Fizyoloji Immunogenic dendritik hücreler oluşturma için yeni protokol

Fizyolojik dendritik antijen sunan hücreler, PhDC olarak adlandırdığı, antijene özgü T hücre bağışıklığı ve toleransı başlatan bağışıklık master anahtarlarıdır. Bu makale, PhDC üretimi için etkili bir yöntem tanımlanır. Dendritik hücrelerin klinik kullanımı bunları üretmek için kullanılan fizyolojik olmayan sitokin yöntemleri tarafından engellenir.

Yöntemimiz, insanlarda ve farelerde monosit-DC dönüşümünün etkili trombosit sinyali ile bu sorunun üstesinden geliyor. Bu PhDC in vivo mevcut olmayan sitokin koşullarına bağlı değildir, bu yüzden kurulan kanserler ile hem insanlar da hem de farelerde güçlü klinik anti-tümör T hücre yanıtları üretebilir. Monosit-PhDC olgunlaşmatürtür bağımsız trombosit başlatılması geniş deneysel uygulanabilirlik vardır.

PhDC dendritik hücre fizyolojisi diseksiyon izin, immünojenik kanserlere terapötik anti-kanser bağışıklık indüksiyon kolaylaştırmak, ve kişiselleştirilmiş antimikrobiyal aşı için söz sunuyoruz. Bu deneysel sistem yenidir ve plastik haznenin kapılması, 8-MOP/UVA ile tümör hücresi tedavisi, akış koşulları ve monositlerin salınımı gibi birçok yönü görsel olarak en iyi şekilde temsil edilmektedir. Prosedürü gösteren Eve Robinson, laboratuvarımdan bir teknisyen olacak.

Periferik kan mononükleer hücreleri toplamak için, ilk lenfosit izolasyon orta beş ila 10 fareler kanamış başına dört mililitre ile 15 mililitrelik bir tüp kurmak. Daha sonra yavaşça tümör taşıyan farelerden toplanan kan orta nın üzerine toplanır. PBMC'leri kırmızı kan hücrelerinden ayırmak için hücreleri 20 dakika boyunca 1,000 ila 1, 500-g'de döndürün.

Santrifüj sonunda, üst plazma tabakası toplamak, buffy ceket üzerinde kalan 0.5 mililitre bırakarak, ve daha sonra kullanmak için dört derece santigrat de saklayın. Daha sonra, 15 mililitre PBS ile dolu temiz bir 15 mililitrelik tüp içine buffy kat katmanı toplamak ve PBMC toplamak için 10 dakika boyunca standart bir doku kültürü santrifüj 250-kez-G spin. Santrifüj sonunda, dikkatle supernatant kapalı pipet ve pelet yeniden askıya almak için tüp flick.

Sonra PBMC kalan kırmızı kan hücrelerini kaldırmak için tüp ack kırmızı kan hücresi lisis tampon iki mililitre ekleyin. PBMC'yi 10 dakika boyunca buzüzerinde kuluçkaya yatırın. Tüpü PBS ile 15 mililitreye doldurun ve PBMC'yi toplamak için standart doku kültürü santrifüjünde 250 kat-G'de aşağı doğru döndürün.

Dikkatle supernatant kapalı pipet ve pelet gevşetmek için tüp flick. 300 mikrolitre FBS'deki peleti yeniden askıya alın. Tedavi grubu başına YUMM1.7 tümör hücrelerini hazırlamak için, ilk olarak 300 mikrolitrede 2,5 milyon hücrede FBS'deki tümör hücreli peleti yeniden askıya alın.

Doku kültürü başlık ışıkları kapalı ile, YUMM1.7 tümör hücre süspansiyon mililitre başına 100 nanogram son konsantrasyon için 8-methoxypsoralen ekleyin. Sonra, hücreleri karıştırın, folyo içinde hücre konteyner sarın ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. 12 kuyulu doku kültür plakasını önceden kaplamak için, beş fareden oluşan her tedavi grubu için bir kuyuya bir mililitre FBS ekleyin ve plakayı 20 dakika boyunca dört derece santigrat derecede soğutun.

20 dakika sonra, bir doku kültürü başlık altında, kuyulardan FBS kaldırmak ve iyi başına methoxypsoralen maruz tümör hücrelerinin 300 mikrolitre ekleyin. Daha sonra hücre içeren plakayı önceden ısıtılmış ultraviyoleye maruz bırak. Her kuyudan 8-methoxypsoralen/UVA ile tedavi edilen tümör hücrelerini toplamak için, tam hücre iyileşmesini sağlamak için plakayı ve pipeti dikkatlice döndürün.

Beş fareden oluşan her bir tedavi grubu için transimmunizasyon plaka geçişi gerçekleştirmek için, uygun PBMC 300 mikrolitre ve 1.5 mililitrelik konik tüp te 8-methoxypsoralen /UVA tedavi tümör hücrelerinin 300 mikrolitre birleştirmek ve hücreleri karıştırın. Daha sonra, TI plakasının giriş ve çıkış boru kelepçelerini açın. TI boruyu FBS ile doldurmak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın, boru borunun içinde FBS'yi korumak için dolduruldukça kelepçeleri kapatın.

Şırıngayı kes. P1000 pipet ucunu TI plakası alımına güvenli bir şekilde yerleştirin. Plakayı 45 derecelik bir açıyla tutun ve plakayı pbmc ve tümör hücresi karışımıyla yavaşça doldurun, kabarcıklardan kaçının.

Pipet pistonunu bırakmadan önce pipet ucunu alımdan çıkarın. Kalan hücreleri 1,5 mililitrelik konik tüpe geri döndürün. FBS dolu tüpü, hücre dolu TI plakasını ve doku kültüründeki kalan hücreleri içeren 1,5 mililitrelik konik tüpü bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın.

Kuluçkadan sonra kelepçeleri bırakın ve TI tüplerini yerçekimine göre boşaltın. Daha sonra, hücreleri TI plakasından çıkarmak için plaka bağlantı noktasına depresif pistonlu bir P1000 pipet ucu takın. Plakayı 45 derecelik açıyla tutun ve P1000 pipet ucunu doldurun.

Hücreleri orijinal 1,5 mililitrelik konik tüplerine geri yerleştirin. TI plakasını çalıştırmak için çıkış tüpünü plakaya bağlayın ve TI plakasını plaka lı sisteme sabitlayın. Sonra, bir mililitreşli şırınga kullanarak, 1.5 mililitrekonik tüp ten PBMC ve tümör hücre karışımı bu 600 mikrolitre kadar çizin.

Şırıngayı kelepçe açık olarak giriş tüpüne takın ve sıvı tüpün ucuna ulaşana kadar yavaşça doldurun. Giriş tüpünün serbest ucunu TI plakasına takın ve kalan hacmi nazikçe yüklemeye devam edin. Bittiğinde giriş kıskacını kapatın.

Bir mililitrelik şırıngayı ayırın ve giriş boruyu şırınga pompasına bağlayın. Hücre toplama için 1,5 mililitrelik konik tüpün çıkış borusu sabitleyin. Şırınga pompası akış hızını dakikada 0,09 mililitreye ayarlayın.

TI plakasını, ti plakalı bir koşu platformu kullanarak şırınga pompası tarafına doğru yaklaşık 30 derece yatırın. Giriş borusu üzerindeki kelepçeyi dikkatlice bırakın. TI plakasının nasıl dolduğunu dikkatlice gözlemleyerek şırınga pompasını çalıştırın.

TI plakası tamamen doldurulduktan sonra, boşalırken ters yönde yaklaşık 30 derece yatırın. Sıvıdaki tüm hücreler 1,5 mililitrelik konik toplama tüpünde yken, pompayı durdurun. TI plakasını yıkamak için, giriş borularını şırınga pompasından çıkarın ve 600 mikrolitre FBS ile dolu bir mililitrelik şırıngaya bağlayın.

FBS tamamen yüklenene kadar doldurun. Sonra şırınganın bağlantısını kesip tüpü şırınga pompasına bağlayın. Şırınga pompası akış hızını dakikada 0,49 mililitreye ayarlayın.

Giriş kıskacını bırakın ve aynı 1,5 mililitrelik konik tüpte yıkamayı toplayarak TI plakasını çalıştırın. Plaka boşaltılırken herhangi bir yapışık hücrenin ayrılmasına ve elutingine yardımcı olmak için ti plakasını hafifçe hafifçe kaydırın veya dokunun. 1,5 mililitrelik konik tüpü TI plaka kurulumundan çıkarın.

Toplama tüpünü tezgah üstü mikrofuge'da 250-g'de sekiz dakika boyunca döndürün ve süpernatant'ı atın. Antijen ile PBMC bir gecede co-inkübatasyon gerçekleştirmek için, ilk net RPMI iki mililitre PBMC ve tümör hücreli pelet resuspend 15% otolog fare serumu ile birlikte. Sonra 35 milimetrelik olmayan doku kültürü steril çanak tedavi hücreleri, ve standart doku kültürü koşulları altında bir gecede kuluçka.

Ertesi gün, dikkatle bir doku kültürü kazıyıcı ile çanak altından herhangi bir yapışık hücreleri ayırmak. Hatta hücre toplama sağlamak için kazıma sırasında çanak döndürün. 15 mililitrelik bir tüp içinde hücreleri toplamak.

Tabağa iki mililitre PBS ekleyin ve aynı tüpe hücreleri toplayarak kazıma adımını tekrarlayın. 35 milimetrelik kabı bir mililitre PBS ile durulayın ve aynı tüpe durulayın. Hücreleri toplamak için 10 dakika boyunca standart bir doku kültürü santrifüj 250-kez-G spin.

Dikkatle supernatant kapalı pipet, sonra pelet resuspend için tüp flick. Tedavi, iki yıl boyunca yapılan dokuz bağımsız deneyin kümülatif tümör büyüme verilerinde gözlendiği gibi, tedavi edilen 100'den fazla kontrol faresinde YUMM1.7 tümör büyümesinin azaldığını gösterdi. Tek bir deneyde tek tek hayvanlar için temsili tümör büyüme eğrileri sistemde değişkenlik hissi sağlar.

Monositler veya trombositler PBMC fraksiyonundan tükendiğinde veya plaka geçişi atlandığında, terapötik etki artık gözlenmez. Tedavi ya bağışıklık hücreleri veya bir antijen kaynağı yokluğunda etkisiz, ya da bir uyumsuz antijen varlığında, YUMM1.7 tümörler MC38 kolon karsinom hücreleri ile tedavi gibi. Bağışıklayıcı bir sonuç için, aynı zamanda 8-methoxypsoralen PBMC maruz önlemek için önemlidir.

İnsan CD11c+hücrelerinde, taze izole PBMC, TI-treated PBMC, plaka geçişi olmadan TI-treated PBMC, plaka geçişi öncesinde tükenmiş trombositler veya yukarıdaki her ikisi arasında insan CD11c+hücrelerinde ilgili IgG kontrollerinden belirtilen belirteçlerin değişiminin FACS analizi, DC aktivasyonunun PBMC'de trombosit varlığına ve TI plaka geçişine bağlı olduğunu göstermiştir. TI-aktive insan DCs etkili bir şekilde işleyebilir ve çapraz mevcut ya peptid antijenler, ya da tüm 8-methoxypsoralen maruz insan tümör hücrelerinden antijenler in vitro tahliller insan antijen-spesifik T hücre hatları etkinleştirmek için bir TI-ve trombosit bağımlı bir şekilde. T hücre yanıtlarının özgüllüğü işlenmiş antijenlerin kaynağına bağlıdır.

Anti-kanser bağışıklık indüklerken, her kanser hücre hattının apoptosis immünjenite maksimize etmek için titre edilmelidir. İndüklenen bağışıklık antijenlerin aşılandırılmasına özgü olacağından, her sistemin ayrıntılı diseksiyonu mümkün olacaktır. Her deneysel veya klinik kanser, ve her antimikrobiyal yanıt, benzersiz bilgilendirici olacaktır.

Her bir insan kanseri tümöre özgü antijenler kendi dizi vardır. PhDC, tümör antijenlerinin önceden laboratuvar tanımlaması gerektirmeden gerekli sıralamave sunumlarını gerçekleştirir. 8-MOP ve UVA ışığının karsinojen olduğunu lütfen unutmayın.

8-MOP'u kullanırken ve UVA ışık kaynaklarıyla çalışırken uygun koruyucu ekipmanı kullanın ve güvenlik prosedürlerini uygulayın.