PDMS kullanarak yüksek verim çekiş kuvveti mikroskobu dönüşüm büyüme faktörü-β epitelyal-mezenkimal geçiş üzerinde doz bağımlı etkileri ortaya çıkarır
1 Haziran 2019
Biz silikon kauçuk (PDMS) ile imal yüksek verim çekiş kuvveti tahlil sunuyoruz. Bu roman tahlil çeşitli biyolojik ve Biyomedikal süreçler ve hastalıklar sırasında hücre kontrazlığı fiziksel değişiklikler okumak için uygundur. Bu yöntemin yardımcı programını, epitelyal-mesenkimal geçiş sırasında bir TGF-β bağımlılık artışına göre ölçerek gösteriyoruz.
Laboratuvarım, hücrelerin mekanik kuvvetlerden nasıl etkilendiğini inceleyen mekanobiyoloji ile ilgileniyor. Mekanobiyolojiyi ölçebildiğimiz bir yol hücre kontraktilliğini ölçmektir. Yapışık hücrelerde, hücre substratına uygulanan çekiş kuvvetlerinde kontraktilite tezahür eder. Bu kuvvetleri genellikle çekiş kuvveti mikroskobu veya TFM olarak adlandırılan bir metodoloji kullanarak ölçeriz. Ve TFM farklı yöntemlergeniş bir yelpazede uygulanan, ama ortak bir yönü oldukça seri ve yavaş laboratuvar tekniği genellikle burada bu gibi tek bir çanak yapılır olmasıdır. Bu, aynı anda bir popülasyonu veya durumu değerlendirmemizi kısıtlar. Hücre kültürü boyunca bir süre önce geliştirilmiş ama çok iyi yemekler oluşturma ve biz düşündüm, biz aynı artan verim ve zaman ve reaktifler aynı verimlilik ile TFM olabilir harika olmaz mıydı? Ve bu bizim çözümümüzdü. Biz de 96 iyi çekiş gücü yemeği yarattık. Ve çok geleneksel 96 iyi doku kültürü çanak benzer görünüyor, ancak bu yemek ile sadece 96 farklı hücre kültürü koşulları incelemek değil, aynı zamanda hücre kontraktility ölçmek. Bu bize farklı hücre koşulları ve kontraktil yanıtları incelemek için izin, tek çanak yaklaşımlar çok daha yüksek bir iş hacmi çözümü sunar. Kanser metastazı sırasında, kanser hücreleri birincil siteden ikincil bölgelere seyahat, vücudumuzda hastalık yayılıyor. Kanser hücrelerinin bu metastatik davranışı kansere bağlı ölümün %90'ını oluşturur. Epitel kanseri hücrelerinin daha göçmen ve invaziv fenotip edinmeleri için önerilen mekanizmalardan biri epitel-mezenkimal geçiş, EMT'dir. EMT sırasında, fiziksel davranışlarını değiştirerek, daha göçmen ve invaziv hale gelir. Fiziksel davranıştaki bu değişiklikleri daha iyi anlamak için, tgf-tgf-etkilenen hücrelerin fiziksel davranışfarklı konsantrasyonları ve kuluçka süresi nasıl araştırıldı, biz TGF tarafından EMT indüksiyon ile fare meme bezi hücrelerinin kontraktilite değişiklikleri ölçmek için yumuşak silikon substrat kullanın. Polidimethylsiloxane yaklaşık 0.6 kilopascal en düşük Young modülü ile çok uyumlu bir kauçuk. Bu malzemenin sertliği de sylgard 184.To bir reometre kullandığımız PDMS mekanik özelliklerini ölçmek dahil crosslink ajan farklı konsantrasyonlarda kullanılarak mümkün olabilir. PDMS'nin A ve B parçasını bire bir ağırlık oranında karıştırdıktan ve kür maddesini belirtilen ağırlık yüzdesi ile ekledikten sonra, hazırlanan toplu eti reometre plakasına yükleyin. Mil alanını tamamen kapsayacak şekilde numunenin yeterince yüklenirolduğundan emin olun. Milin, kenarında boş alan kalmadan numuneye tamamen dokunduğundan emin olmak önemlidir. Herhangi bir ekstra örnek dikkatlice kesilmiş ve plaka silinmiş olmalıdır. Her numunenin viskoelastiyetinin son depolama modülünü ve zaman bağımlılığını %0,5 Newsha salınımlı bir shears zorlanmada zaman ve frekans taramaları yaparak ölçün]Bu grafik, polidimetilsiloksanın %0,5'lik uygulanan salınım lı makası ve 100 sıcaklıkla reolojik davranışını ölçmek için yapılan zaman seq testinin bir örneğidir
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, çeşitli biyolojik süreçler sırasında hücre kontraktilitesindeki fiziksel değişiklikleri incelemek üzere tasarlanmış, silikon kauçuk (PDMS) ile üretilen yüksek kapasiteli bir traksiyon kuvveti analizini sunmaktadır. Yöntemin faydası, epitelden mezenşime geçiş sırasında TGF-β bağımlı kontraktilite artışlarının ölçümü yoluyla gösterilmiştir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Biyomekanik
- Biyomedikal mühendisliği
Arka Plan
- Hücre kontraktilitesi çeşitli biyolojik süreçlerde kritik öneme sahiptir.
- Kontraktilite değişimlerini anlamak, hastalıklara dair içgörüler sağlayabilir.
- Geleneksel yöntemler, yüksek işlem kapasitesi ve hassasiyetten yoksun olabilir.
- PDMS, analizler oluşturmak için çok yönlü bir materyaldir.
Çalışmanın Amacı
- Hücre kontraktilitesini ölçmek için yüksek kapasiteli bir analiz geliştirmek.
- Epitel-mezenkimal geçiş sırasında TGF-β'nin kontraktilite üzerindeki etkisini değerlendirmek.
- Çeşitli koşullarda hücre davranışını incelemek için güvenilir bir yöntem sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- PDMS kullanılarak bir traksiyon kuvveti deneyi düzeneğinin hazırlanması.
- TGF-β'ye yanıt olarak hücre kontraktilitesinin ölçülmesi.
- Birden fazla örneği değerlendirmek için yüksek çıktılı analiz.
- Epitelyal-mezenkimal geçiş dinamiklerinin değerlendirilmesi.
Ana Sonuçlar
- Hücrelerdeki kontraktilite değişimlerinin başarıyla ölçülmesi.
- TGF-β bağımlı kontraktilite artışlarının kanıtlanması.
- PDMS tabanlı analiz yönteminin yararlılığının doğrulanması.
- Hücre geçiş süreçlerinin mekaniğine dair içgörülerin sağlanması.
Sonuçlar
- PDMS traksiyon kuvveti analizi, hücre kontraktilitesini incelemek için etkilidir.
- Epitelial-mezenkimal geçiş sırasında kontraktilitenin arttığı doğrulanmıştır.
- Bu yöntem, çeşitli biyolojik ve biyomedikal çalışmalara uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Önem
Bu yüksek kapasiteli traksiyon kuvveti mikroskobisi platformu, hücresel kontraktilitenin ölçeklenebilir bir formatta kantitatif değerlendirmesine olanak tanıyarak erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma süreçlerini destekler. TGF-β tarafından indüklenen epitelden mezenşime geçişi ölçülebilir biyofiziksel değişikliklerle ilişkilendiren bu yöntem, fibrozis ve metastaz araştırmalarında hedef doğrulaması için öngörücü değer sağlar. PDMS tabanlı sistem, tekrarlanabilirlik ve mevcut çok kuyucuklu iş akışlarıyla uyumluluk sunarak keşif biyolojisi ve assay geliştirme hatlarında kurumsal yeniden kullanımı artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Hedef hipotez testlerini destekleyerek, EMT sırasında hücresel kontraktilitenin bir modülatörü olarak TGF-β'nın incelenmesine olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fibrozis ve kanser yolaklarındaki mekanistik hedefleri önceliklendirmek için doza bağlı ve zaman çözünürlüklü kontraktilite verileri sağlar.
- Öngörücü Değer: EMT ile bağlantılı biyofiziksel fenotipleri nicelleştirerek, preklinik hedef seçimine ve yolak risklerinin azaltılmasına yardımcı olur.
Tarama ve Deney Geliştirme
- Bilimsel Değer: Mekanobiyoloji taramalarında assay standardizasyonu için substrattan bağımsız, kantitatif kontraktilite ölçümleri sağlar.
- Operasyonel Değer: 96 kuyucuklu formatlarla uyumludur; bileşik kütüphanelerinin veya sitokin dozlarının paralel olarak taranmasına olanak tanır.
- Assay Hazırlık Durumu: Ayarlanabilir modüle (0.4–100 kPa) ve sınırsız raf ömrüne sahip stabil, inert PDMS substratlar kullanarak lotlar arası değişkenliği azaltır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: TGF-β dozunu ve süresini kontraktil çıktı ile ilişkilendirerek, biyobelirteçle uyumlu EMT preklinik modellerini destekler.
- Mekanistik Risk Azaltma: in vivo doğrulama öncesinde, hastalığa özgü sistemlerde kontraktilite değişikliklerinin fonksiyonel bir okuma olarak değerlendirilmesine olanak tanır.
- Riski Ayarlanmış İlerleme: Moleküler müdahaleyi biyofiziksel fenotip modülasyonu ile ilişkilendirerek devam/dur kararlarını destekler.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar uzanan keşif sürecine uyum sağlayarak, erken aşama karar alma süreçlerini bilgilendiren biyofiziksel okumalar sunar.
- Keşif Biyolojisi: TGF-β sinyalizasyonunun hücresel mekanik ve kontraktilite üzerindeki etkilerine yönelik hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Doz-yanıt analizi için çok kuyucuklu formatlarda traksiyon kuvvetlerinin yüksek kapasiteli ve tekrarlanabilir şekilde nicelleştirilmesine olanak tanır.
- Analitikler: TGF-β konsantrasyonlarının ve maruziyet sürelerinin karşılaştırılmasına imkan veren kontraktilite metrikleri (kuvvet büyüklüğü, dağılımı) oluşturur.
- Translasyonel Araştırma: in vitro EMT indüksiyonunu ölçülebilir biyomekanik değişikliklerle ilişkilendirerek preklinik model uygunluğunu destekler.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Onkoloji ve fibrozis alanlarındaki hücre tipleri ve mekanobiyoloji hedefleri genelinde uygulanabilir, yeniden kullanılabilir bir traksiyon kuvveti platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Mekanobiyolojik fenotiplerdeki belirsizliği azaltarak hedef doğrulamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
- Operasyonel Değer: Standartlaştırılmış PDMS alt katmanlar ve çok kuyucuklu uyumluluk sayesinde tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği geliştirir.
- Stratejik Değer: Paralel koşul testine olanak tanıyarak ve veri noktası başına reaktif tüketimini azaltarak sermaye verimliliğini artırır.
- Portföy Etkisi: Patojenik geçişler sırasındaki kantitatif kontraktilite değişimlerine dayanarak hedeflerin riskle uyumlu önceliklendirilmesini kolaylaştırır.
Uygulama Hususları
- Hücre kültürü, TFM görüntü analizi ve PDMS alt tabaka hazırlama konularında uzmanlık gerektirir.
- Alt tabaka karakterizasyonu için reometreye ve traksiyon kuvveti miktar belirlemesi için floresan mikroskobiye dayanır.
- Kuyucuklar genelinde ekim yoğunluğunun, alt tabaka fonksiyonelleştirmesinin ve görüntüleme koşullarının standartlaştırılmasını gerektirir.
- Farklı hücre tiplerine adaptasyon, alt tabaka sertliğinin ve adezyon ligandlarının optimizasyonunu gerektirebilir.
- Pratik sınırlamalar arasında alt tabaka kalınlık homojenliği ve belirli dalga boylarında PDMS'nin potansiyel otofloresansı yer alır.
