Name: Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Öğrenin, lazer tarama konfokal mikroskobu kullanarak farklı bitki türlerinde sürgün apikal sürgenleri canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü hücresel yapıları sabitleme ve kesit alma işlemleri olmadan görselleştirir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Purdue Bindley Bioscience Merkezi tesis Imaging tarama confocal mikroskop lazer erişmek için ve teknik destek için kabul ve yazarlar dan Andy Schaber Purdue Bindley tesiste Imaging yardım için teşekkür ederiz. Bu faaliyet AgSEED Crossroads finansman Indiana'nın tarım ve kırsal kalkınma destek parçası olarak Purdue Üniversitesi tarafından finanse edildi.

1. kitle iletişim araçları ve görüntüleme yemekleri hazırlama
<ol><li>MS levha: 0.5 x Murashige & Skoog MS orta, % 1 agar deiyonize su ekleyebilir ve ardından pH potasyum hidroksit çözüm kullanarak 5.8 için ayarlayabilirsiniz (isteğe bağlı: uzun vadeli bitki yetiştirme için % 1 Sükroz ekleyin). Basınçlı kap ve dökme levha.</li>
	<li>Yemekleri görüntüleme: doldurmak plastik Petri yemekler (6 cm genişliğinde, 1.5 cm derinlik) 0.5-0,8 için % 1.5 erimiş özel cm.</li>
</ol>2. bitki büyüme
<ol><li>
Arabidopsis büyüme<ol>
<li>MS plakaları sterilize tohumları ekmek ve levha altında 4 ° C iki gündür yerleştirin. Sonra MS plakaları kısa bir güne taşır (8 h ışık / 16 h karanlık), iki hafta boyunca 22 ° c.</li>
		<li>Toprak fidan nakli ve onları büyümek kısa bir günde (8 h ışık / 16 h karanlık) 22 ° c dört hafta için.</li>
		<li>Bitkiler 22 ° C'de geçiş bitkisel üreme sahneye ve önümüzdeki SAMs görüntüleme için ikna etmek için sürekli ışık aktarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Domates ve soya büyüme<ol>
<li>Onlar çimlenme kadar ıslak filtre kağıdı altında 28 ° C ile kaplı tohum kuluçkaya.</li>
		<li>Toprak fidan nakli ve onları büyümek uzun bir günde (16 h ışık / 8 saat karanlık) için bir hafta veya daha uzun bitkisel SAMs görüntüleme için 25 ° c.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ateş apex diseksiyon
<ol><li>Önümüzdeki ateş apex diseksiyon<ol>
<li>Önümüzdeki ateş apex 1-2 cm ana kök cıvatalı Arabidopsis bitkiler bir tıraş bıçağı ile birlikte kesti. Ana kök Bazal bölümünü tutan ve gibi birçok büyük çiçek organlarını mümkün olduğu ana kök peduncles takı Forseps ile anatomi tarafından kaldırın. Dikkat: kesme parmak bir tıraş bıçağı kullanırken kaçının. Bir uygun "Sharps" konteyner için kullanılan jilet atmayın.</li>
		<li>Ateş apex ekli kök takı forseps veya parmak stereomicroscope alanında tutun, neredeyse bütün SAM-ebilmek var olmak görüş göz mercekleri kadar çiçek kalan kaldırmaya devam etmek. Peduncles ana kök kavşağında açıkça kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bitkisel ateş apex diseksiyon<ol>
<li>Domates veya soya bitkisel SAMs görüntülemek için cotyledons teşrih bırakır ve kökleri bitkilerden.</li>
		<li>Hypocotyls stereomicroscope altında bitkilerin tutun ve daha fazla yaprak takı forseps kullanarak bitkisel SAMs kapsayan primordia incelemek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. boyama
<ol><li>Doğrudan SAMs hücrelerde görselleştirmek için taze hazırlanmış propidium iyodür (PI) çözüm hücre duvarları leke için kullanın. Steril, deiyonize su PI toz geçiyoruz, 1 mL PI boyama çözüm 1 mg/mL konsantrasyonu olun ve alüminyum folyo ile kaplı microcentrifuge tüp PI çözüm saklayın.</li>
	<li>50 µL PI çözümde temiz bir pipet ve boş Petri kabına ve bütün disseke dip tepe 2 dk. durulama için boya içine lekeli ateş apex steril, deiyonize su içinde iki kez ateş. Boyama işlemi sırasında tüm önümüzdeki SAM veya bitkisel SAM Tekdüzen boyama elde etmek için PI çözüm içine bırakın.</li>
</ol>5. resim koleksiyonu
Not: Bu yöntem, tüm SAMs yansıma dik bir confocal mikroskop kullanarak için ve bir 20 x su daldırma objektif. Diğer iletişim kuralları9,12,13,15' te açıklandığı gibi aynı zamanda görüntü ters bir mikroskop kullanarak SAMs uygulanabilirdir. Ayrıca, canlı görüntüleme confocal mikroskoplar, farklı markaların aynı örnek hazırlık adımları ile kullanılarak elde edilebilir. Bu çalışmada, örnek olarak görüntüleme adımları ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
<ol><li>Lekeli ateş apex ortamda dik sopa ve forseps kullanarak bir görüntüleme çanak merkezinde bir delik pierce.</li>
	<li>Görüntüleme çanak tamamen örnek sokmak için steril, deiyonize su ile doldurun. Stereo mikroskop--dan ile ilgilenen, yukarı ve aşağı meristem sıkışmış hava kabarcıkları kaldırmak için pipet. Sonra SAM tamamen üstünde görünür olduğundan emin olmak için agar kök açısını ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme çanak confocal mikroskop örnek sahne alanı üzerine yerleştirin. Su daldırma objektif düşürebilir ve objektif DIP suya ucu izin vermek mikroskop örnek aşaması yükseltmek.</li>
	<li>Açık confocal mikroskop bilgisayar yazılımı ve SAM göz mercekleri içinde aydınlık alan bulun. SAM örnek hemen XY denetleyicisi ayarlama yoluyla objektif lens altında taşıyın ve sonra ihtiyatlı Z denetleyicisi ayarlama yoluyla göz mercekleri SAM'den odaklanmak.</li>
	<li>Confocal mikroskop bilgisayar yazılımı toplama işlevinde işletmek (bakınız Tablo malzemeler), başlangıç örnek bilgisayar ekranında görüntülemek ve deney tarama lazer için tüm parametreleri ayarlamak için modu yaşamak .<ol>
<li>Parametreleri ayarlarken, sinyal ya da değil doymuş tanımlamak için Aralığı göstergesi işlevini kullanın.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak, seçili confocal dosyasından tüm parametre ayarlarını yeniden yüklemek için yeniden işlevi uygular. Not: parametrelerini görüntüleme önerdi: lazer çizgi (uyarma): 515 nm veya 561 nm; Emisyon 570-650 nm; iğne deliği: 1 havadar adet (AU); Kazanç: 600-750, tarama modu: çerçeve; Çerçeve boyutu: 512 X 512 ya da 1024 X 1024; tarama hızı: 7 Max; Yönde tarama: iki yön; Ortalama sayı: 2-4; Yöntemi ortalama: demek; Bit derinliği: 16 Bit; Tarama aralığı: 0.5-1 µM. Ayrıca, farklı bitki örnekleri ve belirli resim gereksinimleriniz niteliğine göre bu parametreler optimize edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. görüntü işleme
<ol><li>Optik dik ve enine bölüm sayısı görüntülenmesi için aynı ticari yazılım görüntü alımı için kullanın. Özgün confocal dosyasını açıp, ortho menüsünü tıklatın, ortho seçin. Sonra her iki x konumunu seçin, y konumu ve z resmin getirin ve görüntüleri TIFF dosyaları olarak kaydetmek.<ol>
<li>İsteğe bağlı olarak confocal görüntüleri yığından seçilen iki nokta arasındaki fiziki mesafeyi tanımlamak için 3D mesafe işlevini seçin.</li>
		<li>Alternatif olarak, Fiji/resim J, dik ve enine bölüm sayısı görselleştirmek için açık kaynak görüntü işleme paketi kullanın.</li>
		<li>Fiji ile orijinal confocal dosyasını açın, görüntü menüsünü tıklatın, yığınlar seçip ardından ortogonal sayısı.</li>
		<li>XY, YZve XZ uçakları orta pozisyonda seçin ve TIFF formatında görüntü olarak kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D şeffaf projeksiyon görüntülenmesi için aynı yazılımı kullanın.<ol>
<li>Özgün confocal dosyasını açıp, 3D menüsünütıklatın ve bir 3D projeksiyon görünümü oluşturmak için saydam ' ı seçin.</li>
		<li>İsteğe bağlı olarak 3D menüsünütıklatın, Görünümseçin ve projeksiyon Eşik, rampa ve en büyük 3D şeffaflık için de dahil olmak üzere üç parametreleri ayarlamak için saydamlık seçeneğini belirleyin görüntü.</li>
		<li>3D menüsünütıklatın, görünüm, seçin ve 3D görüntü parlaklığını ayarlamak için ışık ' ı seçin.</li>
		<li>Öngörülen görüntüleri dışa aktarmak ve TIFF dosyaları olarak kaydedebilirsiniz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D maksimum yoğunluk projeksiyon görselleştiren, açık belgili tanımlık confocal eğe ile aynı yazılım ve 3D menü' yü tıklatın.<ol>
<li>3D menü ve maksimumseçin.</li>
		<li>Alternatif olarak, Fiji/resim J 3D maksimum yoğunluk projeksiyon görselleştirmek için kullanın.</li>
		<li>Fiji ile orijinal confocal dosyasını açın, görüntü menüsünü tıklatın ve yığınlarseçin.</li>
		<li>3D proje örneği seçin ve TIFF formatında görüntü olarak kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D görüntü görünümünü kodlama derinlik görüntülenmesi için aynı yazılımı kullanın.<ol>
<li>3D menüsünü tıklatın ve bir görünümseçin.</li>
		<li>Özel seçin ve Derinlik kodlamaseçin.</li>
		<li>Alternatif olarak, Fiji/resim J görünümü kodlama derinlik görselleştirmek için kullanın.</li>
		<li>Açık belgili tanımlık confocal eğe, Görüntü menüsünde' ı tıklatın, Hyperstackseçin.</li>
		<li>Temporal-renk kodu seçin ve TIFF formatında görüntü olarak kaydedin. Not: Derinlik kodlama z-yığın da eklenti Fiji için Z kod yığını aracılığıyla elde edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3D görselleştirme için döndürme görünüm olarakgösterilen (film 1 ve Film 2), kullanmak aynı yazılım ( Tablo reçetesigörmek).<ol>
<li>Açık belgili tanımlık confocal eğe, 3D menü' yü tıklatın ve seriyiseçin.</li>
		<li>Serisi Renderseçin ve Turn x, y çevirmek, başlangıç ve bitişve pozisyon listeside dahil olmak üzere dört seçenekten birini seçin.</li>
		<li>Render serisi AVI dosyaları olarak kaydedin.</li>
		<li>Alternatif olarak, Fiji/resim J 3D döndürme görünümü görselleştirmek için kullanın.</li>
		<li>Fiji ile orijinal confocal dosyasını açın, görüntü menüsünütıklatın ve yığınlarseçin.</li>
		<li>3D proje örneği seçin ve AVI formatında videolar kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+control+of+cell+division+patterns+in+developing+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Genetic control of cell division patterns in developing plants.</a> Cell. 88 (3), 299-308 (1997).</li>
<li>Xu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cascade+of+arabinosyltransferases+controls+shoot+meristem+size+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A cascade of arabinosyltransferases controls shoot meristem size in tomato.</a> Nature Genetics. 47 (7), 784-792 (2015).</li>
<li>Bommert, P., Nagasawa, N. S., Jackson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+variation+in+maize+kernel+row+number+is+controlled+by+the+FASCIATED+EAR2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Quantitative variation in maize kernel row number is controlled by the FASCIATED EAR2 locus.</a> Nature Genetics. 45 (3), 334-337 (2013).</li>
<li>Je, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+from+maize+organ+primordia+via+FASCIATED+EAR3+regulates+stem+cell+proliferation+and+yield+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Signaling from maize organ primordia via FASCIATED EAR3 regulates stem cell proliferation and yield traits.</a> Nature Genetics. 48 (7), 785-791 (2016).</li>
<li>Ping, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dt2+is+a+gain-of-function+MADS-domain+factor+gene+that+specifies+semideterminacy+in+soybean%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Dt2 is a gain-of-function MADS-domain factor gene that specifies semideterminacy in soybean.</a> Plant Cell. 26 (7), 2831-2842 (2014).</li>
<li>Vaughan, J. G., Jones, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+angiosperm+inflorescence+apex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the angiosperm inflorescence apex.</a> Nature. 171, 751(1953).</li>
<li>Sijacic, P., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+from+live-imaging+in+shoot+meristem+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Integrative+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel insights from live-imaging in shoot meristem development.</a> Journal of Integrative Plant Biology. 52 (4), 393-399 (2010).</li>
<li>Tax, F. E., Durbak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meristems+in+the+movies%3A+live+imaging+as+a+tool+for+decoding+intercellular+signaling+in+shoot+apical+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Meristems in the movies: live imaging as a tool for decoding intercellular signaling in shoot apical meristems.</a> Plant Cell. 18 (6), 1331(2006).</li>
<li>Grandjean, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+cell+division%2C+cell+growth%2C+and+differentiation+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of cell division, cell growth, and differentiation at the shoot apical meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74-87 (2004).</li>
<li>Heisler, M. G., Ohno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live-imaging+of+the+Arabidopsis+inflorescence+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live-imaging of the Arabidopsis inflorescence meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1110, 431-440 (2014).</li>
<li>Tobin, C. J., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+to+study+cell+division+orientation+in+the+Arabidopsis+shoot+meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis to study cell division orientation in the Arabidopsis shoot meristem.</a> Methods in Molecular Biology. 1370, 147-167 (2016).</li>
<li>Prunet, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+Imaging+of+developing+Arabidopsis+flowers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Live confocal Imaging of developing Arabidopsis flowers.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55156(2017).</li>
<li>Prunet, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+confocal+imaging+of+Arabidopsis+flower+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Live confocal imaging of Arabidopsis flower buds.</a> Developmental Biology. 419, 114-120 (2016).</li>
<li>Reddy, G. V., Heisler, M. G., Ehrhardt, D. W., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+lineage+analysis+reveals+oriented+cell+divisions+associated+with+morphogenesis+at+the+shoot+apex+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Real-time lineage analysis reveals oriented cell divisions associated with morphogenesis at the shoot apex of Arabidopsis thaliana.</a> Development. 131, 4225-4237 (2004).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Perdue, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Shoot+Meristems+on+an+Inverted+Confocal+Microscope+Using+an+Objective+Lens+Inverter+Attachment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Shoot Meristems on an Inverted Confocal Microscope Using an Objective Lens Inverter Attachment.</a> Frontiers in Plant Science. 8, 773(2017).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAIRY+MERISTEM+with+WUSCHEL+confines+CLAVATA3+expression+to+the+outer+apical+meristem+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">HAIRY MERISTEM with WUSCHEL confines CLAVATA3 expression to the outer apical meristem layers.</a> Science. 361 (6401), 502-506 (2018).</li>
<li>Zhou, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+plant+stem+cell+function+by+conserved+interacting+transcriptional+regulators%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of plant stem cell function by conserved interacting transcriptional regulators.</a> Nature. 517 (7534), 377-380 (2015).</li>
<li>Nimchuk, Z. L., Zhou, Y., Tarr, P. T., Peterson, B. A., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+stem+cell+maintenance+by+transcriptional+cross-regulation+of+related+receptor+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant stem cell maintenance by transcriptional cross-regulation of related receptor kinases.</a> Development. 142 (6), 1043(2015).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEAFY+Controls+Auxin+Response+Pathways+in+Floral+Primordium+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">LEAFY Controls Auxin Response Pathways in Floral Primordium Formation.</a> Science Signaling. 6 (270), ra23(2013).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, meristem düzenleme modeli bitkiler bitkisel ve üreme aşamalarında eğitim için yeni bir cadde açılış sürgün apikal sürgen çalışma odasına küçük değişiklik, farklı bitkilerle uygulanabilir basit bir görüntüleme yöntemi açıklamak ve bitkileri. SEM ve histolojik boyama yöntemleri aksine, bu protokolü yüzey görünümü ve emek yoğun örnek fiksasyon ve/veya doku adımları kesit için gerek kalmadan SAMs iç Hücresel yapıları ortaya çıkarmak yardımcı olabilir. Bu iletişim kuralı da kurulan görüntüleme yöntemi için potansiyel ...

Bitki meristem bir havuzu farklılaşmamış kök hücre içeren ve sürekli olarak bitki organ büyüme ve gelişme1ayakta tutan. Postembryonic geliştirme sırasında hemen hemen tüm yerüstü dokular bir bitkinin sürgün apikal meristem (SAM) türetilir. Bitkileri, etkinlik ve SAM ve onun türetilmiş çiçek sürgen boyutunu sıkıca vur mimarisi, meyve üretimi ve tohum verimi gibi birçok tarımsal özellikleri ile ilişkilidir. Örneğin, domates, ateş ve önümüzdeki dallanma artış ve böylece ilave çiçek ve meyve organları2üreten sonuçlarındaki genişlemiş bir SAM neden olur. Mısır, SAM boyutunda bir artış daha yüksek tohum sayısı ve toplam verim3,4yol açar. Soya, meristem belirsizlik da ateş mimarisi ile yakından ilişkilidir ve5verim.
Morfolojisi ve anatomisi SAMs ikisi de büyük ölçüde sağlayarak meristem araştırma gelişti histolojik kesit/boyama ve elektron mikroskobu (SEM)6, tarama dahil olmak üzere birkaç farklı yöntem tarafından karakterize edilebilir kesit görünümü veya üç boyutlu (3D) yüzey görünümü SAMs. Ancak, her iki yöntem de zaman alıcı, veri toplama, numune hazırlama birkaç deneysel adımlar içeren ve bu yöntemleri esas olarak sabit örnekleri üzerinde bağlıdır. Lazer confocal mikroskobu tekniği tarama son gelişmeler bu sınırlamalarının üstesinden gelir ve bizi hücresel yapısı ve bitki doku ve organların7,8gelişim sürecinin araştırmak için güçlü bir araç sağlar. Aracılığıyla fiziksel doku yerine optik parça, confocal mikroskobu z-yığın görüntüleri bir dizi ve örnek görüntü analiz yazılımı aracılığıyla sonraki 3D inşası topluluğu sağlar.
Burada, biz içinde her ikisi de soruşturma için verimli bir açıklayınız ve farklı yaşam SAMs yüzey yapıları kullanarak potansiyel olarak araştırmacılar tüm deneysel gerçekleştirmek için sağlar confocal mikroskobu tarama lazer tür bitki süreç içinde 20 dakika gibi kısa. Yayınlanan diğer yöntemleri Arabidopsis önümüzdeki SAMs9,10,11,12,13,14canlı confocal görüntüleme için farklı, 15 ve Arabidopsis çiçekler12,13, burada bu protokolü sadece önümüzdeki sürgen modeli tür aynı zamanda bitkisel ateş çalışmak için son derece verimli olduğunu ispat apikal sürgen domates ve soya gibi farklı bitkileri. Bu yöntem üzerinde transgenik floresan işaretleri dayanmaz ve potansiyel olarak çok farklı türler ve çeşitlerin ateş sürgen çalışmaya uygulanabilir. Buna ek olarak, biz de basit görüntü işleme adımları ve 3D görünümünde farklı SAMs çözümlemeyi tanıtmak. Birlikte ele alındığında, bu basit yöntem araştırmacılar canlılar ve bitkiler sürgen gelişimsel süreci ve yapısını daha iyi anlaşılmasını kolaylaştıracaktır.

<table><tbody><tr><td>Ağar Fito</td><td>Nokta Bilimsel A.Ş.</td><td>DSA20300-1000</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Nokta Bilimsel A.Ş.</td><td>AGLE-500</td><td></td></tr><tr><td>Forseps</td><td>ROBOZ</td><td>RS-4955</td><td>Dumont #5SF Süper İnce Forseps Inox Uç Boyutu .025 X .005mm, sürgün apislerini incelemek için.</td></tr><tr><td>LSM 880 Dik Konfokal Mikroskop&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog MS orta</td><td>Nokta Bilimsel A.Ş.</td><td>DSM10200-50</td><td></td></tr><tr><td>Plan APO 20x/1.1 su daldırma lensi</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik petri kapları 100 mm X 15 mm</td><td>CELLTREAT Bilimsel Ürünler</td><td>229694</td><td>MS plakaları yapmak için kullanın</td></tr><tr><td>Plastik petri kapları60 mm X 15</td><td>CELLTREAT Bilimsel Ürünler</td><td>229665</td><td>Görüntüleme kabı olarak kullanın</td></tr><tr><td>Yayılma Karışımı</td><td>Sungro Bahçe Bitkileri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium iyodür</td><td>Acros Organics</td><td>440300250</td><td>Hücre duvarlarını lekelemek için su içinde 1 mg / mL çözelti</td></tr><tr><td>Jiletli bıçak</td><td>PERSONNA</td><td>62-0179</td><td>Bitkilerden sürgün tepesini kesmek için</td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td>SMZ1000</td><td></td></tr><tr><td>Doku</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>Zen siyahı</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Görüntü elde etme yazılımı</td></tr></tbody></table>

sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Confocal Live Imaging of Shoot Apical Meristems from Different Plant Species

Sürgün apikal meristem (SAM) işlevleri korunmuş kök hücre rezervuar ve olarak postembryonic geliştirme sırasında hemen hemen tüm yerüstü dokular oluşturur. Etkinlik ve SAMs Morfoloji çekim mimarisi, boyutu ve üreme organları ve en önemlisi, tahıl verim sayısı gibi önemli tarımsal özellikleri belirler. Burada, biz yüzey morfolojisi ve iç hücresel yapısı farklı türlerden yaşam SAMs confocal mikroskobu tarama lazer ile analiz etmek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Yüksek çözünürlüklü üç boyutlu (3D) görüntüleri edinimi için numune hazırlama üzerinden tüm prosedürü içinde gerçekleştirilebilir 20 dakika gibi kısa. Bu iletişim kuralı sadece önümüzdeki eğitim kuruluşu ve gelişimi için basit ama güçlü bir araç sağlayarak SAMs modeli tür aynı zamanda farklı bitkileri, bitkisel sürgen eğitimi için yüksek verimli olduğunu ispat sürgen farklı bitki türleri arasında.

Bizim protokolünün etkinliği değerlendirmek ve sürgen morfolojisi farklı türlerden keşfetmek için biz önümüzdeki meristem Arabidopsis --dan ve--dan bitkisel sürgen confocal canlı görüntüleme deneyler gerçekleştirdiyseniz hem domates ve soya. Bu çalışma, Arabidopsis ecotype Landsberg erecta, domates çeşidinde mikro-Tom ve soya çeşidinde Williams 82 örnek olarak kullanılmıştır.
Ortogonal bölümünden A...

Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

The shoot apical meristem (SAM) functions as a conserved stem cell reservoir and it generates almost all aboveground tissues during the postembryonic ...

Apikal meristems kontrol bitki büyüme ve üreme vur. Bu yöntem, sadece model türlerde değil, aynı zamanda farklı bitkilerde de ateş apikal meristems morfolojisi ve iç yapıları araştırmak yardımcı olur. Bu teknik çok verimli bir işlemdir.Shoot apikal meristem doğrudan herhangi bir emek yoğun örnek fiksasyon ve doku kesit adımları olmadan yüksek hücresel çözünürlükte görselleştirilmiş olabilir. Başlamak için, metin protokolünde ayrıntılı olarak Arabidopsis, domates ve soya bitkileri büyümek. Cıvatalı Arabidopsis bitkilerden çiçek çekim apeks kesin.Ana sapbaz kısmını tutun ve ana kök mümkün olduğunca çok eski çiçek organları kaldırmak için forceps kullanın. Çekim apikal meristem gözlükgörülebilir kadar stereo mikroskop alanında çiçeklerin geri kalanını kaldırmaya devam edin. Bitkisel ateş apikal meristems ya domates veya soya fasulyesi görüntülemek için, cotyledons dışarı incelemek, yaprakları, ve bitkiden kökleri.Stereo mikroskop altında bitkinin hipokotil tutun ve daha fazla vegetatif ateş apikal meristems kapsayan yaprak ve yaprak primordia dışarı incelemek için forseps kullanın. Pipet 50 mikrolitre propidium iyodür çözeltisi temiz ve boş petri kabında. İki dakika boyunca boya içine tüm diseksiyon ateş apeks daldırma.Boyama işlemi sırasında, tüm çiçeklenme ateş apikal meristem veya vegetatif ateş apikal meristem propidium iyodür çözeltisi içine tek tip boyama elde etmek için batırın. Lekeli ateş apeksiki steril, deiyonize su durulayın. Şimdi, forseps kullanarak hazırlanmış bir görüntüleme çanak merkezinde bir delik delmek ve orta dik lekeli ateş apeks sopa.Numuneyi tamamen batırmak için görüntüleme kabını steril, deiyonize suyla doldurun. Örneği stereo mikroskoptan görüntüleyin. Pipet yukarı ve aşağı meristem etrafında sıkışıp hava kabarcıkları kaldırmak için.Daha sonra, ateş apikal meristem doğrudan yukarıdan tamamen görünür olduğundan emin olmak için agar kök açısını ayarlayın. Şimdi, görüntüleme kabını konfokal mikroskobunun örnek aşamasına yerleştirin. Su daldırma merceğini düşürün ve lensin ucunun suya düşmesini sağlamak için mikroskop örnek aşamasını yükseltin.Konfokal mikroskop yazılımını açın ve parlak alanda çekim apikal meristem bulmak ve odaklanmak için gözlük kullanın. Confocal mikroskop yazılımında Edinme işlevini çalıştırın. Örneği bilgisayar ekranından görüntülemek için canlı modu başlatın ve lazer tarama deneyi için tüm parametreleri ayarlayın.Parametreleri ayarlarken, sinyalin doymuş olup olmadığını tanımlamak için Aralık Göstergesi işlevini kullanın. Görüntüleme edinimi için kullanılan aynı yazılım, üç boyutlu saydam projeksiyonu görselleştirmek için kullanılabilir. Özgün confocal dosyasını açın, 3B menüsünü tıklatın ve 3B projeksiyon görünümü oluşturmak için Saydam'ı seçin.İsteğe bağlı olarak, 3B görüntünün saydamlığı için Eşik, Rampa ve Maksimum dahil olmak üzere projeksiyonun üç parametresini ayarlamak için Saydamlık'ı seçin. Şimdi, 3B görüntünün parlaklığını ayarlamak için Işık'ı seçin. Yansıtılan görüntüleri dışa aktarın ve bunları TIFF dosyaları olarak kaydedin.3B görüntülerin derinlik kodlama görünümünü görselleştirmek için aynı yazılımı kullanın. Yine, 3B menüsünü tıklatın ve Görünüm'u seçin. Özel'i seçin ve Derinlik Kodlama'yı seçin.Yansıtılan görüntüleri dışa aktarın ve bunları TIFF dosyaları olarak kaydedin. Arabidopsis'in ortasına kadar ortogonal bölümden alınan bu görüntü, yatay duvarların birden fazla hücre katmanındaki hemen hemen tüm hücrelerde propidium iyodür ile boyandığını göstermektedir. Çiçek çekimi apikal meristem korpus aracılığıyla bir enine bölüm görünümü XY düzlemindeki hücrelerin de açıkça görüntülenmiş olduğunu göstermektedir.3D projeksiyon görünümü çiçeklenme meristem kubbe gibi bir yapı oluşturur ve gelişmekte olan çiçek primordia ile çevrili olduğunu ortaya koymaktadır. Domates sürgün apikal meristem ortasından ortogonal bölümünden bu görüntü de yatay duvarlar propidium iyodür ile birden fazla hücre katmanlarında lekeli olduğunu gösterir, derin iç bölgeden propidium iyodür sinyali biraz daha düşük olmasına rağmen. Vegetatif ateş apikal meristem derin katmanları ile bir enine bölümden bir görüntü XY düzlemleri hücreleri ve vegetatif meristem ve yaprak primordia arasında oluşan sınır ortaya koymaktadır.3D projeksiyon görünümü daha şekil ve domates vegetatif meristem organizasyonu kapsamlı bir görünüm sağlayabilir. Burada gösterilen soya fasulyesi ateş apikal meristem ortasından bir ortogonal görünümü ve aynı ateş apikal meristem bir 3D projeksiyon. Kubbe benzeri vegetatif meristem ve türetilmiş yeni yaprak primordia da gözlemlenebilir.Propidium iyodür kolayca büyük ölçüde görüntülerin kalitesini etkileyecek hasarlı veya ölü hücreleri leke olabilir, bu yüzden ateş apikal meristem örnekleri hazırlarken herhangi bir fiziksel hasar önlemek için önemlidir.

confocal-live-imaging-shoot-apical-meristems-from-different-plant

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Biz stoma farklılaşma belgeleyen, gelişme birkaç gün içinde epidermis konfokal görüntüleme için bitki kotiledon hareketsiz odası slaytlar ve medya kullanarak bir protokol açıklar. Fluorofor etiketli proteinlerin hücre bölünmesi ve hücre tipi farklılaşması esnasında olası rollerini anlamayı arttırıyor, ifade ve hücre içi lokalizasyonu dinamik izlenebilir.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Hematopoetik kök hücrelerin işaretleme Kombinatoryel 5 floresan proteinleri rejenerasyon sırasında kemik iliği hematopoetik mimarisi içine anlayışlar, confocal ve iki foton mikroskopi ile in vivo klonal izleme sağlar. Bu yöntem nakli aşağıdaki kapsamlı bir süre için sağlam dokularda spektral kodlu HSPCs kökenli hücrelerin non-invaziv kader haritalama sağlar.

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

Canlı konfokal görüntüleme gelişimini incelemek için güçlü bir araç biyologlara sağlar. Burada, Arabidopsis çiçek gelişmekte canlı konfokal görüntüleme için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Arabidopsis Çiçek Gelişmekte Konfokal Görüntüleme Canlı

Burada, yüksek numerik diyafram açıklığı hedefleri ve daldırma ortamı olarak perflorodekalin kullanılarak 3 güne kadar kök ve hipokotil gelişiminin yüksek çözünürlüklü konfokal zaman atlamalı görüntülemesi için basit bir teknik sunulmuştur.

Kök ve Hipokotil Gelişimin Uzun Süreli Konfokal Görüntülemesi için Basit Bir Oda

Floresan canlı görüntüleme Arabidopsis thaliana yaprakların uzun bir zaman aralığı içinde gerçekleştirmek için basit ve çok yönlü bir yöntemi bildirin. Biz bir transgenik Arabidopsis bitki bitki bağışıklık yanıtı kronolojik zamanmekansal anlayış kazanıyor için bir örnek olarak bir bağışıklık ile ilgili düzenleyici denetimi altındaki bir floresan muhabir gen ifade kullanın.

Arabidopsis montaj için çok yönlü bir yöntem Intravital zaman hata görüntüleme için yaprakları

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Burada, ateş apikal meristem'deki kortikal mikrotübül sitoiskeletinin canlı hücre görüntülemesi ve fiziksel kuvvetlerdeki değişikliklere tepkisini izleme protokolünü anlatıyoruz.

Mikrotübül Sitoiskeletinin Canlı Hücre Görüntülemesi ve Arabidopsis Shoot Apikal Meristem'in Mikromekanik Manipülasyonu

Bu makale, canlı yosun dokusunun 3 boyutlu hücre duvarı dinamiklerini görüntülemek için ayrıntılı bir protokol sunarak, ggb mutantlarında hücre duvarlarının ayrılmasının görselleştirilmesine ve uzun bir süre boyunca gelişim sırasında vahşi tipte hücre duvarı desenlerinin kalınlaştırılmasına izin vermektedir.

Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Mısır yaprağı primordiaları derinlemesine kaplanır ve yuvarlanır, bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış mısır yaprağı primordialarının bütün montajlarını hazırlamak için yöntemler sunuyoruz.

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

Mayoz fazı sırasında kromozom hareketi, spor oluşumu için temel olan, yeterince anlaşılmamış bir olgudur. Bu protokol, Arabidopsis thaliana erkek mayositlerinde mayotik faz sırasında sentromer hareketlerini elde etmek, analiz etmek ve ölçmek için bir yöntemi açıklar.

Arabidopsis thaliana'da Erkek Mayoz Fazı Sırasında Sentromer Hareketlerinin Canlı Görüntüleme Karakterizasyonu

Bu süreç, Arabidopsis thaliana'da floresan etiketlenmiş çekirdek ve kromatin işaretleyici çizgisi ile birlikte konfokal mikroskopi kullanarak Arabidopsis köklerinde çekirdek ve kromatin dinamiklerini aynı anda kaydeder ve gelişimsel ile çevresel ipuçlarına yanıt olarak bu dinamiklerdeki değişiklikleri araştırır.

Arabidopsis thaliana Kökünde Gelişim Sırasında Nükleer Şekil ve Kromatin Dinamiklerinin Nicel Canlı Hücre Görüntülemesi ve Çevresel Stres

Öğrenin, lazer tarama konfokal mikroskobu kullanarak farklı bitki türlerinde sürgün apikal sürgenleri canlı görüntüleme yöntemini. Bu teknik, yüksek çözünürlüklü hücresel yapıları sabitleme ve kesit alma işlemleri olmadan görselleştirir.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Daha fazla video keşfet