Somite türevleri indüklenen insan nesil Vitro Pluripotent kök hücreler

Somit türevlerinin indüklenen pluripotent kök hücrelerden veya iPSC'den indüksiyonu, rejeneratif tedavi veya hastalık araştırma uygulamaları için pluripotent kök hücrelerin kullanılması için kritik bir adımdır. Bu teknik, kimyasal olarak tanımlanmış koşullar altında insan iPS hücrelerini miyotom, dermatome, sklerotom ve syndetome hücreleri gibi somit türevleri olarak ayırt etmek için kullanılabilir. İnatçı kas-iskelet sistemi bozukluğu olan bir hastadan kurulan iPSC kullanılarak, bu yöntem hastalığın fenotipini modellemek ve yeni ilaç tedavilerini test etmek için kullanılabilir.

Bu yöntem aynı zamanda insan embriyogenezi sırasında paraxial mezoderm gelişiminin altında yatan biyoloji ve mekanizmaları anlamamızı ilerletmek için de uygulanabilir. Presomitik mezoderm indüksiyonuna başlamadan dört gün önce, dört santigrat derecede bir gece kuluçka için dört mililitre hücre dışı matriks çözeltisi içeren 10 santimetrelik bir çanak kaplayın. Ertesi sabah, hücre dışı matris çözeltisini sekiz mililitre besleyicisiz hücre kültürü ortamıyla değiştirin.

Besleyicisiz kültüre başlamak için, insan iPSC kültürünü PBS ile yıkayın ve kültür yemeğine bir mililitre CTK çözeltisi ekleyin. Hücreler çanak alttan ayırmaya başladığında, yemeğe bir mililitre besleyicisiz hücre kültürü ortamı eklemeden önce tüm SNL besleyici hücrelerini tamamen kaldırmak için kültürü iki kez taze PBS ile yıkayın. Kök hücreleri el ile ayırmak ve hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir hücre kazıyıcı kullanın.

Hücre çözeltisini 1,000 mikrolitrelik pipet ucuyla üç kez hafifçe pipetlendirin ve hücreleri hücre dışı matris kaplı kültür yemeğine aktarın. Daha sonra hücreleri üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Kuluçka sonunda, presomitik mezoderm indüksiyon ortamı sekiz mililitre ile besleyici içermeyen hücre kültürü ortamı nı değiştirin ve hücre kültürü kuluçka merkezinde presomitik mezoderm farklılaşmasını önümüzdeki dört gün boyunca başlatın, üçüncü gün ortayı değiştirin.

Kuluçka sonunda, akış sitometri tarafından delta benzeri protein 1 pozitif hücreleri izole ve santrifüj tarafından sıralanmış hücreleri toplamak. Sayma için somitik mezoderm indüksiyon ortamı bir mililitre pelet resuspend, ve tohum bir kez 10 beşinci hücrelere bir ekstrasellüler matris solüsyon kaplı 12-iyi plaka içeren somitik mezoderm indüksiyon orta bir mililitre içeren 10 mikromuasi ile takviye, veya ROCK, inhibe Y-27632. Daha sonra, dört gün daha hücre kültürü kuluçka için hücreleri iade, kültür bir ve üçüncü gün inhibitörü içermeyen orta değiştirerek.

Sklerotom hücrelerinden sindetome farklılaşması için, hücreleri 0,2 mililitre hücre bölünmesi reaktifi ile ayırmadan önce sklerotom hücrelerini PBS ile yıkayın. Oda sıcaklığında üç dakika sonra, her kuyuya 0,8 mililitre kimyasal olarak tanımlanmış bazal ortam ekleyin ve hücreleri bir hücre kazıyıcıyla ayırın. Santrifüj için 15 mililitrelik konik tüp hücreleri aktarın ve sayım için syndetome indüksiyon orta bir bir mililitre pelet resuspend.

Bir mililitre sindetome indüksiyon ortası içeren ekstrasellüler matris solüsyonu kaplı 24 kuyulu bir plakanın her bir kuyuya beş kez 10 tane dördüncü hücreye tohum atve tabağı üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine geri döndürün. Syndetome indüksiyonun üçüncü gününde, orta yı syndetome indüksiyon orta iki ile değiştirin ve tabağı 18 gün boyunca kuvöze geri verin, her üç günde bir ortayı değiştirin. Presomitik mezoderm farklılaşmasından sonra hücrelerin %85'inden fazlası presomitik mezodermin bir belirteci olan delta benzeri protein 1 için pozitiftir, ancak somitik mezodermin bir belirteci olan PAX3 için negatiftir.

Bu popülasyon, dört günlük somitik mezoderm indüksiyonundan sonra PAX3 pozitif somitik mezoderm hücrelerine dönüşür. Ayrıca, kadherin-11 boyama, epitelyalize somitik mezoderm bir belirteç, sadece hücre-hücre kavşaklarında birikir, CHIR99021 eklenmesini takiben. Dermomyotome doğru farklılaşma, miyotom, derrmatome, sklerotome, ve sindetome immünositokimya ve PAX3 floresans ile değerlendirilebilir.

İnsan dermal fibroblastlar benzer, iPSC kaynaklı dermatom hücreleri ELISA tarafından değerlendirilen kollajen ve hyaluronik asit üretmek. İnsan iPSC kaynaklı sindetom ve insan erişkin tenositlerin karşılaştırılabilir reaktivitesini göstermek için mekanik bir esma stimülasyonu titreşilebilir. iPSC geçişinden önce, kültür birleşiminin %70 ila %80 arasında olduğunu ve bölünmüş hücrelerin buna göre bire-ikiye bir e-dört oranında olduğunu doğrulayın.

Bu geçiş başarılı iPSCs farklılaşma için önemlidir. Bu yöntemi kullanarak gelecekteki hücre tabanlı tedaviler için, insan olmayan hayvanlardan elde edilen herhangi bir bileşeni içermeyen yeni bir mikropiçermeyen durum oluşturmak gereklidir.