Name: HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Keşfedin CTCF sınırlarının HOX gen düzenlenmesindeki rolünü CRISPR/sgRNA kütüphane taraması ile. Bu yöntem, erken embriyonik gelişim ve lösemi araştırmalarında kodlanmayan elemanların işlevini anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar ayrıca el yazması düzenleme için Nicholas Cesari teşekkür ederiz. İş Ulusal Sağlık Enstitüsü (S.H., R01DK110108, R01CA204044) gelen hibe tarafından desteklenmiştir.

1. CTCF sgRNALibrary Online bir araç kullanarak tasarım
<ol><li>CTCF bağlayıcı siteleri içinde genetik pertürbasyon platformu (GPP) tasarımcı araç (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) kullanarak insan HOX loci hedefleme sgRNA tasarım.</li>
	<li>1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA genler (şekil 1, Tablo 1) Hedefleme hedefleme sgRNAs oluşan toplam sentez. Her hedefleme DNA öğe 5-10 farklı sgRNAs tarafından hedeflenmektedir.</li>
</ol>2. sgRNA Kütüphane klonlama
<ol><li>
Sentezlenmiş oligonucleotides CRISPR lentiviral omurga vektör (lentiCRISPRv2) kopyalayın.
	<ol>
<li>2 h 37 ° C'de BsmBI restriksiyon enzimi ile LentiCRISPRv2 vektör sindirmek.</li>
		<li>Daha büyük bant varlığı için bak (yaklaşık 12,873 bp) jel BsmBI sindirim sonra Tarih ve sonra jel ekstraksiyon kiti ile arındırmak. Not: 2 kb küçük dolgu parça aynı zamanda sindirim sonra üzerinde jel var, ancak bu göz ardı edilmemelidir.</li>
		<li>Sentezlenmiş oligonucleotides ligate ve LentiCRISPR vektör 150 ile sindirilmiş ng, LentiCRISPR DNA, 10 µM oligos, 10 x T4 ligaz arabelleğinin 2 µL, T4 ligaz, 1 µL 1 µL sindirmek ve sonra onları gecede 16 ° C'de kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lentiviral CRISPR/sgRNA Kütüphane amplifikasyon için elektro-yetkili hücreleri dönüştürme.
	<ol>
<li>Electroporator 1.8 hazırlamak kV, 200 Ω ve 25 µF. Daha sonra kurtarma SOC kitle 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak ve LB Ampisilin antibiyotik plakaları 37 ° C'de önceden ısıtmak</li>
		<li>Buz 10 min için yetkili hücrelerdeyse çözülme.</li>
		<li>1.5 mL mikro-santrifüj tüpleri ve 1 mm elektroporasyon cuvettes buzda hazırlayın.</li>
		<li>25 µL 1,5 mL mikro-santrifüj tüpü yetkili hücrelerinin içine 10 ng/µL Kütüphane plazmid DNA 1 µL mix ve karışımı yavaşça el ile bir kaç kez tüp alt flicking tarafından.</li>
		<li>Küvet yeterince soğuk olduğunda, DNA/yetkili cep karışımı için transfer. İki kez tezgah dokunun ve herhangi bir su damlacıkları küvet kağıt mendil ile dış üzerinden silin. O zaman küvet elektroporasyon modülünde yer ve nabız tuşuna basın.</li>
		<li>Hemen 975 µL 37 ° C Önceden ısıtılmış SOC medya ekleyin. Karıştırmak yanında yukarı ve aşağı pipetting ve 15 mL tüp aktarmak.</li>
		<li>Döndür ve 1 h için 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>100 µL hücreleri SOC kitle 900 µL sulandırmak ve 100 µL LB Ampisilin antibiyotik agar tabağa yerleştirin. Gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plazmid DNA ayrıntılı olarak üreticinin iletişim kuralı bir maxi-prep sütun kullanarak Birleşik kolonilerden ayıklayın.
	<ol>
<li>LB agar plaka tüm kolonileri scrape ve 2 mL LB Ampisilin antibiyotik orta starter kültürü aşılamak ve gecede 37 ° C'de dinç (~ 200 x g) sallayarak ile kuluçkaya.</li>
		<li>Starter kültür 1:500 LB Ampisilin orta 100 mL seyreltik ve 12-16 dinç (~ 200 x g) sallayarak ile h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından bakteri hücre Pelet hasat</li>
		<li>Bakteriyel Pelet 10 mL süspansiyon arabellek yeniden askıya alma.</li>
		<li>Lizis arabellek 10 mL ile askıya alınmış Pelet parçalayıcı ve şiddetle ters 4 - 6 kez. Lysate oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>Lysate 10 mL soğuk nötralizasyon arabellek ile etkisiz hale getirin. Yavaşça tüpler 4 - 6 kez ters çevirme tarafından mix ve buz üzerinde 20 dk için kuluçkaya.</li>
		<li>Spin aşağı 13.500 x g 4 ° C'de 30 dk de Derhal yeni bir tüp plazmid DNA içeren süpernatant aktarın.</li>
		<li>2.3.7. adımı yineleyin ve hemen yeni bir tüp plazmid DNA içeren süpernatant aktarmak.</li>
		<li>Denge arabellek 10 mL uygulayarak sütun equilibrate ve boş sütuna tarafından yerçekimi akışını sağlar.</li>
		<li>Süpernatant sütununu ekleyin ve reçine yerçekimi akış tarafından girmek izin.</li>
		<li>Sütun 2 x 30 mL, arabellek yıkama ile yıkayın.</li>
		<li>DNA elüsyon arabellek 15 mL ile elute.</li>
		<li>10.5 mL oda sıcaklığında isopropanol eluted DNA ile DNA çökelti. Mix ve spin hemen 15.000 x g 4 ° C'de 30 dk için de aşağı ve yavaşça süpernatant dikkatle boşaltmak.</li>
		<li>DNA Pelet 5 mL % 70 etanol, santrifüj DNA Pelet 10 dak için 15.000 x g de de ile yıkayın ve açık süpernatant atın.</li>
		<li>2.5.14 iki kez daha tekrarlayın.</li>
		<li>15.000 x g 10 dk de DNA Pelet santrifüj kapasitesi ve yavaşça süpernatant DNA Pelet rahatsız etmeden dikkatle boşaltmak.</li>
		<li>5-10dk için Pelet kuruması ve DNA arabelleği (TE tampon, pH 8.0) gerekli bir hacim içinde çözülür.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. yüksek titresi sgRNA Kütüphane Lentivirus üretimi
<ol><li>Hücre hazırlık: Kültür HEK293T hücreleri içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (% 10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS) ve T-25 şişeler %1 (vol/vol) penisilin-streptomisin (PS) antibiyotik ile takıma DMEM). Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yer onları.</li>
	<li>Lentivirus paket: co transfect HEK293T hücreleri ile arıtılmış Kütüphane vektörlerin adım 2, 15 µg paket plazmid (psPAX2) ve belgili tanımlık virüs hasat önce 48 h (pMD2.G) zarf plazmid 10 µg 20 µg.</li>
	<li>Virüs koleksiyonu: sonra 48 s, collectthe virüs süpernatant ve virüs 0,45 µm düşük protein bağlayıcı PVDF membran süpernatant filtre.</li>
	<li>Virüs konsantrasyon: 50-fold dar kurutma başlığını kullanarak lentiviral süpernatant konsantre ve adım 5'te virüs MOI test.</li>
	<li>Virüs depolama: Aliquot konsantre virüs ve-80 ° C dondurucu deposunda.</li>
</ol>4. en iyi duruma getirilmiş puromisindir konsantrasyonu
<ol><li>Lösemi hücre kültürü: Kültür MOLM13 AML hücrelerinde RPMI % 10 (vol/vol) fetal sığır serum (FBS) ve 1 x T-125 şişe penisilin-streptomisin (PS) antibiyotik ile takıma 1640. Kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2yer onları. Not: Hücreleri genellikle bir bölme oranı 1:4 ya da 1:6, asla hücreleri ulaşmak izin daha fazla % 70 confluency, her 4-5 d geçirilir.</li>
	<li>MOLM13 hücreleri bir 12-şey plaka 1.0 x 104 hücre/mL, bir şey (2.0 x 104 hücreleri) başına 2 mL hacmi, yoğunluğu ile ayarlayın.</li>
	<li>
Zamanlı Kurs tahlil: puromisindir artan konsantrasyonları (0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL ve 2.0 µg/mL) 7 gün için hücrelerle tedavi MOLM13
	<ol>
<li>MOLM13 hücreler puromisindir tedavi gün 0 olmadan ve puromisindir tedavi olarak bir denetim olmadan 3 Çoğalt wells 0 günden 7 gün ayarlayın.</li>
		<li>MOLM13 hücreleri 0.1 µg/mL, 0.2 µg/mL, 0,5 µg/mL, 1.0 µg/mL ve 2.0 µg/mL, ayrı ayrı, 3 Çoğalt wells içeren her deneysel koşulu ile tedavi.</li>
		<li>Canlı hücre oranı saymak ve gün 0 gün 7 tüm koşulları içeren bir hayatta kalma eğrisine olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sağkalım eğrisi: leke hücreleri ile her puromisindir konsantrasyon için hayatta kalma eğrileri elde etmek için Trypan mavi ve sayısı canlılığı günlük.</li>
	<li>En az puromisindir konsantrasyonu en iyi duruma getirme: hangi tüm MOLM13 hücresi öldürdün 5-7 gün arasında Trypan mavi boyama, üzerinden en az puromisindir konsantrasyonu belirlemek.</li>
</ol>5. titrasyon MOLM13 lösemi hücreleri Lentiviral Kütüphanesi
<ol><li>AML hücreleri hazırlık: toplamak MOLM13 AML hücreleri iletim orta ile (RPMI 1640, %10 FBS, % 1 PS ve 8.0 µg/mL kaplama orta) 1.5 x 10 bir yoğunluk6 /mL hücreler.</li>
	<li>MOLM13 hücreleri 1.5 x 106 hücrelerde her şey ile 12-şey plaka yerleştirin.</li>
	<li>Lentivirus çözülme: Konsantre lentivirus-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve buz çözme.</li>
	<li>Mix MOLM13 hücreleri konsantre lentivirus ayrı Wells, 0, 1, 2.5, 5, da dahil olmak üzere farklı bir doz 7.5 ve 10 µL (Toplam 6 grup).</li>
	<li>Hemen bu karışımları 1000 x g 33 ° c 2 h için de santrifüj kapasitesi ve 12-şey plakaları 37 ° C ve %5 CO2 kuluçka makinesi 4 h için geri aktarmak.</li>
	<li>4 h sonra spin 400 x g oda sıcaklığında 5 min için de enfekte hücreleri aşağı.</li>
	<li>Yavaşça hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve taze medya (RPMI 1640, % 10 FBS ve % 1 PS), transduced hücrelerle yeniden askıya alma ve sonra onları T-25 Şişeler için aktarmak ve puromisindir olmadan 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>48 saat sonra 2 Şişeler (2 grup) bu hücreleri bölme: 1 µg/mL puromisindir ile 5 gün boyunca tedavi bir deney grubu ve kontrol grubu 5 gün puromisindir tedavi olmadan.</li>
	<li>Sigara transduced kontrol hücreleri ölene puromisindir seçimi 1 µg/mL puromisindir göre adım 4 ile 5 gün yerine getirir. Taze medya 2 günde karşılığında.</li>
	<li>İletim için en iyi duruma getirilmiş MOI değer ile puromisindir puromisindir tedavi olmadan hücre sayısı ile tedavi canlı hücre sayısı bölerek ölçmek.</li>
</ol>6. iletim havuza alınan CRISPR-Cas9 KO Kütüphanesi
<ol><li>İletim lentivirus ile: 1.5 x 106 MOLM13 hücreleri havuza alınmış sgRNA lentivirus ortamda 0.3 MOI ile enfekte (RPMI 1640, %10 FBS, % 1 PS ve 8 µg/mL kaplama orta) 6-şey plaka ve hücreleri lentivirus enfeksiyonu olmadan bir denetimi olarak kullanabilirsiniz.</li>
	<li>Hemen 1000 x g 33 ° c spinfect ile 2 h için de 6-şey plaka hücreleri santrifüj kapasitesi ve tabakları 37 ° C ve % 5 CO2 kuluçka makinesi 4 h için geri aktarmak.</li>
	<li>400 x g oda sıcaklığında 5 min için de enfekte hücreleri aşağı spin.</li>
	<li>Yavaşça hücre Pelet bozmadan süpernatant Aspire edin ve taze medya (RPMI 1640, % 10 FBS ve % 1 PS), transduced hücrelerle yeniden askıya alma ve sonra onları T-25 Şişeler için aktarmak ve puromisindir olmadan 48 h 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>48 saat sonra 5 gün için 1 µg/mL puromisindir hücrelerle tedavi. Taze medya için 2 gün sonra döviz ve optimum hücre yoğunluğu devam et.</li>
	<li>Seyreltme yöntemleri sınırlama ile 96-iyi tabaklar tek klon tohum ve 37 ° C ve % 5 CO2tek bu klonlar kuluçkaya. Onları 3-4 hafta boyunca kültür.</li>
	<li>Tek bir hücre bir nüfus büyür sonra hücrelerin yarısı 24-şey plakaları puromisindir seçimi altında daha fazla kültür için içine transfer ve bir sonraki adımda bu klonlar doğrulayın. Hücreleri kalanı tutmak.</li>
</ol>7. tek adımlı RT-qPCR havuza alınan CRISPR-Cas9 KO kitaplıkla taranması
<ol><li>Marker gen HOXA9 bir adım ters transkriptaz Polimeraz zincir reaksiyonu (tek adımlı RT-qPCR) ile ifade değerlendirerek eleme sgRNA entegre klon etkinliğini belirlemek. Not: HOXA9 son derece leukemogenesis22,23MOLM13 AML hücrelerinde ifade.</li>
	<li>Kont sgRNA MOLM13 ve transfer 1 x 104 hücreyi iyi bir 96-şey PCR plaka başına entegre.</li>
	<li>1000 x g 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi ve sonra iyice kaldırmak ve süpernatant ile bir damlalıklı hücre Pelet bozmadan atın.</li>
	<li>PBS arabelleği 125 µL hücrelerle yıkama ve 1000 x g 5 min için de tüp santrifüj kapasitesi. Sonra bir pipet kullanarak süpernatant 120 µL kaldırmak ve yaklaşık 5 µL PBS her iyi muhafaza.</li>
	<li>Hücre lizis arabellek, İndinavir K çözüm (10 mg/mL) 1 µL ve Dnaz çözüm (1 mg/mL) 1 µL 48 µL içeren hücre lizis ana Mix 50 µL her şey için ekleyin. Sonra yukarı ve aşağı hücre Pelet yeniden askıya almak için 5 kez damlalıklı.</li>
	<li>Karıştırmak 37 ° C'de 5 dk ardından oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya ve sonra 75 ° C 5 min için.</li>
	<li>Hücre-80 ° C dondurucu, lysate saklayın.</li>
	<li>Tek adımlı RT-qPCR reaksiyon hazırlanması: tek adımlı tepki mix ve diğer reaksiyon bileşenleri ile 4 ° c çözme O zaman kısaca çözümleri borular alt toplamak ve ışık olmadan buzda yerleştirmek için spin aşağı. Mix ve yavaşça döndürün.</li>
	<li>Hücrenin lysate 1 µL PCR wells marker gen ileri astar 1 µL dahil olmak üzere RT-qPCR reaksiyon karışımı ile eklemek (300 nM) ve ters astar (300 nM), ters transkriptaz (10 U/µL) 0,125 µL ve 5 µL tek adımlı tepki mix (2 x).</li>
	<li>Wells optik şeffaf film ve yavaşça girdap ile mühür ve reaksiyon bileşenleri karıştırmak.</li>
	<li>96-şey PCR plaka bir gerçek zamanlı PCR araç üzerinde yerleştirin.</li>
	<li>Ardından polimeraz inactivation ve DNA denatürasyon 95 ° C'de 1 dk 50 ° C'de 10 dakika için ters transkripsiyon tepki çalıştırmak</li>
	<li>RT-PCR ile PCR reaksiyon 40 devir gerçekleştirmek: denatürasyon 15 95 ° C, tavlama/uzantı ve plaka floresan için 20 okuma s s 60 ° C ve 2-5 s/adım 0.5 ° C artışlarla üzerinden 65-95 ° c eritebilir eğrisi analizi.</li>
	<li>Upregulated, downregulated ve HOXA9 gen ifade düzeylerine göre hiçbir değişiklik grupları kıyasla denetim için ayrı ayrı ayarlayın. β-aktin gen bir temizlik gen denetimi olarak kullanın.</li>
</ol>8. entegre sgRNAs olumlu klonlar Genotipleme ve Sanger sıralaması ile doğrulanması
<ol><li>Azalma HOXA9 ifade klonlar Sanger aracılığıyla doğrulamak sıralama ve PCR 50-100 ng MOLM13 genom DNA, 5 µL polimeraz tepki arabellek (10 x), 1 µL ileri astar (10 µM) ile gerçekleştirmek (AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG) ve 1 µL ters astar (10 µM) (TCTACTATTCTTTCCCCTGCACTGTTGTGGGCGATGTGCGCTCTG), 1 µL dNTP (10mM), 1 adet polimeraz (5 U /µL). İlk denatürasyon 94 ° c ile PCR reaksiyonu gerçekleştirmek için 30 s ve sonra daha fazla denatürasyon 20 94 ° C'de 20 56 ° C'de tavlama s, s, uzantısı 20 68 ° C'de s (Toplam 30 döngüleri), 10 dk 68 ° C'de son uzantısı ve 4 ° C'de tutma</li>
	<li>Hulâsa ve PCR arıtma kiti ile PCR ürünleri (boyutu 285 bp) arındırmak.</li>
	<li>2 µL T4 ligasyonu arabelleği (10 x), 50 ng T vektör DNA ile T vektör içine arıtılmış PCR ürünleri ligate (50 ng/µL), 25 saf ng PCR DNA (285 bp), 1 µL T4 ligaz (3 adet/µL) yer ligasyonu mix ve bir kuluçka 16 ° C'de içine gecede.</li>
	<li>Tüp ligasyonu mix DH5α yetkili hücreye transfer LB Ampisilin antibiyotik agar tabağa büyümek ve gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>LB plaka tek klonlar almak ve onları Genotipleme ve Sanger tarafından doğrulayın sıralama.</li>
</ol>9. sgRNAs Induced Indel mutasyon nükleaz sindirim tahlil tespiti
<ol><li>SgRNA entegre tek klon Indel oranları nükleaz test tahlil tarafından indüklenen algılamak.</li>
	<li>Ayrı ayrı 50-100 ng Indel mutant (test) ve vahşi-tipi (WT, başvuru) DNA PCR şablon olarak PCR amplicons hazırlamak 5 µL polimeraz tepki tampon (10 x), 1 µL dNTP (10mM), 1 adet polimeraz (5 U/µL), 1 µL ileri astar (10 µM) (5'-GAGATGGCGGCGCGGAAG-3') ve 1 µ L ters astar (10 µM) (5'-AAATATAGGGCGGCTGTTCACT-3'). PCR reaksiyon ilk denatürasyon 30 s için 98 ° C'de ve sonra denatürasyon 20 98 ° C'de gerçekleştirildi 20 56 ° C'de tavlama s, s, 30 s (Toplam 30 döngüleri) için 72 ° C'de uzantısı ve 10 dk 72 ° C'de son uzantısı ve 4 ° C'de tutan</li>
	<li>200 ile heteroduplex karışımı grubu "başvuru" (20 ng/µL) ve 200 ng ng "test" (20 ng/µL) PCR amplicons 0.2 mL PCR tüp ve homoduplex karışımı grubu ile sadece 400 ng "referans" PCR amplicons kontrol olarak.</li>
	<li>Ayrı ayrı heteroduplex ve homoduplex karışımı bir 1 L ölçek 800 mL su ile dolu ve sonra serin aşağı yavaş yavaş tavlama ve heteroduplex veya homoduplexes oluşturmak için oda sıcaklığında 5 min için 95 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ayrı ayrı Özet 400 ng tavlanmış heteroduplex ve homoduplex karışımdan 1 µL Indel mutasyon algılama nükleaz (2.5 U/µL) ve 2 µL nükleaz tepki arabellek (10 x) 42 ° c 60 dk için.</li>
	<li>Özel Jel Elektroforez ile sindirilir örnekleri analiz, heteroduplex karışımı DNA küçük parçaları (70-250 bp) ve homoduplex DNA'sı içine kesmek gerekir (320 bp) değil kesilmelidir.</li>
</ol>

<ol><li>Dixon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+domains+in+mammalian+genomes+identified+by+analysis+of+chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions.</a> Nature. 485 (7398), 376-380 (2012).</li>
<li>Cuddapah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+the+insulator+binding+protein+CTCF+in+chromatin+barrier+regions+reveals+demarcation+of+active+and+repressive+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Global analysis of the insulator binding protein CTCF in chromatin barrier regions reveals demarcation of active and repressive domains.</a> Genome research. 19 (1), 24-32 (2009).</li>
<li>Phillips, J. E., Corces, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF%3A+master+weaver+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CTCF: master weaver of the genome.</a> Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).</li>
<li>Tang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF-Mediated+Human+3D+Genome+Architecture+Reveals+Chromatin+Topology+for+Transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CTCF-Mediated Human 3D Genome Architecture Reveals Chromatin Topology for Transcription.</a> Cell. 163 (7), 1611-1627 (2015).</li>
<li>Lupianez, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruptions+of+topological+chromatin+domains+cause+pathogenic+rewiring+of+gene-enhancer+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions.</a> Cell. 161 (5), 1012-1025 (2015).</li>
<li>Dowen, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+cell+identity+genes+occurs+in+insulated+neighborhoods+in+mammalian+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of cell identity genes occurs in insulated neighborhoods in mammalian chromosomes.</a> Cell. 159 (2), 374-387 (2014).</li>
<li>Phillips-Cremins, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architectural+protein+subclasses+shape+3D+organization+of+genomes+during+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Architectural protein subclasses shape 3D organization of genomes during lineage commitment.</a> Cell. 153 (6), 1281-1295 (2013).</li>
<li>Narendra, V., Bulajic, M., Dekker, J., Mazzoni, E. O., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF-mediated+topological+boundaries+during+development+foster+appropriate+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">CTCF-mediated topological boundaries during development foster appropriate gene regulation.</a> Genes & Development. 30 (24), 2657-2662 (2016).</li>
<li>Narendra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+establishes+discrete+functional+chromatin+domains+at+the+Hox+clusters+during+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CTCF establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation.</a> Science. 347 (6225), 1017-1021 (2015).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HoxBlinc+RNA+Recruits+Set1%2FMLL+Complexes+to+Activate+Hox+Gene+Expression+Patterns+and+Mesoderm+Lineage+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">HoxBlinc RNA Recruits Set1/MLL Complexes to Activate Hox Gene Expression Patterns and Mesoderm Lineage Development.</a> Cell Reports. 14 (1), 103-114 (2016).</li>
<li>Patel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+TAL1+activation+is+mediated+by+an+interchromosomal+interaction+in+human+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Aberrant TAL1 activation is mediated by an interchromosomal interaction in human T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Leukemia. 28 (2), 349-361 (2014).</li>
<li>Luo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTCF+boundary+remodels+chromatin+domain+and+drives+aberrant+HOX+gene+transcription+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">CTCF boundary remodels chromatin domain and drives aberrant HOX gene transcription in acute myeloid leukemia.</a> Blood. 132 (8), 837-848 (2018).</li>
<li>Dou, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medial+HOXA+genes+demarcate+haematopoietic+stem+cell+fate+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Medial HOXA genes demarcate haematopoietic stem cell fate during human development.</a> Nature Cell Biology. 18 (6), 595-606 (2016).</li>
<li>Lawrence, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+expression+of+the+Hoxa-9+homeobox+gene+impairs+the+proliferation+and+repopulating+ability+of+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Loss of expression of the Hoxa-9 homeobox gene impairs the proliferation and repopulating ability of hematopoietic stem cells.</a> Blood. 106 (12), 3988-3994 (2005).</li>
<li>Deng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((USF1+and+hSET1A+mediated+epigenetic+modifications+regulate+lineage+differentiation+and+HoxB4+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">USF1 and hSET1A mediated epigenetic modifications regulate lineage differentiation and HoxB4 transcription.</a> PLOS Genetics. 9 (6), e1003524(2013).</li>
<li>Rawat, V. P., Humphries, R. K., Buske, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Hox%3A+the+role+of+ParaHox+genes+in+normal+and+malignant+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Beyond Hox: the role of ParaHox genes in normal and malignant hematopoiesis.</a> Blood. 120 (3), 519-527 (2012).</li>
<li>Alharbi, R. A., Pettengell, R., Pandha, H. S., Morgan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+HOX+genes+in+normal+hematopoiesis+and+acute+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">The role of HOX genes in normal hematopoiesis and acute leukemia.</a> Leukemia. 27 (5), 1000-1008 (2013).</li>
<li>Rice, K. L., Licht, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOX+deregulation+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">HOX deregulation in acute myeloid leukemia.</a> Journal of Clinical Investigation. 117 (4), 865-868 (2007).</li>
<li>Bassett, A. R., Kong, L., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+CRISPR+library+for+high-throughput+genetic+screening+in+Drosophila+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">A genome-wide CRISPR library for high-throughput genetic screening in Drosophila cells.</a> Journal of Genetics and Genomics. 42 (6), 301-309 (2015).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+deletion+screening+of+human+long+non-coding+RNAs+using+a+paired-guide+RNA+CRISPR-Cas9+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-scale deletion screening of human long non-coding RNAs using a paired-guide RNA CRISPR-Cas9 library.</a> Nature Biotechnology. 34 (12), 1279-1286 (2016).</li>
<li>Kurata, J. S., Lin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-focused+CRISPR-Cas9+library+screen+reveals+fitness-associated+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-focused CRISPR-Cas9 library screen reveals fitness-associated miRNAs.</a> RNA. 24 (7), 966-981 (2018).</li>
<li>Collins, C. T., Hess, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+HOXA9+in+leukemia%3A+dysregulation%2C+cofactors+and+essential+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Role of HOXA9 in leukemia: dysregulation, cofactors and essential targets.</a> Oncogene. 35 (9), 1090-1098 (2016).</li>
<li>Kroon, E., Thorsteinsdottir, U., Mayotte, N., Nakamura, T., Sauvageau, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NUP98-HOXA9+expression+in+hemopoietic+stem+cells+induces+chronic+and+acute+myeloid+leukemias+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">NUP98-HOXA9 expression in hemopoietic stem cells induces chronic and acute myeloid leukemias in mice.</a> The EMBO Journal. 20 (3), 350-361 (2001).</li>
<li>Koike-Yusa, H., Li, Y., Tan, E. P., Velasco-Herrera Mdel, C., Yusa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+recessive+genetic+screening+in+mammalian+cells+with+a+lentiviral+CRISPR-guide+RNA+library%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide recessive genetic screening in mammalian cells with a lentiviral CRISPR-guide RNA library.</a> Nature Biotechnology. 32 (3), 267-273 (2014).</li>
<li>Shalem, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+CRISPR-Cas9+knockout+screening+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.</a> Science. 343 (6166), 84-87 (2014).</li>
<li>Wang, T., Wei, J. J., Sabatini, D. M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screens+in+human+cells+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.</a> Science. 343 (6166), 80-84 (2014).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+sgRNAs+facilitate+CRISPR%2FCas9-mediated+mouse+genome+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Dual sgRNAs facilitate CRISPR/Cas9-mediated mouse genome targeting.</a> The FEBS Journal. 281 (7), 1717-1725 (2014).</li>
<li>Sanjana, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+interrogation+of+functional+elements+in+the+noncoding+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">High-resolution interrogation of functional elements in the noncoding genome.</a> Science. 353 (6307), 1545-1549 (2016).</li>
<li>Rajagopal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+regulatory+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of regulatory DNA.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 167-174 (2016).</li>
<li>Korkmaz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+genetic+screens+for+enhancer+elements+in+the+human+genome+using+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Functional genetic screens for enhancer elements in the human genome using CRISPR-Cas9.</a> Nature Biotechnology. 34 (2), 192-198 (2016).</li>
<li>Rezaei, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FMS-Like+Tyrosine+Kinase+3+%28FLT3%29+and+Nucleophosmin+1+%28NPM1%29+in+Iranian+Adult+Acute+Myeloid+Leukemia+Patients+with+Normal+Karyotypes%3A+Mutation+Status+and+Clinical+and+Laboratory+Characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">FMS-Like Tyrosine Kinase 3 (FLT3) and Nucleophosmin 1 (NPM1) in Iranian Adult Acute Myeloid Leukemia Patients with Normal Karyotypes: Mutation Status and Clinical and Laboratory Characteristics.</a> Turkish Journal of Haematology. 34 (4), 300-306 (2017).</li>
<li>Yaragatti, M., Basilico, C., Dailey, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active+transcriptional+regulatory+modules+by+the+functional+assay+of+DNA+from+nucleosome-free+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of active transcriptional regulatory modules by the functional assay of DNA from nucleosome-free regions.</a> Genome Research. 18 (6), 930-938 (2008).</li>
<li>Wilken, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNase+I+hypersensitivity+analysis+of+the+mouse+brain+and+retina+identifies+region-specific+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">DNase I hypersensitivity analysis of the mouse brain and retina identifies region-specific regulatory elements.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 8(2015).</li>
<li>Narlikar, L., Ovcharenko, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+regulatory+elements+in+eukaryotic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Identifying regulatory elements in eukaryotic genomes.</a> Briefings in Functional Genomics and Proteomics. 8 (4), 215-230 (2009).</li>
<li>Hnisz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+proto-oncogenes+by+disruption+of+chromosome+neighborhoods%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Activation of proto-oncogenes by disruption of chromosome neighborhoods.</a> Science. 351 (6280), 1454-1458 (2016).</li>
</ol>

Bu raporla ilgili hiçbir çatışması var.

SgRNA kütüphaneler genler ve ağ sgRNA zenginleştirme24,25,26 aracılığıyla belirli hücresel işlevleri düzenleyen tanımlamak için bir işlev tarama sistemi uygulanmış olan protein kodlayıcı gen ile ilgili ,27,28. SgRNA kütüphaneler gene özgü işlevsel ekranları distal ve proksimal elemanları, BCL11A, Tdgf1a ve ilaç direnci gibi düzenleyen için g...

Son genom etkileşim çalışmaları insan nükleer genom formları hücre tipleri ve türler arasında korunmuş topolojik ilişkilendirirken etki (TADs) kararlı saptandı. Ayrı etki alanları içine genom organizasyonu kolaylaştırır ve düzenleyici elemanlarının (örneğin, arttırıcılar ve rehberleri) arasındaki etkileşimler kısıtlar. CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF) TAD sınırları bağlar ve komşu TADs1içinde bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri kritik bir rol oynar. Ancak, her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, bu kez bir hücre tipi ama diğer telkin içinde belirli bir sitenin bir Kromatin bariyer olarak çalışmasını genom geniş CTCF veri bağlama ortaya o CTCF işlevleri Kromatin sınırları2oluşumunda diğer faaliyetleri ile birlikte. Ne bilinmemektedir olsun sınır elemanları (CTCF-bağlayıcı siteleri) doğrudan CTCF biyolojik işleve bağlı olan ve nasıl bu bağlantıları ortaya olduğunu. Bu nedenle, belirli CTCF bağlayıcı siteleri genom içinde doğrudan TADs oluşumunu düzenleyen ve organizatörü/artırıcı etkileşimleri bu etki alanlarında veya komşu etki alanları arasında denetlemek öngörmekteyiz. İnsan ve fare genom sıralama projeleri ve sonraki epigenetik analizleri, genom kopyası yeni moleküler ve genetik imzaları ortaya çıkardı. Ancak, belirli imzaları/değişiklikler gen düzenlemesi ve hücresel işlev, hem de onların moleküler mechanism(s) rolü var. henüz tam olarak anlaşılması
CTCF-aracılı TADs fonksiyonel Kromatin etki alanları3,4,5temsil kanıt birden çok satırı destekler. Her ne kadar CTCF çoğunlukla farklı hücre tipleri aynı DNA Siteler'de etkileşim, genom geniş CTCF ChIP-seq veri CTCF bir Kromatin engel bir hücre tipi ama diğer2kez görür saptandı. CTCF genom organizasyonu4,6,7arabuluculuk tarafından geliştirme aşamasında önemli bir rol oynar. CTCF sınırları bozulma engelliler artırıcı/organizatörü etkileşimleri ve gelişimsel tıkanıklık için önde gelen Gen ekspresyonu. Bu CTCF TADs aracılı öneriyor sadece yapısal bileşenleri, aynı zamanda uygun artırıcı eylem ve gen transkripsiyonu5,8,9için gerekli yasal birimleri vardır.
HOX genleri embriyonik gelişim sırasında kritik rol oynarlar ve onlar onların ifade desenleri geçici ve dağınık şekilde kısıtlanır. HOXA locus hESCs ve IMR90 hücreleri1bir sınır CTCF ilişkili öğe anterior ve posteiror genler ayıran iki kararlı TADs oluşturur. Son raporlar gösterdi HoxBlinc, bir HoxB ilişkili locus lncRNA CTCF oluşumu aracılık eder TADs ve HOXB odağı etkileşimlerde artırıcı/organizatörü yönetti. Bu ön HOXB gen etkinleştirme sırasında ESC bağlılık ve farklılaşma10yol açar. Ayrıca, belirli bir gen loci HOXA odağı da dahil olmak üzere, CTCF İLETİMLERİNİZE TAD değişti etki alanları lineage belirli bir gen ifade profilleri aracılı ve hastalık Birleşik11,12gelişimi ile ilişkili. Kanıt CTCF gen transkripsiyonu koordine ve işlevsel etki alanlarına genom organize ederek hücre kimliğini belirlemek için birincil işlevini destekler.
Embriyonik gelişim sırasında hematopoiesis, rolü rağmen hematopoetik kök ve progenitör hücre (HS/PC) işlevi HOX genleri düzenler. Bu10,13,14,15yayılması ve farklılaşma arasındaki dengeyi kontrol ederek yapılır. Ifade HOX genleri sıkıca belirtimi ve hematopoetik hücrelerin en yüksek HS ifadede farklılaşma boyunca düzenlenir / PCs. HOX gen ekspresyonu yavaş yavaş azalır, en düşük fiyat seviyeleri ile olgunlaşma sırasında gerçekleşen hematopoetik hücrelerin16farklı. HOX gen bozukluk HS/PC'lerin lösemik dönüştürme17,-18önde gelen dysregulating kendini yenileme ve farklılaşma özelliklerine göre lösemik dönüşümünün baskın bir mekanizmadır. Ancak, kurulması ve normal oncogenic ifade desenleri HOX genleri hem de ilişkili düzenleyici ağları vs koruma mekanizması belirsizdir.
CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane tarama protein kodlayıcı genlerin19 lncRNA20 ve miRNA21 farklı türler gibi de kadar kodlamayan genler olarak sorguya çekmek için yaygın olarak kullanılmış. Ancak, yüksek üretilen iş genom sıralama sgRNA Kütüphane tarama doğrulamak için sık sık uygulandığından CRISPR-Cas9 sgRNA Kütüphane yeni genomik hedefler belirlemek için maliyeti yüksek, kalır. Bizim sgRNA eleme sistemi belirli genom loci üzerinde odaklanmıştır ve hedefleme sgRNAs aracılığıyla tek adımlı RT-PCR marker gen ekspresyonu HOXA9gibi göre değerlendirir. Ayrıca, sıralama sgRNA genom ve Indel mutasyonlar entegre edildi doğruladı Sanger site hedefleme sgRNA tanımlamak için tespit edilebilir. Loci özgü CRISPR Cas9 genetik tarama yoluyla, CBS7/9 Kromatin sınır oncogenic Kromatin etki alanı oluşturmaktan ve bakımını yapmaktan Ektopik HOX gen ifade desenleri AML patogenezinde önemli bir düzenleyici olarak belirlenmiştir 12. yöntemi gelecekteki epigenetik terapi için potansiyel terapötik hedef olarak embriyonik geliştirme, hematopoiesis, leukemogenesis, aynı zamanda CTCF sınır CTCF sınır sadece belirli işlevini tanımlamak için yaygın olarak uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>Lipofektamin 3000 reaktifi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25530049</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 hücreleri&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>&nbsp; </td><td></td>C737303</tr><tr><td>HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>MOLM-13</td><td>DSMZ</td><td>ACC 554</td><td></td></tr><tr><td>lentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>52961</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pGEM&reg;-T Kolay Vektör Sistemleri&nbsp;</td><td>Promega</td><td>A137A</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligaz&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td> <td>& M0202S</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Jel Özü kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAuick PCR saflaştırma kiti</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SingleShot ve ticaret; SYBR&reg; &nbsp; Yeşil Tek Adımlı</td><td>Kit Bio-Rad Laboratuvarları</td><td>1725095</td><td></td></tr><tr><td>QIAGEN Plazmid Maxi Kiti</td><td>QIAGEN</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiye Eagle Medium&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>&nbsp; </td><td></td>11965084</tr><tr><td>dev/dak 1640&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10-082-147</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / streptomisin / L-glutamin ve nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri&nbsp;</td><td></td><td></td>10378016</tr><tr><td>Lenti-X Yoğunlaştırıcı&nbsp;</td><td>Clontech</td><td>631232</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Santa Cruz Biyoteknoloji</td><td>sc-134220</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS)&nbsp;</td><td>Genessee Bilimsel</td><td>&nbsp; 25-507</td><td></td></tr><tr><td>TAE tamponu&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Bilimsel&nbsp;</td><td>FERB49</td><td></td></tr><tr><td>Sörveyör&reg; Mutasyon Tespit Kitleri</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td>706020</td><td></td></tr><tr><td>Biorad Universal Hood II Jel Doc Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8126</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>5404000138</td><td></td></tr><tr><td>Dijital Kuru Banyolar/Blok Isıtıcılar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88870002</td><td></td></tr><tr><td>TSX Serisi Ultra Düşük Dondurucular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TSX40086V</td><td></td></tr><tr><td>Forma ve ticaret; Steri-Kült ve ticaret; CO<alt>2</alt>&nbsp; Kuluçka Makineleri:</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3308</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe & Trade; KS, Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51022484</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall&trade; Efsane ve ticaret; XT / XF Santrifüj Serisi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004506</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand & trade; &nbsp; Isotemp ve ticaret; Su Banyoları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FSGPD02</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & &nbsp; Bulucu ve ticaret; Plus Raf ve Kutu Sistemleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-762-353</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Dokunmatik Gerçek Zamanlı PCR Tespit Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp&trade; Termal Döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistem teknolojisi</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & Trade; &nbsp; Baykuş ve ticaret; EC300XL2 Kompakt Güç</td><td>Kaynağı Thermo Fisher Scientific</td><td>7217581</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific & Trade; &nbsp; Baykuş ve ticaret; EasyCast ve ticaret; B1 Mini Jel Elektroforez Sistemleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>09-528-178</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Tüp Döndürücü ve Döner Döner VWR</td><td>International</td><td>10136-084</td><td></td></tr><tr><td>VWR&reg; Mini Çalkalayıcı İnkübasyon</td><td>VWR International</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi MS104TS/00</td><td>METTLER TOLEDO</td><td>30133522</td><td></td></tr><tr><td>DS-11 FX ve DS-11 FX+ Spektrofotometre</td><td>DeNovix Inc.</td><td>DS-11 FX</td><td></td></tr></tbody></table>

hox loci odaklı crispr/sgrna kütüphane eleme tanımlayan kritik ctcf sınırları

HOX Loci Focused CRISPR/sgRNA Library Screening Identifying Critical CTCF Boundaries

CCCTC bağlayıcı faktör (CTCF)-aracılı istikrarlı topolojik etki alanlarını ilişkilendirme (TADs) oynamak önemli bir rol TADs komşu bulunan DNA öğeleri kısıtlayan etkileşimleri. CTCF embriyonik geliştirme, vücut desenlendirme, hematopoiesis ve leukemogenesis kontrol HOX genleri kayma ve zamansal ifade düzenlenmesinde önemli bir rol oynar. Ancak, olup olmadığını ve nasıl Kromatin organizasyon ve HOX gen ekspresyonu HOX ilişkili loci CTCF sınırları düzenleyen büyük ölçüde bilinmeyen kalır. Geçerli protokol TAD oluşumu ve HOX gen CTCF ilişkili Kromatin sınırlarına engellemeden etkilerini incelemek için tüm CTCF bağlama HOXA/B/C/D loci Siteler'de hedefleme belirli sgRNA havuza alınan Kütüphane oluşturuldu ifade. CRISPR-Cas9 ile genetik tarama, HOXA7/HOXA9 genler (CBS7/9) arasında bulunan CTCF bağlama sitesinde kritik bir regülatör oncogenic Kromatin etki alanı, hem de Ektopik HOX gen korumak için önemli olarak belirlenmiştir MLL yeniden düzenlenmiş Akut Miyeloid Lösemi (AML) ifade desenleri. Böylece, bu sgRNA Kütüphane yaklaşım eleme içinde belirli bir gen loci aracılı CTCF genom örgüt yeni anlayışlar sağlar ve aynı zamanda her iki kodlama metin notlu genetik düzenleyici elemanlarının fonksiyonel karakterizasyonu için bir temel sağlar ve kodlamayan, sonrası İnsan Genom Projesi dönemde normal biyolojik süreçler sırasında.

CRISPR-Cas9 teknoloji fonksiyonel genomik çalışmalar için bir güçlü araştırma araçtır. Bu düzenleme teknikleri geleneksel gen hızla değiştirme ve genom genelinde hem bireysel gen odaklı uygulamaları için yüksek faydalı vardır. Burada, ilk tek tek klonlanmış loci özgü CRISPR Cas9 dizilmiş sgRNA kitaplığı 1.070 sgRNAs 303 rasgele hedefleme genler, 60 olumlu denetimleri, insan hedefleme-500 kontrol eder ve 207 CTCF öğeleri veya lncRNA hedefleyen sgRNAs oluşan içerir dört HOX loci (<...

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

CCCTC-binding factor (CTCF)-mediated stable topologically associating domains (TADs) play a critical role in constraining interactions of DNA elements ...

Kütüphane taraması adı verilen birleştirilmiş sgRNA'mız, genom boyunca kodlamayan elementlerin biyolojik işlevini belirlemek ve değerlendirmek için güçlü bir genetik yaklaşımdır. Bu teknik, ilişkili bağlayıcı bölgeleri, kromatik sınırları veya diğer düzenleyici unsurların hedeflenen genlerin ekspresyonu üzerindeki etkisini incelememize olanak sağlar. Yaklaşımımız, erken embriyonik gelişimde HOX gen regülasyonunda CTCF, uzun kodlamayan RNA'lar ve arttırıcıların ve anormal HOX gen imzası olan bazı lösemilerin rolünü belirlemek için kullanılabilir.CtCF bağlama sitelerini hedefleyen bir sgRNA tasarımı ile bu yordamı başlatın. Metin protokolünde açıklandığı gibi hücre hazırlama da sgRNA kitaplığı klonlama. Lentivirüs paketi için, kotransfect HEK293 T hücreleri saflaştırılmış kütüphane vektörleri 20 mikrogram, paketlenmiş plazmid 15 mikrogram ve zarf plazmid 10 mikrogram, 48 saat boyunca virüsler hasat önce.48 saat sonra, virüs supernatant toplamak ve 0.45 mikron düşük protein bağlayıcı PVDF membran ile filtre. Daha sonra, konsantre kullanarak, 50 kat lentiviral supernatant konsantre. Aliquot konsantre virüsler ve eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın.MOLM13 hücrelerini toplam altı grup için konsantre lentivirus'un çeşitli dozlarıyla karıştırmak için 12 kuyu plakasının ayrı kuyularında çalışın. Hemen 33 santigrat derece iki saat boyunca 1000 kez g bu karışımları santrifüj. 12 kuyu plakasını 4 saat boyunca 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuvöze aktarın.Hücre paletini bozmadan süpernatant'ı hafifçe aspire edin ve taze takviyeli RPMI 1640 Medium ile transdükre edilmiş hücreleri yeniden askıya alın. Daha sonra yeniden askıya alınan hücreleri T25 şişelerine aktarın ve puromisin olmadan 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra iki şişeye bu hücreleri bölünmüş, beş gün boyunca mililitre püromisin başına bir mikrolitre ile tedavi deneysel bir grup, ve beş gün boyunca puromisin tedavisi olmayan bir kontrol grubu.Puromisin tedavisi yapılan canlı hücre sayısını puromisin tedavisi olmayan hücre sayısına bölerek transdüksiyon için optimize edilmiş MOI değerini ölçün. Havuzlu kütüphane ile hücreleri iletin, orta sgRNA havuzlu lentivirus 0.3 MOI ile 6 kuyu plaka içinde 1.5 milyon MOLM13 hücreleri enfekte. Bir kontrol olarak lentivirus enfeksiyonu olmadan hücreleri kullanın.Hücreleri enfekte etmek için 1000 kez g'de altı kuyu plakasını 33 derecede iki saat santrifüj edin. Daha sonra, plakaları 4 saat boyunca %5 karbondioksitle 37 derecedek kuvöze aktarın. Hücre paletini bozmadan süpernatant'ı hafifçe aspire edin ve transekten hücreleri taze ortamla yeniden askıya alın.Daha sonra hücreleri T25 şişelerine aktarın ve puromisin olmadan 48 saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. 48 saat sonra, beş gün boyunca mililitre püromisin başına bir mikrogram ile hücreleri tedavi. İki gün sonra taze ortam değişimi ve optimum hücre yoğunluğunu koruyun.Limitli seyreltme yöntemleri ile 96 iyi plakalar tek klon tohum. Bu tek klonu 37 santigrat derece ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Kültür 3-4 hafta boyunca.SgRNA entegre MOLM13 hücrelerini %0,4 Trypan Blue çözeltisi boyama ile sayın ve daha sonra kuyu başına 10.000 canlı hücreyi 96 iyi pcr plakaya aktarın. Plakayı 1000 kez g'de beş dakika santrifüj edin ve ardından bir pipetle süpernatantı iyice çıkarın ve atın. Hücre paletini rahatsız etmekten kaçının.Metinde açıklandığı gibi hücreleri yıkadıktan sonra her kuyuya hücre lisis ana karışımının 50 mikrolitreekleyin. Pipet hücre paletini yeniden askıya almak için beş kez yukarı ve aşağı. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın.Sonra, karışımı 5 dakika boyunca 37 dereceye, sonra da 5 dakika daha 75 santigrat dereceye aktarın. Rt qPCR reaksiyon karışımını içeren PCR kuyularına bir mikrolitre hücre lisatekleyin. Bu karışım ileri ve ters astar, ters transkriptaz ve Tek Adım reaksiyon karışımı marker genleri içerir.Ters transkripsiyon reaksiyonunu 50 santigrat derecede 10 dakika çalıştırın ve ardından polimerizasyon aktivasyonu ve 95 santigrat derecede bir dakika DNA denatürasyonu. Metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi 40 döngü PCR reaksiyonu ile RT PCR gerçekleştirin. HOXA9'un sanger dizilimi yoluyla ekspresyon klonlarını azalttığını doğrulayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi MOLM13 genom DNA'sı ile PCR yapın.PCR arıtma kiti ile PCR ürünlerini ayıklayın ve arındırın. Arınmış PCR ürünlerini T4 ligasyon tamponu, T vektör DNA'sı, PCR DNA'sı ve T4 ligaz ile T vektörüne dönüştürün. Ligasyon karışımını bir gecede 16 derecede bir kuvöze yerleştirin.Bir LB ampillin antibiyotik agar plaka üzerinde DH5 alfa yetkili hücreleri ve plaka içine ligasyon karışımı aktarın. Tabakları bir gecede 37 derecede kuluçkaya yatırın. LB plakasından tek klonları seçin ve genotipleme ve Sanger sıralama ile doğrulayın.Referans 200 nanogram ve 0,2 mililitre PCR tüp test PCR amplicons 200 nanogram ile heteroduplex karışım grubu ayarlayın. Kontrol olarak sadece 400 nanogram referans PCR amplicons ile homoduplex karışım grubunu ekleyin. Ayrıca 800 mililitre su ile dolu bir litre likte heteroduplex ve homoduplex karışımı 95 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra karışımları oda sıcaklığına kadar yavaş yavaş soğutarak heteroduplex veya homoduplex'i oluşturabilirsiniz. Şimdi, bir mikrolitre indel mutasyonu algılama nükleazı ile anneleştirilmiş heteroduplex ve homoduplex karışımın 400 nanogramını ve 60 dakika boyunca 42 derecede iki mikrolitre nükleaz reaksiyon tamponu sindirin. Sindirilmiş örnekleri agarose jel elektroforezile analiz edin.Heteroduplex karışım DNA'sı küçük parçalar halinde kesilmeli ve homoduplex DNA kesilmemelidir. MOLM13 pozitif klonları hedefleyen sgRNA, KONTROL HÜCRELERI ile karşılaştırıldığında HOXA9 genlerinin ekspresyon düzeylerine göre RT qPCR yöntemi ile doğrulandı. Hayatta kalan 528 klondan 10'u HOXA9 seviyelerinde %50'den fazla azalma gösterdi.hoxa9 azaltılmış entegre sgRNAs, HOXA9 değişmeden ve HOXA9 artmış klonlar, daha fazla sgRNA PCR amplifikasyon ve Sanger dizisi ile kimlik tarafından doğrulandı. HOXA9 seviyelerinde azalma gösteren on klondan altısı, Sanger dizilimi tarafından belirlenen CBS79 bölgesini hedef alan sgRNA'lar içeriyordu. Entegre sgRNA pozitif klonların indel mutasyonları PCR tabanlı genotipleme ve nükleaz sindirimi ile belirlendi.HOXA7 ve HOXA9 genleri arasında bulunan CTCF sitesinin heterozigot delemesi PCR tabanlı genotipleme ile saptandı. HOXA9-azalmış klonlar beş, altı, 28 ve 121 CBS79 sınır konumunda silme sergiledi. Benzer sonuçlar, nükleaz sindirim tahkikatları ile analiz edilen CBS79 yerindeki indel mutasyonları için de gözlenmiştir.Bu işlemi gerçekleştirirken, nükleaz sindirim istinat yoluyla sgRNA kaynaklı indel mutasyonları tespit etmek için heteroduplexes ve homoduplexes eşit miktarda yapmak önemlidir. Yaklaşımımız, seçilen işaretleyicinin kullanılmasını, genin lökemogenez üzerindeki etkilerini keşfetmek için hedef gen üzerinde yeni nesil sıralama yapılmasını sağlar. Genel yaklaşımımız, normal biyolojik süreç sırasında dikkat çeken genetik düzensiz elementlerin fonksiyonel olarak doğru lanmasını ve azaltılmasını ve ölümünden sonra genom proje hatasında lökemogenezi nin azaltılmasını önler.

hox-loci-focused-crisprsgrna-library-screening-identifying-critical

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu videoda, genomu CRISPR-Cas9 kullanılarak modifiye edilen transgenik Drosophila sineklerini tanımlamak için bir tarama yöntemi açıklanmaktadır. CRISPR-Cas9, bilim insanlarının bir organizmanın genomunu manipüle etme biçiminde devrim yaratan güçlü bir genom düzenleme aracıdır. Örnek protokolde, bir transaktivasyon dizisinin eklenmesinin dalsız (bnl) genin ilk eksonunun yerini aldığı ve böylece bnl genine özgü bir sürücü hattı olan bnl-LexA'nın oluşturulduğu CRISPR tarafından üretilen...

Genomik Modifikasyonların Taranması: Drosophila'da CRISPR Tarafından Üretilen Mutantları Tanımlamak İçin Bir Yöntem

Geliştirici aktivitenin deneysel doğrulamasına en iyi fonksiyon kaybı analizi ile yaklaşılır. Burada, hibrit bir genom (Mus musculus129 x Mus castaneus) içeren F1 ES hücrelerinde gen transkripsiyonunun alele özgü regülasyonunu incelemek için CRISPR/Cas9 aracılı delesyon kullanan etkili bir protokol sunulmaktadır.

Yaratma CRISPR / Cas9 aracılığı monoallelik Delesyonlar Fare Embriyonik Kök Hücreleri Artırıcı Fonksiyonu Eğitim için

DNA arttırıcılar gibi düzenleyici elemanlarının Gen ifadesinin fiziksel olarak hedef gen rehberleri, sık sık büyük genomik mesafeleri kapsayan uzun menzilli kromozom etkileşimleri aracılığıyla irtibata geçerek kontrol. Organizatörü yakalama Hi-C (PCHi-C) hedef genleri için potansiyel yasal sıralarının atama etkinleştirme rehberleri ve distal bölgeler arasındaki önemli etkileşimler tanımlar.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

Bu iletişim kuralını tasarlayın ve çoğaltılmış arttırıcılar deactivating füzyon protein SID4X-dCas9-KRAB, olarak da bilinen artırıcı girişim (Enhancer-i) ile hedefleme gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Bu iletişim kuralı gen ekspresyonu düzenleyen arttırıcılar tanımlaması sağlar ve ortak bir hedef geni düzenleyen arttırıcılar arasındaki ilişkileri diseksiyon kolaylaştırır.

Diseksiyon artırıcı işlevi hücre hatlarında Multiplex artırıcı CRISPR tabanlı girişim kullanma

CRISPR-Cas9 teknolojisi, memeli lerin genomunu herhangi bir hücre tipinde tam olarak dizmek için etkili bir yöntem sağlar ve genom çapında genetik ekranlar gerçekleştirmek için yeni bir araç tır. Havuzlu genom genişliğindeCRISPR-Cas9 ekranlarının başarılı bir şekilde performans alabildikleri adımları tartışan ayrıntılı bir protokol burada verilmiştir.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Bu el yazması, hücre dışı reseptör-ligand etkileşimlerini tanımlamak için genom ölçeğinde hücre tabanlı tarama yaklaşımını açıklamaktadır.

Genom ÖlçeğiCRISPR/Cas9 Genetik Ekranlar Kullanılarak Hücre Yüzey Reseptör Tanımlama

Burada, immün yetmetik farelerin deri ve ağız boşluğundaki çeşitli genlerin işlevlerini aynı anda değerlendirmek için utero embriyonik lentiviral enjeksiyonlarda ultrason güdümlü ultrason güdümlü kullanarak hızlı ve doğrudan bir in vivo CRISPR / Cas9 tarama metodolojisini açıklıyoruz.

Fare Derisi ve Ağız Boşluğundaki Gen İşlevlerini Aynı Anda Değerlendirmek için Vivo CRISPR/Cas9 Taraması

Genom, nükleer uzayda kromozom konformasyon yakalama teknolojileri ile ortaya sunulabilen farklı yapılara düzenlenmiştir. Çekirdek içi Hi-C yöntemi, Drosophila hücre hatlarında, kısıtlama parçası düzeyinde megabase çözünürlükte keşfedilebilen temas haritaları üreten, genom çapında bir kromatin etkileşimi koleksiyonu sağlar.

Drosophila Hücrelerinde Çekirdek içi Hi-C

Bu protokol, topolojik olarak ilişkili alanların (TAD'ler) sınırları ve düzenleyici ve diğer DNA dizisi elemanları arasındaki uzun menzilli kromatin etkileşimleri de dahil olmak üzere, mega tabanlı boyutlu hedeflenen genomik bölgelerin 3D organizasyonunu yüksek çözünürlükte karakterize etmek için kullanılan Capture Hi-C yöntemini açıklar.

Yüksek Çözünürlüklü 3D Kromatin Organizasyonunun Capture Hi-C ile Deşifre Edilmesi

Burada, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin anormal proliferatif kapasitesi için çok önemli olan aday genleri tanımlamak için CRISPR / Cas9 teknolojisini Hücre Sayma Kiti-8 (CCK-8) testi ile entegre eden bir protokol sunuyoruz.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Birincil CAR T hücreleri için optimize edilmiş bir CRISPR-Cas9 knockout tarama protokolü geliştirdik. Enzimatik sindirim ve sgRNA kaseti çekilmesiyle gDNA taşınmasını azaltarak, bu yaklaşım PCR artefaktlarını en aza indirerek doğru sgRNA tespitini ve fonksiyonel gen hedeflerinin sağlam tanımlanmasını sağlar.

CAR T Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Ekranlarının İyileştirmesi: Kütüphane Hazırlığı için Geliştirilmiş Bir Yöntem

Keşfedin CTCF sınırlarının HOX gen düzenlenmesindeki rolünü CRISPR/sgRNA kütüphane taraması ile. Bu yöntem, erken embriyonik gelişim ve lösemi araştırmalarında kodlanmayan elemanların işlevini anlamaya yardımcı olur.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

Daha fazla video keşfet