensors%2C+and+approaches+for+imaging+biofilms+at+different+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales.</a> Trends in Microbiology. 23, 233-242 (2015).</li>
<li>Meleppat, R. K., Shearwood, C., Seah, L. K., Matham, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+coherence+microscopy+for+the+in+situ+investigation+of+the+biofilm%5BTitle%5D)+AND+%22J.+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical coherence microscopy for the in situ investigation of the biofilm.</a> J. of Biomedical Optics. 21 (12), 127002(2016).</li>
<li>Wagner, M., Horn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+in+biofilm+research%3A+A+comprehensive+review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography in biofilm research: A comprehensive review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 114, 1386-1402 (2017).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography.</a> Science. 254, 1178-1181 (1991).</li>
<li>Haisch, C., Niessner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualisation+of+transient+processes+in+biofilms+by+optical+coherence+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Visualisation of transient processes in biofilms by optical coherence tomography.</a> Water Resources. 41, 2467-2472 (2007).</li>
<li>Drexler, W., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDrexler%2C+W+%22Optical+Coherence+Tomography%3A+Technology+and+Applications%22">Optical Coherence Tomography: Technology and Applications</a>. , Springer Verlag. (2008).</li>
<li>Fercher, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+%E2%80%93+development%2C+principles%2C+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Medizinische+Physik%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography – development, principles, applications.</a> Zeitschrift für Medizinische Physik. 20, 251-276 (2010).</li>
<li>Lee, H. -C., Liu, J. J., Sheikine, Y., Aguirre, A. D., Connolly, J. L., Fujimoto, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrahigh+speed+spectral-domain+optical+coherence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Ultrahigh speed spectral-domain optical coherence microscopy.</a> Biomedical Optics Express. , 41236-41254 (2013).</li>
<li>Fortunato, L., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-situ+biofouling+assessment+in+spacer+filled+channels+using+optical+coherence+tomography+%28OCT%29%3A+3D+biofilm+thickness+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">In-situ biofouling assessment in spacer filled channels using optical coherence tomography (OCT): 3D biofilm thickness mapping.</a> Bioresource Technology. 229, 231-235 (2017).</li>
<li>Niederdorfer, R., Peter, H., Battin, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attached+biofilms+and+suspended+aggregates+are+distinct+microbial+lifestyles+emanating+from+differing+hydraulics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Attached biofilms and suspended aggregates are distinct microbial lifestyles emanating from differing hydraulics.</a> Nature Microbiology. 1, 16178(2016).</li>
<li>Roche, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benthic+biofilm+controls+on+fine+particle+dynamics+in+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Resources%22%5BJournal%5D)">Benthic biofilm controls on fine particle dynamics in streams.</a> Water Resources. 53, 222-236 (2016).</li>
<li>Fortunato, L., Jeong, S., Wang, Y., Behzad, A. R., Leiknes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+approach+to+characterize+fouling+on+a+flat+sheet+membrane+gravity+driven+submerged+membrane+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Bioresource+Technology%22%5BJournal%5D)">Integrated approach to characterize fouling on a flat sheet membrane gravity driven submerged membrane bioreactor.</a> Bioresource Technology. 222, 335-343 (2016).</li>
<li>Morgenroth, E., Milferstedt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+engineering%3A+linking+biofilm+development+at+different+length+and+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Environmental+Science+and+Bio%2FTechnology%22%5BJournal%5D)">Biofilm engineering: linking biofilm development at different length and time scales.</a> Reviews in Environmental Science and Bio/Technology. 8, 203-208 (2009).</li>
</ol>

Sebastian Schäfer, Thorlabs Inc.'de çalışmaktadır.

OCT görüntüleme de birkaç milimetre kare bir FOV ile mikrometre aralığında yapıları çözmek için uygundur. Böylece biyofilm araştırma için güçlü bir araçtır10,18. Ancak, OCT şu anda 100 maksimum tazyik alanı ile sınırlıdır - 256 mm2, biyofilm yapısal desenler genellikle bu mekansal ölçek aşaniken 19, özellikle morfolojik farklılaşma büyük ölçekli çevresel degradeler tarafından tahrik edilir 20- Bu protokol...

Biyofilmler son derece başarılı bir mikrobiyal yaşam tarzı adaptasyon ve mikroorganizmaların bu interfaz ilişkili ve matris kaplı topluluklar doğal ve endüstriyel ortamlarda mikrobiyal yaşam hakim1,2. Orada, biyofilmler karmaşık mimariler oluşturur, uzatılmış flamalar gibi3, dalgalanmalar4 veya mantar gibi kapaklar5 biyofilm büyüme için önemli sonuçları ile, yapısal istikrar ve strese direnç6. Biyofilm yapısal farklılaşma hakkında çok minyatür akış odalarında yetiştirilen mono-tür kültürleri üzerinde çalışma öğrenilmiş olsa da, çoğu biyofilm genelliklehayatıntüm etki alanları nın üyeleri de dahil olmak üzere son derece karmaşık topluluklar 6 . Bu karmaşık biyofilmlerin mikrobiyal manzaralar7 olarak takdir edilerek, biyofilm yapısının ve işlevinin karmaşık topluluklarda nasıl etkileştiğini anlamak biyofilm araştırmalarında ön plandadır.
Çevresel ipuçlarına yanıt olarak karmaşık biyofilmlerin morfogenezinin mekanistik bir şekilde anlaşılması, biyofilm fiziksel yapısının mekansal ve zamansal olarak çözümlenmiş gözlemleri ile birlikte dikkatle tasarlanmış deneyler gerektirir. ölçekler8. Ancak, deneysel sistemlerde biyofilm büyümesinin tahribatsız gözlemi, numunelerin (örneğin mikroskoba) taşınması ihtiyacı gibi lojistik kısıtlamalarla ciddi ölçüde sınırlandırılmıştır.
Burada sunulan protokol, biyofilm morfogenezinin mezoölçekte (mm aralığında) insitu, non-invaziv olarak izlenmesine olanak tanıyan optik koherens tomografisine (OCT) dayalı tam otomatik bir sistem sunmaktadır. OCT su arıtma ve biyofouling araştırma, tıp9 ve akarsu ekoloji10uygulamaları ile biyofilm araştırma ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir. OCT'de, düşük tutarlılıklı bir ışık kaynağı örnek ve referans koluna ayrılır; biyofilm (örnek kol) tarafından yansıyan ve dağılan ışığın paraziti ve referans kolunun ışığı analiz edilir. Derinliği çözülmüş yapısal bilgileri içeren bir dizi eksenel yoğunluk profili (A-taramaları) elde edilir ve B-taraması (bir kesit) ile birleştirilir. Bitişik B-taramaları bir dizi son 3D hacim tarama10oluşturur. OCT yaklaşık 10 μm aralığında bir yanal optik çözünürlük sağlar ve bu nedenle iyi biyofilmlerin mezoskopik yapısal farklılaşma incelemek için uygundur10,12. OCT daha ayrıntılı bir açıklama için, Drexler ve Fujimoto13ve Fercher ve meslektaşları14bakın. Tek bir OCT xy-scan'ın görüş alanı yüzlerce mikrometreye kadar ulaşsa da, daha büyük ölçekli desenler tek bir tarak OCT ile ölçülemez. Akarsu ve nehir gibi doğal habitatlarda biyofilmler ile ilgili olarak, bu şu anda yaşam alanının fiziksel ve hidrolik şablonu eşleşen ölçeklerde biyofilm morfogenez değerlendirmek için yeteneğimizi sınırlar.
Bu uzamsal sınırları aşmak ve OCT taramalarını otomatik olarak elde etmek için 3 eksenli bir konumlandırma sistemine spektral etki alanı OCT görüntüleme probu monte edilmiştir. Kurulum, 100 cm 2'ye kadar yüzey alanlarının tomografik görüntülemesini etkin bir şekilde sağlayarak, çakışan mozaikdesenli (çini taraması) birkaç OCT taramasının elde edilmesine izin verir. Ayrıca, bu sistemin yüksek konumlandırma hassasiyeti, uzun süreli deneyler sırasında belirli sitelerdeki biyofilm özelliklerinin büyümesini ve gelişimini güvenilir bir şekilde izlemenizi sağlar. Sistem modüler ve tek tek bileşenleri (yani, konumlandırma cihazı ve OCT) kurulum bağımsız çözümler olarak kullanılabilir veya esnek kombine. Şekil 1, kurulumun sabit ve yazılım bileşenlerine genel bir bakış sağlar.
Sistem, ticari olarak kullanılabilen GRBL kontrollü CNC konumlandırmacihazı (Malzeme Tablosu) ile test edilmiştir. Bu özel konumlandırma platformunun çalışma mesafeleri 600×840×140 mm olup, üretici tarafından +/- 0,05 mm ve 0,005 mm. GRBL programlanabilir çözünürlüğe sahip bir açık kaynak (GPLv3 Lisansı), CNC için yüksek performanslı hareket kontrolü Aygıtları. Bu nedenle, her GRBL tabanlı (sürüm > 1)'lik konumlandırma cihazı burada sunulan yönergeler ve yazılım paketleriyle uyumlu olmalıdır. Ayrıca, yazılım birkaç değişiklik ile STEP-DIR giriş türü ile diğer stepmotor denetleyicileri adapte edilebilir.
Sistemin performansını değerlendirmek için kullanılan OCTcihazı (Tablo Malzemeler) 930 nm (bant genişliği = 160 nm) merkezi dalga boyuna ve ayarlanabilir referans kol uzunluğu ve yoğunluğuna sahip düşük tutarlılık ışık kaynağına sahiptir. Burada sunulan örnekte, OCT probu akan suya daldırılan bir daldırma adaptörü de kullanılmıştır (Malzeme Tablosu). Otomatik OCT tsam alımı için burada geliştirilen yazılım paketi kritik sdk belirli OCT sistemi ile birlikte sağlanan bağlıdır, ancak, farklı tsam lensler ve merkezi dalga boyları ile aynı üreticinin OCT sistemleri olmalıdır kolayca uyumludur.
GRBL aygıtı tek kartlı bir bilgisayara yüklenen birweb sunucusu tarafından kontrol edilir (Şekil 1). Bu, yerel ağ veya internet erişimi olan herhangi bir bilgisayardan aygıtın uzaktan kontrol sağlar. OCT cihazı ayrı bir bilgisayar tarafından kontrol edilir ve OCT sisteminin otomatik deneysel kurulumu bir kenara bırakarak çalışmasını sağlar. Son olarak, yazılım paketleri, OCT sonda konumlandırma ve OCT taraması edinimi (yani, otomatik olarak mozaik desen veya tanımlanmış pozisyonlar kümesi nde 3D görüntüleme veri setleri elde etmek) senkronize etmek için kütüphaneler içerir. OCT probunun 3B'deki konumunun etkin bir şekilde tanımlanması, odak düzleminin (bölgesel) tarama kümeleri için özel olarak ayarlanmasına olanak tanır. Özellikle, pürüzlü yüzeylerde, her OCT tarariçin farklı odak düzlemleri (yani z yönünde farklı konumlar) belirtilebilir.
Ham OCT taramalarını işlemek için bir dizi yazılım paketi geliştirilmiştir (Tablo 1). Konumlandırma cihazının navigasyonu, OCT tarak edinimi ve veri seti işleme, yazılımın geliştirilmesi ve optimizasyonunda dikkate değer esneklik sağlayan Python kodlu Jupyter dizüstü bilgisayarlarla gerçekleştirilir. Bu tür defterlerin iki çalışılan ve açıklamalı örnekleri (sırasıyla görüntü edinme ve işleme için) https://gitlab.com/FlumeAutomation/automated-oct-scans-acquisition.git Özelleştirme için başlangıç noktası olarak tasarlanmıştır yönteminin. Jupyter dizüstü bilgisayar, açıklamalı Python koduna sahip hücreleri içeren web tarayıcısı tabanlı bir uygulamadır. Her adım, ayrı olarak yürütülebilen not defterinin bir hücresinde bulunur. Tarama merceğinden ışık yolunun farklı uzunluğu nedeniyle (küresel sapma)15, ham OCT taramaları bozuk görünür (Şekil 2A). Edinilmiş OCT taramalarında bu bozulmayı otomatik olarak düzeltmek için bir algoritma geliştirdik (ImageProcessing.ipynb, Ek Dosya1'de yeralmaktadır). Ayrıca, biyofilm morfolojisi daha önce membran sistemlerinde 16 olarak kullanılanbir 2D yükseklik haritası olarak görselleştirilebilir ve fayans dizisinde çekilen taramalardan elde edilen yükseklik haritalarının nasıl dikilebildiğini gösteriyoruz.
Son olarak, açıklanan laboratuvar kurulumunun işlevselliği, fototrofik akarsu biyofilminin akış hızının bir degradesine maruz kıldığı bir flume deneyi kullanılarak gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>OCT Probu</td><td>Thorlabs</td><td>GAN210C1</td><td>OCT görüntüleme cihazı</td></tr><tr><td>OCT tarama lensi</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-LK3-BB</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma adaptörü</td><td>Thorlabs&nbsp;</td><td>OCT-IMM3-SP1</td><td></td></tr><tr><td>Stepcraft 840 CK</td><td>STEPCRAFT</td><td>NA</td><td>konumlandırma cihazı</td></tr><tr><td>mikrodenetleyici</td><td>Arduino Uno R3</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tek kartlı bilgisayar</td><td>Raspberry PI</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>kamera</td><td>Canon EOS 7D Mark II</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>kamera lensi</td><td>Canon MACRO EFS 35 mm</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

büyük uzamsal Ölçekler Üzerinde biyofilm morfogenezini açıklamak için otomatik 3d optik koherens tomografisi

Automated 3D Optical Coherence Tomography to Elucidate Biofilm Morphogenesis Over Large Spatial Scales

Biyofilmler en başarılı mikrobiyal yaşam tarzı dır ve çok sayıda çevresel ve mühendislik ortamlarında hakimdir. Biyofilm morfogenezi anlamak, yani topluluk meclisi sırasında biyofilmlerin yapısal çeşitlendirilmesi, mekansal ve zamansal ölçekler arasında dikkate değer bir meydan okumayı temsil etmektedir. Burada optik koherens tomografisine (OKT) dayalı otomatik bir biyofilm görüntüleme sistemi salıyoruz. OCT biyofilm araştırmalarında ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir. Ancak, şu anda elde edilebilen ve işlenebilen veri miktarı, biyofilm morfolojisinde büyük ölçekli desenlerin istatistiksel çıkarımını engellemektedir. Otomatik OCT görüntüleme sistemi biyofilm büyüme büyük mekansal ve genişletilmiş zamansal ölçekler kapsayan sağlar. Bir robot konumlandırma platformu ve OCT tarama sondasının konumlandırılmasını kontrol etmek için bir dizi yazılım çözümleri ile ticari olarak kullanılabilir bir OCT sistemini birleştirir, ayrıca 3D biyofilm görüntüleme veri kümelerinin edinimi ve işlenmesini de. Bu kurulum biyofilm geliştirme yerinde ve non-invaziv otomatik izleme sağlar ve daha fazla makrofotoğrafçılık ve mikrosensör profilleme ile çift OCT görüntüleme için geliştirilebilir.

Fototrofik akarsu biyofilmlerinin spatio-temporal morfogenezini incelemek üzere tasarlanmış bir flume deneyi kullanarak otomatik OCT görüntüleme sisteminin işlevselliğini gösteriyoruz. Flumes'in yavaş yavaş daralan geometrisi, baca merkezi boyunca akış hızında degradelere neden olur (bkz. referans17).  Hidrodinamik koşulların biyofilm morfogenezi üzerindeki etkilerini daha iyi anlamak amacıyla biyofilmin zamansal gelişimi ve yapısal farklılaşması 18 gün boyunca izlendi. Şekil</s...

Mikrobiyal biyofilmler interfazlarda karmaşık mimariler oluşturur ve yüksek ölçekli-bağımlı uzamsal desenler halinde gelişirler. Burada, 3D optik koherens tomografisi (OCT) veri kümelerinin otomatik olarak edinimi için deneysel bir sistem (sert ve yazılım) sıyoruz. Bu araç seti, uzay ve zamanda biyofilm morfogenezinin non-invaziv ve çok ölçekli karakterizasyonuna olanak sağlar.

Büyük Uzamsal Ölçekler Üzerinde Biyofilm Morfogenezini Açıklamak için Otomatik 3D Optik Koherens Tomografisi

Biofilms are a most successful microbial lifestyle and prevail in a multitude of environmental and engineered settings. Understanding biofilm ...

Burada optik koherens tomografi veya OKT dayalı otomatik bir sistem salıyoruz. Bu bize büyük uzamsal ölçekler veya uzun süreler boyunca biyofilmlerin yapısını izlemek için izin verir. OCT görüntüleme de mikrometre aralığında yapıları çözmek için uygundur, ancak şu anda yaklaşık 250 milimetre kare maksimum alanı ile sınırlıdır.Biyofilmler genellikle bu ölçeği aşar, özellikle farklılaşma büyük ölçekli çevresel degradeler tarafından yönlendirilir. Deneysel kurulum bize büyük uzamsal ölçekler ve uzun süreler boyunca biyofilmlerin üç boyutlu morfogenez izlemek için izin verir. Sistem hızlı, hassas ve bağımsız olarak çalışır.Biyofilmlerin önemli ekosistem süreçlerini yönlendirdikleri akarsularda morfogenezi inceledik. Ancak, sistem diğer doğal sistem veya mühendislik ortamlarda biyofilmleri incelemek için kullanılabilir. Konumlandırma, görüntü edinme ve analiz için yazılım Python'da yazılmıştır.Jupyter Notebook'lardan edinilebilirler. Bunlar kullanıcı dostu, serbestçe kullanılabilen ve esnek çözümlerdir. Kurulumun görsel gösteriminin diğer kullanıcıların yüklemeyi yeniden oluşturmasına ve yazılımı daha iyi anlamasına yardımcı olduğuna inanıyoruz.Bunun diğer araştırmacılara da benzer yaklaşımları benimsemeleri için ilham verdiğini umuyoruz. Yüklemeye genel bir bakış aşağıda veda edebilirsiniz. Sistem hassas bir konumlandırma cihazı oluşur, OCT prob, ve bir pleksiglas flume etrafında monte edilir.GitHub'da yayınlanan yönergeleri izleyerek konumlandırma cihazını kablolayarak başlayın. Bağlandıktan sonra, ayrı bir GitLab sayfasında açıklandığı gibi GRBL sunucusunu yükleyin. Konumlandırma sistemi artık bu web sayfası üzerinden kontrol edilebilir;alternatif olarak çalışılan örnekte gösterildiği gibi python komut dosyası ile kontrol edilebilir.Bilgisayarı ve OCT temel ünitesini mikroakışkan aygıtlar, akış odaları, flumes veya filtrasyon sistemleri içeren deneysel kurulumun yanına yerleştirin. Zaten yüklü değilse, üretici tarafından açıklandığı gibi kullanılabilir yazılım ile birlikte OCT sistemini yükleyin. Daha sonra, buraya bağlı GitLab belgelerinde açıklandığı gibi otomatik OCT tbms edinimi için yazılım paketlerini yükleyin.Görüntü edinimi başlatmak için, uyumlu bir dovetail tutucu kullanarak konumlandırma cihazına optik koherence tomografi probu monte edin. Gerekirse, objektif lens üzerine bir daldırma adaptörü, daha sonra OCT sistemi ve konumlandırma cihazı güç yükleyin. Ticari OCT yazılımını açın, ilgi çekici bir site bulun, örneğe odaklanın ve en iyi görüntü kalitesi için referans kolunu ve ışık kaynağı yoğunluğunu ayarlayın.Aynı referans kol uzunluğu ve yoğunluğunu korurken koordinatları not edin ve bir dizi pozisyon için bu yordamı tekrarlayın. ImageAcquisition'ı açın. ipynb dosyası jupyter Notebook bu makalenin Ek Dosya 2 bulundu.Her hücre belirli görevleri gerçekleştirmek için kod içerir ve Hücre'ye basarak ayrı olarak çalıştırılabilir ve ardından Çalıştır veya Çalıştır ve Gir veya Değiştir ve Gir. OCT tarayıcısını devreye almak için konumlandırma aygıtını kalibre etmek için konumlandırma aygıtını bağlamak için gerekli kitaplıklara giden yolu ayarlamak için çalışılan örneği izleyin. Ardından, kırılma indisi, görüş alanının boyutu ve B taraması başına A taraması sayısı da dahil olmak üzere edinme parametrelerini ayarlayın.Ayrıca, ilk taramaların yoğunluk histogramlarını ve elde edilen veriler ve meta veriler için hedef klasörü temel alınarak OCT taramasının sinyal sınırlarını belirleyin. Görünüm ve çözünürlük alanına bağlı olarak, dosya boyutu OCT tadına göre 1,5 gigabayta kadar ulaşabilir. Bu iki parametre, son veri kümesindeki voksellerin boyutunu ve çıktı dosyasının boyutunu belirler.OCT sondasının optik çözünürlüğüyle eşleşmeliler. Çalışma örneğinde vurgulandığı gibi, varsayılan parametrelere sahip tek bir OCT taradığı veya farklı bir parametre kümesini belirten tek bir tbmm elde edebilirsiniz. Ayrıca konumlandırma aygıtını taşımak ve tek bir OCT tonu elde etmek için belirli koordinatlar sağlayabilirsiniz.Bu özellik, yüksek uzamsal doğrulukla denemede aynı konuma tekrar tekrar dönmenizi sağlar. Veriler 8bit olarak kaydedilir. depolama alanı kazanmak için ham format.OCT ayarları ve koordinatları da dahil olmak üzere meta veriler, aynı adlandırma kuralına sahip bir json dosyasındaki aynı klasöre kaydedilir. Alternatif olarak, ilgi çekici pozisyonların bir listesini belirtin ve ilgili OCT taramalarını otomatik olarak edinin. Biyofilm morfolojik yapılarını büyük çevresel degradeler arasında karakterize etmek için mozaik desenli taramalar elde edin.Bunun için, %30 varsayılan çakışma ile komşu döşeme sayısını belirtin Ham OCT taramaları bozuk görünür. Bunun nedeni optik sistem üzerinden yol uzunluğu farklılıkları. Bu bozulmayı düzelten bir algoritma geliştirdik.Görüntü düzeltmeye başlamak için Jupyter dizüstü bilgisayar ImageProcessing.ipynb'yi açın. Bu örneği takiben, sahte sinyalleri dışlamak ve biyofilm substratum üzerinde görünecek şekilde veri kümesi yeniden yönlendirmek için ilk OCT taramaları kırpma. Küresel sapma için bir sonraki düzeltme.Bunu başarmak için algoritma, OKT taramasında son derece yansıtıcı düz bir yüzeyi yerelleştirir ve taramaları düzleştirmek için bunu referans olarak kullanır. 20'ye 20'lik bir ızgarada algoritma, referans yüzeyini yerelleştirmek için sinyal yoğunluğunda yerel maxima'yı tanımlar. Daha sonra ikinci bir sıra polinom yüzeyi bu noktalar arasında takılır ve Z yönünde OCT tamacının her pikselini kaydırmak için kullanılır.Bu algoritmanın parametreleri OCT tolasının özelliklerine göre ayarlanmalıdır. Bu düzeltme, birden fazla görüntü de homojen bir referans yüzeyi sağlar ve böylece büyük ölçekli görüntülerin dikiş kolaylaştırır. Görüntü düzleştirildikten sonra, görüntünün biyofilm üzerindeki boş bir alanı tanımlayarak ve ortalama arka plan yoğunluğunu azaltarak görüntüler arka plan gürültüsü için düzeltilir.Sonraki 3D OCT veri kümesinden bir yükseklik haritası hesaplayın. Bunu yapmak için, substratum gibi bir referans yüzeyi tanımlayın ve uygun bir yoğunluk eşiği seçin. Daha sonra gri tonlama değeri olarak bildirilen biyofilmin yüksekliği ile bir yükseklik haritası işlenir.Görüntüler mozaik desenli olarak elde edildiyse, dikiş algoritması uygulayarak ilgili yükseklik haritalarını dikin. Fototrofik akım biyofilmlerinin spatiotemporal morfogenezi flume deneyleri kullanılarak otomatik OCT görüntüleme kullanılarak incelendi. Flumes pleksiglas yapılır ve yavaş yavaş çıkış için içinde genişletmek.Bu akış hızı bir degrade ile sonuçlanır. Burada tüm akış hızı gradient boyunca büyüyen bir biyofilm bir yükseklik haritası. Daha da önemlisi, otomatik OCT görüntüleme sistemi, düşük akış hızından yüksek akış hızı koşullarına kadar farklı akış koşullarında biyofilm kalınlığı, pürüzlülük ve biyohacim gibi yapısal parametrelerin sürekli olarak ölçülmesine olanak tanır.Morfolojik değişikliklerin yanı sıra, ortalama biyohacim flume girişine uzaklık bir fonksiyonu olarak önemli ölçüde azalmıştır. OCT taramalarının kalitesi referans kol uzunluğuna ve odak mesafesine bağlıdır. Denemeler sırasında bu parametreyi rendelemeniz gerekebilir.Konumlandırma cihazının doğruluğunu sağlamak için düzenli olarak homing işlemleri yapmayı unutmayın. Bu otomatik görüntüleme cihazı kolayca biyofilmlerin fonksiyonel bir karakterizasyonu için mikrosensör profilleme ile birleştiğinde olabilir. OCT yeni ortaya çıkan bir görüntüleme tekniğidir ve burada sunulan sistemin biyofilm yapısı üzerine araştırmayı teşvik ettiğini öngörüyoruz.Bu, içme suyu arıtma veya biyoişleme gibi teknolojiler için geçerli olabilir.

automated-3d-optical-coherence-tomography-to-elucidate-biofilm

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Source: Huang, Y. et. al., Optik Koherens Tomografi Kullanarak Üç Boyutlu Tümör Sferoidlerinin Boylamsal Morfolojik ve Fizyolojik İzlemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, yüksek çözünürlüklü kesitsel görüntüler yakalayarak çok kuyulu bir plakadaki tümör sferoidlerini izlemek için optik koherens tomografinin (OCT) kullanımını göstermektedir. OCT, hücresel yapılardan gelen ışık yansımalarını analiz ederek, boyut ve şekil gibi morfolojik özellikleri değerlendirmek için 3D modeller oluştururken, aynı...

Optik Koherens Tomografi ile Tümör Sferoidlerinin Morfolojik ve Fizyolojik İzlenmesi 

Biyofilmler içindeki üç hücresel ve hücre dışı bileşenin eşzamanlı niceliği ve karşılaştırılması için bir protokol sunulmuştur. Metodoloji, konfokal lazer tarama mikroskobu, biyofilm yapısal analiz ve görselleştirme yazılımı ve istatistiksel analiz yazılımının kullanımını içerir.

Hücresel ve Biyofilmler Ekstrasellüler Bileşenleri Eşzamanlı Kantitasyonu

Bu çalışma, bir ince biyolojik bakteri tabakası ve in situ ara yüzeylerde mikro-organizmalar tarafından yapılmış karmaşık yaşam malzemenin lokal mekanik özelliklerini ölçmek için özel bir manyetik cımbız geliştirilmesi tohumlanmış manyetik parçacıkların uzaktan harekete dayalı orijinal bir yöntem göstermektedir.

Için Mikrometrik Sondalar uzaktan manyetik uyarılı<em&gt; In situ</emBakteriyel biyofilm Fiziksel Özelliklerinin&gt; 3D Mapping

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Bu protokol büyümek ve niteliksel konfokal ve elektron mikroskobu ile mantar hif bakteri biyofilm analiz etmek için yeni bir yöntem açıklanır.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Biz derleme işlemi, tarif ve gerçek zamanlı akış iken altında görüntü mantar biyofilm oluşumu için bir akış cihazları temizlik tasarlanmış. Biz de sağlamak ve elde edilen görüntülerde kullanılmak üzere sayısal algoritmalar tartışıyorlar.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Bu makale, optik koherens elastografi (OCE) tekniğinin biyofilm elastik özelliklerini hızlı ve tahribatsız bir şekilde karakterize etmedeki etkinliğini vurgulamaktadır. Doğru ölçümler için kritik OCE uygulama prosedürlerini açıklıyoruz ve iki granüler biyofilm için Young modül değerlerini sunuyoruz.

Optik Koherens Elastografi Kullanılarak Çevresel Biyofilmlerin Elastik Özelliklerinin Ölçülmesi

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Bu el yazması, yeni nesil dizileme için DNA parçalarını saflaştırmak için otomatik bir jel boyutu seçim yaklaşımını açıklamaktadır. Ranger Teknolojisi, agaroz jel yükleme, elektroforetik analiz ve hedeflenen DNA parçalarının geri kazanılması sürecinin tamamının tam otomasyonunu sağlayarak yüksek verimli ve yüksek kaliteli yeni nesil dizileme kitaplıklarına olanak tanır.

Otomatik Jel Boyut Seçimi Çevre Su Örneklerinden hazırlanmıştır nesil Sıralama Kütüphaneler Kalitesi Geliştirmek için

Öğrenin, optik koherens tomografi kullanarak büyük uzamsal ölçeklerde mikrobiyal biyofilmlerin üç boyutlu morfogenezini nasıl izleyeceğinizi. Bu otonom sistem, biyofilm yapısının zamana bağlı dinamiklerini invaziv olmayan şekilde analiz etmenizi sağlar.

Büyük Uzamsal Ölçekler Üzerinde Biyofilm Morfogenezini Açıklamak için Otomatik 3D Optik Koherens Tomografisi

Daha fazla video keşfet