Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers
April 9th, 2019
Burada, bir protokol kültür insan enteroid veya ana bilgisayar microbiota epitel etkileşimleri hücresel ve biyokimyasal düzeyde çalışmaya sağlam bariyer fonksiyonu var colonoid monolayers mevcut.
Lümen bakteri veya virülans faktörleri için doğrudan erişilebilir değildir çünkü 3D bağırsak organoid kültürü konak epitel-patojen etkileşim çalışma sınırlar. Ayrıca, küçük moleküller, proteinler veya mukus gibi salgılanan maddeler, aşağı akım analizi için 3B kültürden kolayca örneklenemez. Bu sınırlamaları gidermek için, 3D insan enteroidlerini veya kolonoidlerini tek katmanlı dönüştürmek için değiştirilmiş bir protokol salıyoruz.
Kolonoid monolayers patojen-mukus etkileşimex vivo çalışmalar için izin, kalın, apikal mukus tabakası salgılar. Bu yöntem, enfeksiyon üzerine erken bağırsak konak-patojen etkileşimleri incelemek için çekilebilir bir model sağlamayı amaçlamaktadır. Kolonoid monolayers mukus biyolojisi çalışmak için yeni bir yol sağlayacak, hangi konak-patojen etkileşimi önemlidir, mikrobiyom çalışmaları, ve inflamatuar barsak hastalığı.
Bu yöntem üst Gi sistemi, solunum sistemi ve kadın üreme sistemi gibi diğer mukus salgılayan organlara uygulanabilir. Görsel gösteri monolayer büyüme sırasında mukus koruma ve immünboyama için fiksasyon sırasında kullanıcıyardımcı olacaktır. Prosedürü gösteren Karol Dokladny, bizim laboratuvar bir personel bilim adamı olacaktır.
Kaplanmış hücre kültürünü kuluçkaya yatırdıktan sonra, kültür ortamını 24 kuyulu plakadan aspire edin ve her kuyuda bir mililitrelik buz gibi hasat çözeltisi ile değiştirin. Yerinden çıkarmak ve bodrum membran matris pelet kırmak için bir mini hücre kazıyıcı kullanın. Kuyu kenarlarına yakın herhangi bir malzemeye özellikle dikkat edin.
Daha sonra, 30 ila 45 dakika boyunca dört santigrat derece dakikada yaklaşık 200 devrimleri bir yörünge shaker plaka ajite. Hücre süspansiyonuna triturate steril filtre uçları ile donatılmış bir P200 tek kanallı pipet kullanın. Hücre süspansiyonuna 15 mililitrelik konik bir şişede teslim edin.
Toplam süspansiyon hacmi altı mililitreden büyükse birden fazla şişe kullanın. Bundan sonra, 10 milimolar HEPES içeren Gelişmiş DMEM/F12 orta eşit hacimli şişe içine ekleyin, L-alanyl-L-glutamin dipeptid, ve penisilin-streptomisin. Bu yıkama aracı.
Şişeyi karıştırmak için 3-4 kez ters çevirin. Santrifüj 300 kez g 10 dakika boyunca dört santigrat derece. Hücre kaplaması öncesinde, kaplamalı kesici uçları doku kültürü kuluçka makinesinde en az 30 dakika denk verin.
Her kesici uç için, 37 derece-Celsius su banyosunda bir mililitre genleşme ortamı ısıtın ve iki inhibitör ekleyin. Sonra, kuyulara karışımı ekleyin. Hücre peletini içeren tüpten yıkama ortamını aspire edin ve genleşme ortamını kesici uç başına en az 100 mikrolitre verim ve resuspend için yeterli bir hacimle değiştirin.
Daha sonra, her kesici uçtan kollajen IV çözeltisini aspire edin ve kesici uç başına 150 mikrolitre yıkama aracıyla iki kez yıkayın. Pipet 600 mikrolitre genleşme ortamı her kesici uç altındaki boşluğa. Pipet her kesici uç içine şişeden hücre süspansiyon 100 mikrolitre.
Plakayı doku kültürü kuluçka makinesine geri getirin ve en az 12 saat boyunca rahatsız edilmeden bırakın. Plakayı sallamaktan veya keskin bir şekilde eğmekten kaçının. Kuluçkadan sonra, plakayı 2,5 ila 10 kat objektif lensle faz kontrastlı ışık mikroskobuna yerleştirin.
İnhibisyon tedavisini durdurmak için inhibitörler olmadan kültür ortamı ile yenileyin. Ortam anına kadar her 2-3 günde bir ortamı yenilemeye devam edin. Hücre kültürünü ince uçlu forseps veya cımbızla 24 kuyulu plakadan kaldırın.
Apikal ortamı çıkarmak ve kesici uça tutunan dış sıvıyı silmek için laboratuvar mendil kağıdını dikkatlice ters çevirin. Yeni bir 24-well plaka, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca buzul asetik asit ve mutlak etanol bir ila üç çözelti sokulması ekler. Sonra, bankta, fiksatif kaldırmak için doku kağıt üzerine eklemek ters.
Uçları, standart immünboyama protokollerine geçmeden önce hücreleri yeniden sulandırmak için 1X PBS ile dolu plastik bir kapta 10 dakika yerleştirin. Korumak için, kesici uç membranÇevresini kesmek için bir jilet kullanın. Forceps kullanarak, bir cam mikroskop slayt membran aktarın.
Sonra, montaj ortamı ekleyin ve bir kapak cam yapıştırın. Bu deneyde, insan enteroid ve kolonoid kültürleri 3D yapılar olarak yetiştirilen, daha sonra ayrıştırılmış ve insan-kollajen-IV kaplı hücre kültürü ekler kaplama için parçalanmış. Monolayer oluşumunun gelişimi parlak alan mikroskobu ve immünoresans boyama yoluyla günlük olarak izlenir.
İnsan kollajen-IV kaplı filtreler üzerine tohumlanmış kolonoid parçaları tohumlamadan iki ila dört gün sonra birden fazla tek katmanlı ada oluşturur. Hem maksimum yoğunluklu projeksiyon hem de konfokal optik Z-kesiti ile ilgili ortogonal projeksiyonlar hücresiz alanların hem nükleer hem de apikal F-aktin boyama yokluğunda tanımlanabilir olduğunu göstermektedir. Sürekli apikal yüzeye sahip bir konfluent kolonoid monolayer F-aktin immünostaining tarafından yaklaşık bir hafta sonrası tohumlama tespit edildi.
Temsili maksimum yoğunluklu projeksiyon ve konfokal optik bölümün ilgili ortogonal projeksiyonlarla yüksek büyütmesi, konfluent kolonoid monokattaki hücrelerin F-actin periihtiyati halkaları ve olgunlaşmamış apikal fırça sınırını oluşturduğunu göstermektedir. EdU incorporation jejunal monolayer diferansiyasyon sırasında proliferasyon kaybı gösterir. Farklılaşmamış jejunal monolayers daha geniş var, kısa hücreler, ve daha az olgun apikal aktin tabanlı fırça sınırı farklılaşma beş gün sonra jejunal monolayers ile karşılaştırıldığında.
Kolonoidlerin parçalanması çok önemli. Parçalar çok büyükse, kaplamalı filtreye bağlanmaz, bunun yerine 3D kolonoide dönüşürler. Kolonoid monolayers üzerinde mukus biyolojisi çalışmak için değiştirilmiş bir yöntem sunduk.
Patojen ve bağırsak apikal yüzeyi arasındaki etkileşimi görmek için diğer konak-patojen çalışmaları yapılabilir.
Genel Bakış
Bu makale, bütün bariyeri koruyan insan enteroid veya kolonoid tek katman kültürü için modifiye edilmiş bir protokol sunmaktadır. Bu model, hücresel ve biyokimyasal düzeyde konak epitel-mikrobiyota etkileşimlerinin çalışmasına olanak tanımaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Mikrobiyoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- 3D bağırsak organoidleri, konak-patojen etkileşimlerinin çalışılmasını sınırlandırmaktadır.
- Bakteri veya virülans faktörleri için lümen erişimi kısıtlanmıştır.
- 3D kültürlerden salgılanan materyallerin örneklenmesi zordur.
- Kolonoid tek katmanlar, mukus biyolojisinin çalışılması için yeni bir model sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bağırsak konak-patojen etkileşimlerinin çalışılması için uygulanabilir bir model geliştirmek.
- Patojene-mukus etkileşimlerinin ex vivo çalışmalarını kolaylaştırmak.
- İnflamatuar bağırsak hastalığı ve mikrobiyota çalışmaları ile ilgili mukus biyolojisi araştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- 3D insan enteroidlerin veya kolonoidlerin tek katmanlara dönüştürülmesi.
- Hücrelerin çözülmesi için mini hücre kazıyıcı ve yörüngesel çalkalayici kullanımı.
- Tek katman oluşumunu izlemek için immün boyama protokolleri.
- Analiz için parlak alan mikroskobu ve konfokal görüntüleme.
Ana Bulgular
- Kolonoid tek katmanlar kalın bir apikal mukus tabakası salgılar.
- Konfluan tek katmanlar sürekli apikal yüzeyler ve F-aktin perijunksiyonel halkaları sergiler.
- Jejunal tek katman farklılaşması sırasında proliferasyonun aşamalı kaybı gözlendi.
- Kolonoidlerin parçalanması, filtrelere başarılı bir şekilde yapışma için kritiktir.
Sonuçlar
- Modifiye edilmiş protokol, mukus biyolojisinin etkili şekilde çalışılmasına izin verir.
- Kolonoid tek katmanlar, konak-patojen etkileşimlerine ilişkin içgörüler sağlar.
- Bu yöntem, diğer mukus salgılayan organlarda da uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Human colonoid monolayers provide a physiologically relevant ex vivo model for studying host-pathogen interactions at the intestinal epithelium, addressing limitations of 3D organoid systems in accessing luminal surfaces and sampling secreted factors. This platform enables mechanistic de-risking of therapeutic targets by modeling early mucosal barrier interactions relevant to infectious disease and inflammatory bowel disease pipelines. The system supports predictive confidence in target validation through quantifiable outputs like transepithelial resistance and mucus layer formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modeling pathogen-mucus interactions and epithelial barrier function under physiologically relevant conditions.
- Operational Value: Supports functional target validation through measurable outputs such as transepithelial electrical resistance and apical mucus secretion, facilitating biological de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing confluent, differentiated monolayers with intact barrier function suitable for compound screening.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through defined monolayer formation metrics and quantifiable readouts like F-actin staining and EdU incorporation.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance and translational biomarker alignment by modeling mucus biology implicated in inflammatory bowel disease and host-microbiome interactions.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling evaluation of pathogenic or commensal microbiota effects on specific intestinal cell populations.
Pipeline & Workflow Integration
The method positions within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification to preclinical evaluation, supporting iterative assessment of host-targeted and microbiota-modulating therapeutics.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing, pathway clarification, or biological de-risking by enabling direct observation of pathogen interactions with the apical epithelial surface and mucus layer.
- Screening: Describes assay readiness, reproducibility, or quantitative outputs when supported by the article through daily monitoring of confluence via bright field microscopy and endpoint analysis via immunofluorescence for F-actin and mucus markers.
- Analytics: Highlights measurements, readouts, or statistical outputs that help teams compare conditions including transepithelial electrical resistance to monitor barrier integrity and EdU incorporation to assess differentiation-dependent proliferation loss.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity or biomarker alignment only when the source supports it by linking mucus secretion patterns to pathophysiological processes in inflammatory bowel disease and infectious colitis models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability rather than a single-use technique through its applicability across mucus-secreting organs and adaptability to diverse pathogen-commensal-host interaction studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in host-pathogen engagement mechanisms.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of monolayer formation across inserts and experimental replicates.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk by identifying ineffective mucosal-targeting interventions early.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative barrier function and mucus layer integrity data.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in stem cell culture, tissue dissociation, and epithelial cell biology.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including orbital shakers, phase contrast and confocal microscopes, and equipment for transepithelial resistance measurement.
- Cross-team standardization requirements for monolayer quality control using defined morphological and molecular markers.
- Adaptation considerations across model systems including upper GI, respiratory, and female reproductive tract applications as noted in the source.
- Practical limitations supported by source material including the critical requirement for adequate colonoid fragmentation to prevent 3D re-formation and ensure monolayer attachment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:22
Isolation and Dissociation of Enteroids/Colonoids from 3D Culture
2:39
Plating the Enteroid/Colonoid Suspension
4:10
Fixation to Preserve and Immunostain Mucus
5:16
Results: Establishment and Evaluation of Human Enteroid/Colonoid Monolayers
6:51
Conclusion
