Kontrolsüz Barometrik Plethysmography ile Senescent Farelerde Nefes Alma Şekli Elde Etme Yöntemi
April 28th, 2020
Unrestrained barometrik plethysmography uyanık farelerde solunum paterni ölçmek için kullanılır. Standart bir protokol altında 15 s segmentleri sessiz nefes uzun bir süre benzer değerleri görüntülemek olduğunu göstermektedir. Bu metodoloji aynı zamanda apne ve artırılmış nefeslerin haznedeki ilk saat boyunca ölçülmesine olanak sağlar.
Bu protokol farelerde solunum kalıplarını ölçmek için kullanılabilir. Daha da önemlisi, sonuçları bozabilir genetiği değiştirilmiş suşları aktif davranışların etkisini en aza indirebilirsiniz. Bu tekniğin başlıca avantajları noninvaziv olması ve anestezik veya strese neden olan kısıtlamalar kullanımını gerektirmemesidir.
Tüm hortum ların ve tüplerin barometrik plethysmograph odasına bağlı olduğundan emin olarak ve bir gaz giriş tüpü ve vakum çıkış tüpünü doğrudan barometrik pletizografi odasına bağlayarak başlayın. Odaya düşük akışı kalibre etmek için, oda içine ve dışında akışı sıfıra ayarlayın ve oda içine akış tüpü kaldırın. Barometrik plethysmograph yazılımının 7700 amplifikatör kurulumundaki sıfır akışını kaydetmek için vakumu kapatın ve düşük birimli hücreye sıfır girin.
Daha sonra giriş tüpünü yeniden takın ve yüksek akışı kalibre etmek ve %20,93 oksijen dengeli azot gazının gaz karıştırıcısından barometrik pletirmografi odasından akmasını sağlamak için vakum akışını açın. Ardından, dakika başına litreden akış ölçerden ölçülen giriş değerini saniyede mililitreye dönüştürün ve değeri saniyede mililitre olarak girmek için yüksek birim hücreyi tıklatın. Yüksek kal'ı çift tıklatın, zamanı üç saniyeye değiştirin ve Ölçü'ye tıklayın.
Daha sonra metabolik analizörleri barometrik plethysmography yazılımına kalibre etmek için 7700 amplifikatör kurulum sekmesini açık bırakın. Metabolik analizörü kalibre etmek için, gaz karıştırıcı programında, gaz karıştırıcısını %20,93 oksijen ve %79,07 azot olarak ayarlayın. Ve metabolik analizörde, oksijen kalibrasyon seviyesini %20,93'e ve karbondioksiti %0'a ayarlayın Yüksek oksijen ve düşük karbondioksit yüzdesini ayarlamak için gaz analizörlerine uygun değerler girildikten sonra kadranı numuneye geri çevirin.
Barometrik pletirmografi yazılımının ABCD 4 sekmesine tıklayın ve oksijen için C2 hattının yüksek birimi altında 20.93 girin. Yüksek cal altında, üç saniye için zaman değiştirin ve Ölçü'ye tıklayın. Karbondioksit için C3 hattının düşük kalori altında sıfır girin.
Daha sonra zamanı üç saniyeye değiştirin ve düşük cal altında Ölçü'ye tıklayın. Gaz karıştırıcı programında, oksijen değerini %10'a, karbondioksit değerini %5'e değiştirin ve gaz akışının bu değerlere uyum sağlaması için birkaç dakika bekleyin. Metabolik analizörlerde, değerler kalibre edildikten sonra kadranı numuneye geri döndürmek için karbondioksiti %5'e kalibre etmek için ayarlama düğümlerini çevirin.
Analizör okumalarının kararlı olup olmadığını kontrol ettikten sonra, C3'ün altındaki yüksek üniteyi tıklatın ve karbondioksit için beş girin. Ardından yüksek cal'ı üç saniyeye değiştirin ve Ölçü'ye tıklayın. C2 seçeneğinin altındaki düşük üniteyi tıklatın ve oksijen için 10 girin ve düşük cal'ı tıklatın, üç saniye girin ve Ölçü'ye tıklayın.
Gaz karıştırıcısını %20,93 oksijen ve %79,07 nitrojene geri getirin ve odanın bu değerlere uyum sağlaması için birkaç dakika bekleyin. Akış karıştırıcısı ve oksijen-karbondioksit analizörlerinin düzgün performans gösterdiğini doğrulamak için sertifikalı gaz tankları ile düzenli olarak ek kalibrasyonlar çalıştırın. Metabolik analizörler kalibre edildiğinde, barometrik plethysmograph odasına bağlı akış ölçerleri yeniden kontrol edin ve hava akışını deney için uygun hızlara göre odanın içine ve dışına ayarlayın.
Tüm ayarlar barometrik pletizmografi yazılımına uygulandığında, Edinme sekmesinde Kapat'ı tıklatın. Sınırsız barometrik pletizografi için fareyi ev kafesine geri döndürmeden önce farenin ağırlığını ve ilk vücut sıcaklığını kaydedin.
Fareyi odaya yerleştirmeden önce boş odadan arka plandaki oksijen ve karbondioksit verilerini toplamak için 10 dakika bekleyin. İlk saat boyunca, odanın giriş ve çıkışının belirli değerlerini içeren ayrıntılı notlar alan hayvanın davranışını belgele. Oda alışkanlığının sonunda, implante edilebilir bir cihaz kullanırken her 10 dakikada bir vücut ısısı ölçümleri alarak önümüzdeki 60 dakika boyunca sessiz nefes alma segmentleri için izleyin.
Genel fare davranışlarına aşina olmaya özen tutarak, böylece koklama, bakım veya keşfetme olmadan sakin nefes alma örneklerinin uygun şekilde tespit edilebilebilmelidir. Deneyin sonunda fareyi kafesine geri döndürün ve ekipmanı iyice temizleyin ve silin. Bir metabolizma analizi için, yazılımdaki metabolik paneli açın ve odanın boş olduğu andan itibaren oksijen ve karbondioksit seviyelerinin ilk 10 dakikasının ortalamasını alın.
Barometrik pletirmografi yazılımının akış panelini görüntüleyin ve uygun parametreleri ayarlamak için Analyze Özniteliği'ni sağ tıklatın. Bir nefes analizi modeli için, hayvan davranışları ve akış paneli izleme hakkında notlar kullanarak sessiz nefes 15 saniye için zaman onaylamak. Ardından, veri parer sekmesinden açık parser diyaloğu altındaki saatleri girin ve yalnızca belirli 15 saniyelik ilgi alan segmentleri göstermek için Parser Görünüm Modu'nu tıklatın.
Apneleri ve artırılmış nefesi analiz etmek için, açık inceleme dosyasında, parser görünüm modundan çıkın ve Sayfa Görünümü'nü tür olarak seçmek için Kurulum P3 Kurulumu ve Grafik Kurulumu'nu tıklatın ve bölme sayısı olarak beş. Eksi ikiyi düşük etiketli kutuya, ikisini de saniyede mililitre cinsinden akış ölçüleri için yüksek etiketli kutuya girin ve değişiklikleri uygulayın. Ardından akış izleme panelindeki 30 dakikalık işareti kaydırın ve fare odaya yerleştirildikten sonraki 30 ila 60 dakikalık süre boyunca apneleri ve artırılmış nefesleri elle sayın.
Bu analiz için, 0,5 saniyeden daha uzun veya eşit süren askıya alınmış nefes alma süreleri apnenin göstergesidir. Artırılmış nefesler saniyede 1,25 mililitrenin üzerindeki solunum takibindeki keskin bir artışla ve ardından saniyede eksi 0,75 mililitrenin altında keskin bir düşüşle gösterilir. 22 aylık bir farede sessiz nefes almanın bu temsili akışı, nefes almanın aktif nefes alma davranışlarıyla tutarlı olmadığı bir örüntünün tipik bir örneğidir.
Bu nefes alma paterni, farelerin oda koklama ve/veya tımarlama yı araştırdığı daha aktif bir segmentten dir ve bu metodoloji için kullanılan nefes alma koleksiyonu türü için ideal değildir. İki zaman noktası arasındaki olası solunum farkı modelinin değerlendirilmesi için seçilen parametre solunum frekansı, gelgit hacmi, dakika havalandırması, gelgit hacmi inspiratuar zaman oranı ve dakika havalandırması karbondioksit oranını düşüren dioksit oranıydı. Daha fazla analiz frekans, gelgit hacmi, dakika havalandırma, gelgit hacmi inspiratuar zaman oranı ve dakika havalandırma karbondioksit oranı ihraç dört 15 saniyelik temel segmentleri her biri ile yapıldı.
Herhangi bir zaman noktası arasında anlamlı bir fark ve herhangi bir nefes alma ölçüsü için dört zaman segmentleri arasında değişkenlik fark bulundu. Sınırsız barometrik pletilografi protokolünün 30 ila 60 dakika sında her hayvan için gözlenen apne ve artırılmış nefes sayısının ölçülmesi, yaşlı hayvanların yüksek sayıda apne ve 30 dakikalık bir süre içinde artırılmış nefes varlığını sergilediklerini ortaya koymuştur. Araştırmacılar ayrıca bir müdahale veya tedavi sonucu solunum paterni herhangi bir değişiklik belgelemek için hipoksi veya hiperkapni gibi gaz sorunları istihdam edebilirsiniz.
Bu teknik, küçük kemirgenlerde ve farklı davranış farklılıkları sergileyebilecek genetiği değiştirilmiş hayvan türlerinde nefes alma şekillerini karakterize etmek için bir araç sağlar.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, uyanık farelerde nefes alma şemalarını kantitatif olarak belirlemek için kısıtlanmamış barometrik pletimografi kullanan yöntem sunar. Teknik, aktif davranışların etkisini en aza indirerek, genetik olarak modifiye edilmiş soylar için uygundur.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Solunum fizyolojisi
- Hayvan davranışı
Arka Plan
- Nefes alma şemaları, solunum fonksiyonunu anlamak için çok önemlidir.
- Geleneksel yöntemler genellikle anestezikler veya kısıtlamalar içerir, bu da sonuçları etkileyebilir.
- Kısıtlanmamış barometrik pletimografi bu sınırlamaların çözümüdür.
- Bu yöntem, stres olmadan nefes almanın gerçek zamanlı izlenmesine izin verir.
Çalışmanın Amacı
- Uyanık farelerde nefes alma şemalarını ölçmek için bir protokol geliştirmek.
- Kısa süreli ölçümlerin daha uzun ölçümlerle karşılaştırıldığında güvenilirliğini değerlendirmek.
- Apne ve artmış nefes gibi spesifik nefes olaylarını kantitatif olarak belirlemek.
Kullanılan Yöntemler
- Gaz girişi ve vakum çıkışı ile barometrik pletimografi odasının kurulumu.
- Odanın düşük akışının kalibasyonu.
- Standart zaman dilimlerinde nefes alma şemalarının ölçülmesi.
- Nefes alma şemalarını ve olayları tanımlamak için verilerin analizi.
Ana Sonuçlar
- 15 saniyelik nefes alma şeması segmentleri, uzun sessiz nefes süreleriyle ilişkilidir.
- Metod, apne ve artmış nefesleri etkili bir şekilde kantitatif olarak belirler.
- Sonuçlar, uyanık farelerde invaziv olmayan izlemenin uygulanabilirliğini gösterir.
Sonuçlar
- Kısıtlanmamış barometrik pletimografi, solunum şemalarını incelemek için güvenilir bir yöntemdir.
- Bu yaklaşım, çeşitli fare modellerinde solunum fonksiyonu üzerindeki araştırmaları artırabilir.
- Gelecekteki çalışmalar bu tekniği farklı koşullarda solunum yanıtlarını araştırmak için kullanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Unrestrained barometric plethysmography enables noninvasive, quantitative assessment of respiratory patterns in awake mice, supporting mechanistic de-risking in preclinical respiratory and neuroscience target validation. The method provides reliable, short-duration baseline measurements that reduce behavioral confounding, improving data consistency for compound screening and pathway analysis in aged or excitable strains. This approach enhances predictive confidence in early discovery by quantifying breathing frequency, tidal volume, apneas, and augmented breaths without anesthetic or restraint artifacts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies neural respiratory output including central apneas and augmented breaths to interrogate brainstem and neuromuscular targets.
- Operational Value: Enables repeated, non-stressful measurements in the same animal across time points for longitudinal target engagement studies.
- Predictive Value: Provides baseline respiratory phenotypes to de-risk mechanistic hypotheses in aging, neurodegeneration, or neuromuscular disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, quantitative endpoints (tidal volume, minute ventilation, breathing frequency) for compound effect screening.
- Operational Value: Uses 15-second quiet breathing segments to achieve reliable baselines faster than prolonged waiting, increasing throughput in behavioral-sensitive strains.
- Assay Readiness: Supports platform reuse across studies by establishing consistent quiet breathing acquisition protocols.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase respiratory phenotyping to preclinical validation by capturing disease-relevant breathing abnormalities in aged mice.
- Risk-Adjusted Advancement: Quantifies apnea and augmented breath incidence to inform go/no-go decisions on targets affecting respiratory control.
- Mechanistic De-risking: Isolates neural vs. behavioral contributors to respiratory output, reducing false positives in target validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, providing respiratory phenotyping that informs mechanism-based compound selection and safety profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neural targets regulating respiratory rhythm by quantifying apneas and augmented breaths as functional readouts.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible baseline measurements in awake mice, reducing variability from stress or movement.
- Analytics: Generates multiparametric outputs (frequency, volume, ventilation, ratios) for comparative analysis across genotypes or treatment conditions.
- Translational Research: Connects early respiratory phenotyping to preclinical continuity by modeling age-related breathing dysregulation in 22-month-old mice.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, noninvasive respiratory phenotyping workflow applicable across multiple projects and model systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity from anesthetic or restraint confounds.
- Operational Value: Improves reproducibility and scalability through standardized quiet breathing segment acquisition and rapid baseline collection.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing early, translatable respiratory safety and efficacy signals.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of compounds based on effects on breathing pattern and neural respiratory control.
Implementation Considerations
- Requires expertise in respiratory physiology and behavioral observation to identify quiet breathing segments.
- Needs barometric plethysmography chamber, gas mixing system, flow and metabolic analyzers, and synchronized software for multiparametric recording.
- Demands cross-team standardization of quiet breathing definition and apnea/augmented breath scoring criteria.
- Involves adaptation considerations for different mouse strains, ages, and behavioral phenotypes affecting baseline acquisition time.
- Limited by the need for post-habituation waiting periods to capture natural quiet breathing, though mitigated by using short 15-second segments.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:29
Barometric Plethysmograph Chamber Calibration
1:46
Metabolic Analyzer Calibration
4:18
Unrestrained Barometric Plethysmography (UBP)
5:22
Metabolism and Breathing Pattern Analyses
6:07
Apneas and Augmented Breath Analysis
7:08
Results: Representative Mouse Breathing Pattern Analyses
8:42
Conclusion
