Name: İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana meristemlerinde indüklenebilir, hücre türüne özgü gen ifadesi için modüler green gate klonlama sistemini. Bu yöntem, bitki gelişim biyolojisinde gen fonksiyonlarını incelemeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuarlarımızda çalışmalarında Almanca Araştırma Vakfı (DFG) tarafından desteklenen hibe WO 1660/6-1 (S.W.) ve GR 2104/4-1 (TG) ve SFB1101 (için TG ve J.U.L) ve Avrupa Araştırma Konseyi tarafından consolidator vermek (PLANTSTEMS 647148) TG için  S.W. DFG Grant WO 1660/2 aracılığıyla Emmy Noether Kardeşliği aracılığıyla desteklenir.

Vektörel çizimler ve modülleri kar amacı gütmeyen depodan, Addgene (https://www.addgene.org) elde edilebilir.
1. GreenGate kullanarak klonlama
<ol><li>Tablo 1' de listelenen çıkıntılar kullanarak tasarım astar, aşağıda listelenen 'NNNN' modülü türüne özgü adaptör dizileri ile değiştirme: İleri: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) CA* + belirli sıra 3´, ters: 5´AACA GGTCTC A NNNN (n) + ters tamamlayıcı belirli sıra 3´. Okuma çerçevesi bakım sağlamak için altı çizili üsleri ekleyin. Modül çıkıntılar: Not: varsayılan GreenGate framework, altı modülleri,'a-F, bir bitki dönüşüm vektör omurga ile bir ifade plazmid (şekil 1 c) monte edilir. Genellikle, A modülü organizatörü dizileri, bir B-modül bir N-terminal etiketi veya "kukla" sıra6, bir C-modül bir CD, bir D-modül C-terminal etiketi veya aptal, bir E-modülü bir sonlandırıcı ve bir F-modülü bir direnç kaset transgenik yelpazesi için liman bitkiler. Bağdaştırıcı kavraması ile preassembled diğer birimler için F modül2yerine kullanılabilecek vardır.</li>
	<li>PCR güçlendirme<ol>
<li>Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) göre standart iletişim kuralları tarafından ilgi ile tasarlanmış astar dizisi yükseltmek.</li>
		<li>Bir özel jel PCR ürünü ayırın. Tüketim ve sütun arındırmak bir ticari kullanarak doğru parçası ( Tablo malzemelerigörmek) üreticinin talimatina kit.</li>
	</ol></li>
	<li>Giriş modülü oluşturma<ol>
<li>Ayrı ayrı modül vektör ve PCR parçası (Adım 1.2.) sindirmek (Şekil 1 A, B) ile Eko31I/Bsaben 100-500 ng DNA (vektör veya parça), sindirim arabellek x 3 µL 10 ve 5-10 U Eko31I bir tüp içinde kullanarak ve 30 µL GKD2O. ile ses getirmek</li>
		<li>Karışımı yavaşça yukarı ve aşağı pipetting ve spin aşağı 1.000 x gkısaca tarafından. Bir ısı blokta 15 dakika (veya satın alınan restriksiyon enzimi zaman tavsiyesi ardından) 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
		<li>Sindirim sonra sütun arındırmak her örnek bir ticari ( Tablo malzemelerigörmek) kiti ve optik yoğunluğu 260 belirlenerek elde edilen DNA ölçmek kullanarak bir Spektrofotometre kullanarak nm (OD260).</li>
		<li>Karışımı 30-100 ng Ekle ve 10-50 ng sindirilmiş vektör yukarı ve aşağı birkaç kez pipetting tarafından sindirilmiş ve T4 ligaz (5 U/µL ve 1s (aşağıdaki öneri için oda sıcaklığında 30 µL toplam hacmi T4 ligasyonu arabellekte x 3 µL 10 ile 1 µL kuluçkaya T4 ligaz tedarikçi) ( Tablo malzemelerigörmek). Not: istediğiniz molar oranı giriş modülü: hedef vektör (örn., 3:1) bağlı olarak konsantrasyon ve giriş modülü ekler uzunluğuna ligasyonu hesaplamak.</li>
		<li>Dönüştürme verimliliğini artırmak için ısı devre dışı T4 ligaz tepki için 20 dk 65 ° C'de kuluçka tarafından.</li>
		<li>Standart laboratuvar protokolleri ve Ağar kaplamalar bakteri Ampisilin (100 µg/mL) ile desteklenmiş forma göre yetkili E. coli dönüştürmek için ligasyonu ürün hücreleri kullanma</li>
		<li>37 ° C'de bakteri ile plaka gece için kuluçkaya.</li>
		<li>İstenen giriş modülü ile kolonilerin koloni astar 86A1 (5 '-GTTGTGTGGAATTGTGAGC-3) ve 86A2 (5 '-GTTTTCCCAGTCACGACG-3) ve standart PCR koşulları kullanarak PCR tarafından ekran. Not: astar giriş vektör omurgaya bağlamak gibi bu astar kombinasyon tüm giriş modülleri için geçerlidir.</li>
		<li>Tek colonies plasmid izolasyon için seçin. Gecede bir 37 ° C shaker kuluçkaya ve 2 mL LB sıvı kültür Ampisilin (100 µg/mL) ile birlikte kullanın.</li>
		<li>İle bir mini hazırlık seti veya istenen çıkarma gecede sıvı kültüründen izole plazmid ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.</li>
		<li>Plazmid doğru INSERT ile tanımlamak için restriksiyon enzimi, örneğin kesilmiş iki enzim benzersiz olarak, INSERT 200 seçili ng plazmid, sindirim arabellek, 5-10 U x 2 µL 10, enzimleri ve GKD2 karıştırarak seçerek çözümlemesi O 20 µL için.</li>
		<li>(Bkz. Adım 1.3.9.) astar 86A1 ve 86A2 kullanarak seçili plazmid sıra.</li>
	</ol></li>
	<li>Hedef modülü oluşturma: Not: hedef plazmid için istenen hedef modülü pGGZ001, pGGZ002 veya pGGZ0032 (şekil 1 c) kullanın.<ol>
<li>Bir tüp ve 50-150 ng boş hedef vektör karıştırın (pGGZ003, örneğin), her 50-300 ng dolu giriş modülü, 2 µL 10 x sindirim arabellek arabellek, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 ligaz (30 U/µL), 5-10 U µL Eko31I ve dH2O toplam hacmiyle 20 µl. Not: istediğiniz molar oranı giriş modülü: hedef vektör (örneğin 3:1) bağlı olarak konsantrasyon ve giriş modülü ekler uzunluğuna ligasyonu hesaplayın.</li>
		<li>Mix ve 30 kez 37 ° C 5 min için ve 2 dk, 5 dk 50 ° c ve 5 dk 80 ° C'de tek numaralı adımları takip için 16 ° C arasında değişen bir PCR thermocycler kullanarak GreenGate reaksiyon2 gerçekleştirmek</li>
		<li>Verimliliği artırmak eklemek 1 µL T4 ligaz (30 U/µL) ve 1.5 µL tepki için 10 mM ATP ve ısı-inactivation 20 dk 65 ° C'de T4 DNA ligaz, ardından oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Tüp ligasyonu tepki yetkili E. coli dönüştürmek ve uygun seçmeli Ajan Spektinomisin (50 µg/mL) ile desteklenmiş Ağar kaplamalar bakteri yaymak için kullanın.</li>
		<li>37 ° C'de tabakta dönüştürülmüş E. coli gece için kuluçkaya.</li>
		<li>Dönüştürme onaylamak için her tabak, sırasıyla içeren seçili tek kolonileri Spektinomisin (50 µg/mL) ve Ampisilin (100 µg/mL) yeniden çizgi. Sadece büyümek kolonileri Spektinomisin ama Ampisilin plakaları üzerinde kullanın.</li>
		<li>E.coli kolonileri gecede 37 ° C'de kuluçkaya</li>
		<li>Tek colonies plasmid izolasyon için seçin. Gecede bir 37 ° C shaker kuluçkaya ve 2 mL LB sıvı kültür Spektinomisin (50 µg/mL) ile birlikte kullanın.</li>
		<li>Bir mini hazırlık kiti ile ilgili plazmid izole ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>Restriksiyon enzimi analizi ile kontrol edin (1.3.12 bkz.) ve sıra seçili olumlu yapıları astar 88C 3 (5 '-ACCTCTCGGGCTTCTGG-3 '), 88C 4 (5 '-CCTTTTTACGGTTCCTG-3 ') kullanarak. INSERT tam olarak bu astar ile sıralı değil, sıralama için iç astar tasarım. Not: (bkz: tartışma) pOp tekrar dizileri doğru sayıda ile içinde bind astar pOp6 (pOp6_F, 5 '-TGCATATGTCGAGCTCAAGAA-3 '; ve pOp6_R, 5 '-CTTATATAGAGGAAGGGTCTT-3 ') tanımlamak için klonlar kısa dizileri kanat PCR güçlendirme ve sonraki Jel Elektroforez için boyutuna göre ayrımcılık için kullanılabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Ara supermodule oluşturma<ol>
<li>Giriş modülleri, supermodules2, son ifade montaj önce adı GR-LhG4 sürücü içeren satırları entegre muhabir-efektör kaset, ilk yapı iki ara Plazmidler, üretmek için gerektiği gibi iki bağımsız kümelerini birleştirmek için Plazmid pGGZ001 veya pGGZ003.</li>
		<li>İlk supermodule ve H-bir adaptör olarak açıklanan2(Bu iki yapıları arasında bağlantı olarak hizmet) ikinci supermodule başında sonunda F-H adaptör eklediğinizden emin olun. Not: Sadece pGGN000 ara modülü direnç kaset taşır. İfade plazmid oluşturmak için hedef vektör ve pGGN000 ve pGGM000 ara supermodules ile GreenGate reaksiyonu gerçekleştirmek. Alternatif olarak, hedef vektör, pGGN000 ara supermodule ve GreenGate reaksiyon2gerçekleştirmek için kalan tek modülleri karıştırın. İkinci yöntem eski daha az verimlidir ama daha hızlı olabilir.</li>
		<li>PGGM000/pGGN000 supermodule oluşturmak için 1,5 µL (100-300 ng/µL) her giriş modülleri, mix 1 µL (30 ng/µL) boş ara vektör (pGGM000 veya pGGN000), 2 µL 10 x sindirim arabellek, 1,5 µL 10 mM ATP, 1 µL T4 ligaz (30 U/µL) ve 5-10 U Eko31I 20 µL toplam hacmi. Not: ligasyonu konsantrasyon ve giriş modülü ekler uzunluğu bağlı olarak istenilen molar oranı giriş modülü: hedef vektör (örn., 3:1) hesaplamak</li>
		<li>Mix ve GreenGate reaksiyon olduğu gibi adım 1.4.2 gerçekleştirmek</li>
		<li>Verimliliği artırmak eklemek 1 µL T4 ligaz ve 1,5 µL ATP (10 mM) ve ısı-inactivation 20 dk 65 ° C'de ardından oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Tüp ligasyonu tepki 10 µL yetkili E. coli ve çizgi sefaloridin (50 µg/mL) içeren plakalar üzerinde dönüştürmek için kullanabilirsiniz.</li>
		<li>37 ° C'de tabakta dönüştürülmüş E. coli gecede kuluçka gerçekleştirmek</li>
		<li>Her seçili tek kolonileri sefaloridin (50 µg/mL) ve Ampisilin (100 µg/mL) Kaplamalar, sırasıyla içeren yeniden çizgi.</li>
		<li>E.coli kolonileri gecede kuluçka 37 ° C'de plaka üzerinde gerçekleştirmek</li>
		<li>Sadece sefaloridin ancak Ampisilin plasmid izolasyon için büyümek tek kolonileri seçin. Gecede bir 37 ° C shaker kuluçkaya ve 2 mL LB sıvı kültür sefaloridin (50 µg/mL) ile birlikte kullanın.</li>
		<li>Kısa bir hazırlık kullanarak karşılık gelen plazmid Kiti ( Tablo malzemelerigörmek) izole etmek.</li>
		<li>Plazmid restriksiyon enzimi analiz tarafından kontrol (1.3.12 bkz.) ve astar 87E2 (5´-AGGCATCAAACTAAGCAGAAG-3´) ve 87E3 (5´-CGTTTCCCGTTGAATATGGC-3´) pGGM000/pGGN000 omurgaya tavlama kullanarak sıralama tarafından onaylayın. INSERT tam olarak bu astar ile sıralı değil, sıralama için iç astar tasarım. Not: pGGM000 ya da pGGN000 vektörler klonlama başarısız olursa, olası bir çözüm pGGM000 veya pGGN000 ile Eko31I sindirmek, bir jel üzerinde çalıştırmak ve jel pGGM000 veya pGGN000 omurga (yaklaşık 2000 bp) parçası olmadan arındırmak olduğunu ccdB kaset (yaklaşık 1400 bp). Sonra normalde ligasyonu tepki ile devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Çoğaltma (ori A. tum.) hedef vektörel çizimler pSa kökeni gerektirir gibi yardımcı plazmid pSOUP12varlığı bir A. tumefaciens pSOUP+ zorlanma (örneğin ASE) dönüştürmek. Kloramfenikol (34 µg/mL), sefaloridin (50 µg/mL), spektinomisin (50 µg/mL) ve tetrasiklin (12,5 µg/mL) içeren LB plakaları gittiğin bakteriler dışarı. Dönüştürülmüş A. tumefaciens 28 ° C kuluçka plaka üzerinde 2-3 gün kuluçkaya.</li>
</ol>2. nesil Arabidopsis transgenik bitkiler
<ol><li>Arabidopsis thalianadönüşümü. Not: A. thaliana bitkiler göre Zhang ve ark., 200613dönüşümü.</li>
	<li>Transgenik satır seçimi.<ol>
<li>Dönüştürülmüş bitkileri seçmek için GABI-Kat14 , sülfadiazin15direnç için kullanılan seçim düzeni kullanın.</li>
		<li>Bir şekilde tek bütünleştirilmesi olay ile istikrarlı satırları seçmek için bu nesil T2, 3:1 segregasyon oranı direnç işaretleyicisinde gösteren seçin. Bu satırları T3 nesile yaymak ve direnç gen için homozigoz bitkiler seçin. Alternatif olarak, bir Southern Blot analizi veya tek ekleme satırları seçmek için bir standart nicel gerçek zamanlı PCR (SA-qPCR)16 gerçekleştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. indüksiyon trans-etkinleştirme Arabidopsis sürücü satırları '
<ol><li>Kök<ol>
<li>Adım 1 ve 2, aşağıda açıklandığı gibi tohumlar sterilize aracılığıyla oluşturulan A. thaliana sürücü satırları muhabir ifade sınamak için.<ol>
<li>0.5-1.0 eklemek mL + %70 etanol %0.01 non-iyonik deterjan 1,5 ml tepki tüp ve ters çevir'i tüp içinde yaklaşık 100 tohum (20 mg) için bir kaç kez. Spin aşağı 1000 x g 15 s ve Aspire edin süpernatant için de.</li>
			<li>0.5-1.0 eklemek mutlak etanol mL. Tüp birkaç kez ters çevir, 1000 x g 15 s ve atma süpernatant için spin aşağı.</li>
			<li>0.5-1.0 eklemek mL mutlak etanol ve tüp t bir kaç kez, sonra spin aşağı 1.000 x g 15 s ve atma süpernatant için de ters çevir.</li>
			<li>Başlık içinde Kuru tohumlar izin. Eğer tohum tüplerde tabakalı 3.1.1.6 adımla devam edin.</li>
			<li>0.5-1.0 eklemek mL steril su ve ters çevir'i tüp bir kaç kez. Spin aşağı 1.000 x g 15 s ve atma süpernatant için de.</li>
			<li>0.5-1.0 eklemek mL steril su ve ters tüp birkaç kez. Spin aşağı 1.000 x g 15 s ve atma süpernatant için de.</li>
			<li>0.5-1.0 eklemek mL steril su.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Yarı güçte Murashige ve Skoog orta, pH 5,8 hazırlamak ve % 0,9 bitki agar ve % 1 Sükroz ekleyin. Isıyla ekledikten sonra deksametazon (Dex), DMSO, 10-30 µM için indüksiyon plakaları ve DMSO eşit miktarda için kontrol levha, son bir konsantrasyon için sırasıyla dağıldı.</li>
		<li>Tohum kök görüntüleme için plakaları koymak ve onları tabakalaşmak 48 h için karanlık ve soğuk (4 ° C) içinde.</li>
		<li>Bir bitki kuluçka (uzun gün (16/8 h), 22 ° C, nem oranı, % 65) dikey konumda plakaları koymak ve beş gün boyunca onları büyümek.</li>
		<li>Beş gün sonra çimlenme (dag), confocal lazer mikroskobu tarama kullanma Fideler görüntü.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kök<ol>
<li>Tohum 2.1.1 içinde açıklandığı gibi sterilize. ve ½ MS, % 0,9 bitki agar ve % 1 Sükroz plakaları üzerinde tohum koymak. 48 h için karanlık ve soğuk (4 ° C) içinde tabakalaşmak.</li>
		<li>Altı-yedi gün sonra çimlenme, toprak için her bitki (uzun gün (16/8 h), 22 ° C, nem oranı, % 65) tek bir tencerede fidan aktarın.</li>
		<li>Trans-etkinleştirme kaynaklanıyor'Dex veya sahte çözüm ile sulama veya sırasıyla Dex veya sahte çözümler, tesislerinde daldırma neden.</li>
		<li>Sulama için 25 µM Dex çözümde 25 mM Dex etanol içinde çözünmüş stokunun hazırlanan su kullanın. Su her 2-3 gün indüksiyon istediğiniz zaman kadar.</li>
		<li>Daldırma için bir 1 L ölçek, 750 mL su Dex veya eşdeğer miktarda DMSO 25 µM ile %0,02 silwet L-77 Dex ve sahte tedavisi için sırasıyla içeren hazır olun. 30 tek bitki daldırma s indüksiyon veya sahte çözüm. 2-3 günde görüntüleme istediğiniz zaman kadar yineleyin. Not: daldırma takiben, bitkiler yüksek nem için bir saat sağlanmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sürgün apikal Meristem (SAM)<ol>
<li>Tohum 2.1.1 içinde açıklandığı gibi sterilize. ½ MS, % 0,9 bitki agar ve % 1 Sükroz orta plakaları hazırlamak ve tohum plakaları koymak. Tabakları iki gün boyunca karanlık ve soğuk stratifikasyon için saklayın.</li>
		<li>Dikey konumu bir bitki kuluçka tabak koyun. Altı-yedi gün sonra çimlenme, fide toprak, her bitki tek bir tencerede (uzun gün (16/8 h), 22 ° C, nem oranı, % 65) aktarın.</li>
		<li>Kök yaklaşık 1 cm uzunluğunda (25-30 dag) olduğunda, SAM önümüzdeki 10-50 µM ile sprey Dex H20 bir yüz maskesi giyiyor. İndüksiyon ve daha sonraki gelişim aşamasında görüntüleme için daha uzun kaynaklanıyor veya yan sürgünler SAMs ikna etmek. Not: SAMs da olabilir sprey damlacıkları önlemek için Dex çözüm paintbrushing tarafından indüklenen. Dex püskürtülerek uygulandığında bir maske kullanın.</li>
		<li>24-48 h indüksiyon sonra SAMs teşrih ve görüntüleme için devam edin (bkz: 4.3). Not: Gen damping olasılığını azaltmak için yayılma sadece un indüklenen bitkiler kullanılmıştır. T2/T3 bitkilerde görüntüleme için kullanılmıştır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. gazeteci ifade Arabidopsis sürücü satırları görüntüleme.
<ol><li>Kök<ol>
<li>Fidan plaka 10 µg/mL propidium iyodür (PI) çözüm aktarın ve onlara karşı 5 min için leke.</li>
		<li>Kökleri odası Imaging mikroskop yerleştirin (1-iyi doku kültürü II, cam üzerinde görün Malzemeler tablo) ve bir 63 su daldırma amaç x mikroskopla tarama confocal lazer kullanarak görüntü ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>PI Floresans görselleştirmek için bir uyarma dalga boyu 488 nm ve toplamak emisyon 590 ve 660 nm arasında kullanın. MTurquoise2 floresan 458 nm uyarma kullanın ve emisyon 460 ile 615 nm arasında toplamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kök<ol>
<li>Yatay el bitki sapları bir tıraş bıçağı ile bölümlerini kesip gerçekleştirmek, bir kesimi, yaklaşık 3 cm. bilincin parmak kesmek için istediğiniz bölümün karşı tarafta kök düzeltin. Birkaç iyi kesim sırayla gerçekleştirir, ancak yalnızca kök benzer bir pozisyonda bölümlerden karşılaştırılması gereken unutmayın.</li>
		<li>Her kesim sonra musluk suyu içeren bir petri razorblade bırakın ve kök bölümler toplamak. Bu noktada bölümleri leke veya doğrudan mikroskop slaytlar üzerine monte edin.</li>
		<li>Boyama için hazırlamak 250 µg/mL PI lik küçük bir petri suda 1 mL ( Tablo malzemelerigörmek). Bölüm 5 min için bırakın ve onları suyla durulayın. Onları iyi Forseps ile mikroskop slaytlar veya ince boya fırçası aktarın. Coverslip örnekleriyle sıkmak değil için dikkat ediniz.</li>
		<li>Görüntü bir 25 Su daldırma objektif daldırma x mikroskopla tarama confocal lazer kullanarak örnekleri ( Tablo malzemelerigörmek). PI Floresans heyecanlandıracak ve 570 620 için toplamak için nm lazer ışık kullan 561 nm. Sürücü tarafından kodlanmış mTurquoise2 fluorophore efektör heyecanlandırmak için kullanım 405 nm satır yapıları ve toplamak emisyon düşük 425 475 için nm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Apikal Meristem ateş<ol>
<li>Kök sürgün ucu aşağıda 2 cm Forseps ile kesti. Kök bir elinde tutmak ve iyi forseps çiçek tomurcukları ve büyük primordia kaldırmak için kullanın. Genç primordia kaldırmak için %3 özel içeren bir petri içine dik konuma SAM saptamak. Bir dürbün ve forseps SAM yakın genç primordia kaldırmak için kullanın. Alternatif olarak, bir enjeksiyon kanül kullanın (Bu primordia kesmek için Malzemeler tablobkz:).</li>
		<li>5-10 dakika çözüm hazır SAM üstüne boyama birkaç damla pipetting tarafından doğrudan boyama gerçekleştirmek için 250 µg/mL PI çözümünde disseke SAM leke veya örnek çözüm boyama ile dolu bir tüp aktarın. Tutun SAM tam olarak boyama işlemi sırasında sular altında.</li>
		<li>Lekeli SAM küçük bir petri kabına yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) %3 özel orta ve kapak SAM GKD2O.</li>
		<li>Görüntü disseke su daldırma objektif daldırma x 25 ile donatılmış mikroskobu tarama confocal lazer kullanarak SAMs ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
		<li>PI Floresans heyecanlandıracak ve 570 620 için toplamak için nm lazer ışık kullan 561 nm. MTurquoise2 fluorophore ve toplamak emisyon 425 475 için heyecanlandırmak için kullanım 405 nm nm. Z-yönde adım boyutu 0.5 µm olarak 50 µm kapsayan görüntü yığınları kaydedin. Not: görüntüleme SAM burada açıklandığı gibi dik bir confocal lazer tarama uzun çalışma mesafesi ile mikroskop ve bir lens (burada, objektif daldırma bir su) gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Moore, I., Samalova, M., Kurup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivated+and+chemically+inducible+gene+expression+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Transactivated and chemically inducible gene expression in plants.</a> The Plant Journal. 45 (4), 651-683 (2006).</li>
<li>Lampropoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GreenGate---a+novel%2C+versatile%2C+and+efficient+cloning+system+for+plant+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">GreenGate---a novel, versatile, and efficient cloning system for plant transgenesis.</a> PLoS One. 8 (12), e83043(2013).</li>
<li>Baroux, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predictable+activation+of+tissue-specific+expression+from+a+single+gene+locus+using+the+pOp%2FLhG4+transactivation+system+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Predictable activation of tissue-specific expression from a single gene locus using the pOp/LhG4 transactivation system in Arabidopsis.</a> Plant Biotechnology Journal. 3 (1), 91-101 (2005).</li>
<li>Craft, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pOp%2FLhG4+vectors+for+stringent+glucocorticoid-dependent+transgene+expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">New pOp/LhG4 vectors for stringent glucocorticoid-dependent transgene expression in Arabidopsis.</a> The Plant Journal. 41 (6), 899-918 (2005).</li>
<li>Moore, I., Galweiler, L., Grosskopf, D., Schell, J., Palme, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transcription+activation+system+for+regulated+gene+expression+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A transcription activation system for regulated gene expression in transgenic plants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (1), 376-381 (1998).</li>
<li>Samalova, M., Brzobohaty, B., Moore, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pOp6%2FLhGR%3A+a+stringently+regulated+and+highly+responsive+dexamethasone-inducible+gene+expression+system+for+tobacco%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">pOp6/LhGR: a stringently regulated and highly responsive dexamethasone-inducible gene expression system for tobacco.</a> The Plant Journal. 41 (6), 919-935 (2005).</li>
<li>Picard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Steroid-binding+domains+for+regulating+the+functions+of+heterologous+proteins+in+cis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Steroid-binding domains for regulating the functions of heterologous proteins in cis.</a> Trends in Cell Biology. 3 (8), 278-280 (1993).</li>
<li>Schurholz, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+for+Inducible%2C+Cell+Type-Specific+Gene+Expression+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit for Inducible, Cell Type-Specific Gene Expression in Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 178 (1), 40-53 (2018).</li>
<li>Kubo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+switches+for+protoxylem+and+metaxylem+vessel+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Transcription switches for protoxylem and metaxylem vessel formation.</a> Genes and Development. 19 (16), 1855-1860 (2005).</li>
<li>Di Laurenzio, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+SCARECROW+gene+regulates+an+asymmetric+cell+division+that+is+essential+for+generating+the+radial+organization+of+the+Arabidopsis+root%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root.</a> Cell. 86 (3), 423-433 (1996).</li>
<li>Wysocka-Diller, J. W., Helariutta, Y., Fukaki, H., Malamy, J. E., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+SCARECROW+function+reveals+a+radial+patterning+mechanism+common+to+root+and+shoot%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of SCARECROW function reveals a radial patterning mechanism common to root and shoot.</a> Development. 127 (3), 595-603 (2000).</li>
<li>Hellens, R. P., Edwards, E. A., Leyland, N. R., Bean, S., Mullineaux, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pGreen%3A+a+versatile+and+flexible+binary+Ti+vector+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Molecular Biology. 42 (6), 819-832 (2000).</li>
<li>Zhang, X., Henriques, R., Lin, S. S., Niu, Q. W., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana+using+the+floral+dip+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method.</a> Nature Protocols. 1 (2), 641-646 (2006).</li>
<li>Kleinboelting, N., Huep, G., Kloetgen, A., Viehoever, P., Weisshaar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABI-Kat+SimpleSearch%3A+new+features+of+the+Arabidopsis+thaliana+T-DNA+mutant+database%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">GABI-Kat SimpleSearch: new features of the Arabidopsis thaliana T-DNA mutant database.</a> Nucleic Acids Research. 40 (Database issue), D1211-D1215 (2012).</li>
<li>GABI KAT. Selection scheme used at GABI-Kat for resistance to sulfadiazine. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html">https://www.gabi-kat.de/methods/sul-selection-scheme.html</a> (2018).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+addition+quantitative+real-time+PCR+%28SAQPCR%29%3A+a+novel+approach+for+determination+of+transgene+copy+number+avoiding+PCR+efficiency+estimation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Standard addition quantitative real-time PCR (SAQPCR): a novel approach for determination of transgene copy number avoiding PCR efficiency estimation.</a> PLoS One. 8 (1), e53489(2013).</li>
<li>Wallner, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strigolactone-+and+Karrikin-Independent+SMXL+Proteins+Are+Central+Regulators+of+Phloem+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Strigolactone- and Karrikin-Independent SMXL Proteins Are Central Regulators of Phloem Formation.</a> Current Biology. 27 (8), 1241-1247 (2017).</li>
<li>Fletcher, J. C., Brand, U., Running, M. P., Simon, R., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+of+cell+fate+decisions+by+CLAVATA3+in+Arabidopsis+shoot+meristems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signaling of cell fate decisions by CLAVATA3 in Arabidopsis shoot meristems.</a> Science. 283 (5409), 1911-1914 (1999).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cellulose+synthases+in+Arabidopsis+secondary+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Visualization of cellulose synthases in Arabidopsis secondary cell walls.</a> Science. 350 (6257), 198-203 (2015).</li>
<li>Yamaguchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN6+and+VASCULAR-RELATED+NAC-DOMAIN7+effectively+induce+transdifferentiation+into+xylem+vessel+elements+under+control+of+an+induction+system%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN6 and VASCULAR-RELATED NAC-DOMAIN7 effectively induce transdifferentiation into xylem vessel elements under control of an induction system.</a> Plant Physiology. 153 (3), 906-914 (2010).</li>
<li>Engineer, C. B., Fitzsimmons, K. C., Schmuke, J. J., Dotson, S. B., Kranz, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+Gal4-mediated+LUC%2FGFP%2FGUS+enhancer+trap+system+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a Gal4-mediated LUC/GFP/GUS enhancer trap system in Arabidopsis.</a> BMC Plant Biology. 5, 9(2005).</li>
<li>Aoyama, T., Chua, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glucocorticoid-mediated+transcriptional+induction+system+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A glucocorticoid-mediated transcriptional induction system in transgenic plants.</a> The Plant Journal. 11 (3), 605-612 (1997).</li>
<li>Decaestecker, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-TSKO+facilitates+efficient+cell+type-%2C+tissue-%2C+or+organ-specific+mutagenesis+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">CRISPR-TSKO facilitates efficient cell type-, tissue-, or organ-specific mutagenesis in Arabidopsis.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, çok yönlü ve kapsamlı araç seti indüklenebilir, hücre türü belirli transiçin görüntüsünü oluşturmak ve gerekli adımları açıklamak-harekete geçirmek. Efektör kaset sürücü satırları ile pOp düzenleyicinin kontrolü altında taşıma hatları geçiş yanlış ifade etkileri geniş bir hücre tiplerinin genetik pertürbasyon hızlı değerlendirilmesi etkinleştirme F1 nesil eğitim sağlar. Alternatif olarak, efektör yapıları sürücü satırları dönüştürmek için kullanılan veya klonlama strateji, sürücü ve efektör adap...

Biyolojide önemli bir sınırlama postgenomic dönemde verilen faktörü veya genetik pertürbasyon bağlam belirli rolü deşifre etmektir. Kurucu genetik tedirginlikler işlev kaybı ve işlev kazanç yaklaşımlar gibi genellikle sadece ömür boyu uyum süreçleri, birincil ve ikincil etkileri arasında ayrım obfuscating son nokta analizi sağlar. Buna ek olarak, bağlam belirli işlevleri maskeli veya büyük ölçekli etkileri uzak dokularda veya diğer geliştirme aşamaları ile seyreltilmiş. Ayrıca, aşırı durumlarda, herhangi bir mekanik kavrama ölümcül engel. İdeal olarak, bu sorunları aşmak için bir akut genetik pertürbasyon belirli hücre türü gibi belirli bir bağlam içinde etkisini zaman çözülmüş bir şekilde analiz edebilirsiniz. Bunu başarmak için genetik indüklenebilir, hücre türüne özgü ifade için gerekli1araçlardır. Bir yanıt-e doğru belirli bir efektör kronolojik zamanmekansal dinamikleri hızlı değerlendirilmesi için bir kaynak sağlamak için biz-si olmak kombine tarafından GreenGate sistem2 GR-LhG4 sistemi3, kanıtlanmış etkinliği ile sağlanan klonlama kolaylığı 4,5,6. Biz-si olmak oluşturmak LhG4 ligand bağlayıcı etki iyi karakterize hücre türü belirli rehberleri8kontrol altında fare Kortikoid reseptör (GR)7 erimiş chimeric transkripsiyon faktörü ifade satırlar. GR etki alanı sitozolik HSP90 tarafından bağlı olarak koşulları dinlenme, transkripsiyon faktörü çekirdeği dışında kalır. Sentetik ligand deksametazon (Dex) eklenmesiyle, nükleer translocation indüklenen ve LhG4 transkripsiyon ifadesi kaset bir mTurquoise2 muhabir gibi bir soydaş sentetik pOp-türü düzenleyici denetimi altında arabuluculuk indüksiyon sonra ifade etki alanı görselleştirmek için sürücü satırları dahil.  Böylece, sürücü satırları teknik olarak da bir efektör kaset içerir. Sürücü satırları böylece bir efektör kaset ile örneğin, aynı pOp-türü düzenleyici denetimi altında ilgi bir gen taşıyan bir satırı ile bir dizi geçiş efektör ifade akut veya uzun vadeli sonuçları hızlı bir değerlendirme sağlar içinde çok çeşitli hücre tiplerinin.
Burada, sürücü ve efektör satırları oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium, takip göstermek için gerekli prosedürleri açıklayan bir protokol sağlar Arabidopsis. Cesaret ve özgüllüğü bu yaklaşım göstermek için biz yararlanmak iyi bilinen transkripsiyon faktörü xylem gibi ikincil hücre duvar thickenings ectopically sürüş yeteneğine sahip olan VND79. PSCR10,11 sürücü çizgi ile pOp6:VND7 efektör çizgi arasında çapraz gelen F1 tedavi Ektopik xylem benzeri hücrelere kök hücre Arabidopsis nişasta kılıf oluşumunu yol açar.
Sürücü ve efektör ifade plazmidleri oluşturmak için gerekli büyük DNA derlemeleri nesil kolaylaştırmak için kullandığımız yöntem2klonlama hızlı ve verimli GreenGate. GreenGate klonlama dayalı tip II S enzimleri Eko31I veya onun isoschizomer Bsagibi ben2. Bu enzimler asimetrik tanıma sitelerinin temel kompozisyon değişen çıkıntılar üreten aşağı akım kesme. Eko31I birleşmeyle tarafından /Bsaben kısıtlama siteleri içinde oligonucleotides ve DNA öğeleri belirli çıkıntı serileri tahsis etme, modüler klonlama, büyük grupları oluşturmayı kolaylaştırmak elde edilir. GreenGate framework, DNA modülleri bağdaştırıcıları olarak hizmet ve bu sıraya göre monte edilir A-F çıkıntı sıralamasına dayanan kategori içine düşmek. Bu nedenle, istenen ürününüzü yükseltmek için tasarlanmış astar seçilen modül2 uygun olarak (şekil 1A) olmalıdır. Bir iç Eko31I / ı siteBsave sırası GreenGate giriş ve hedef modüller ile uyumlu değildir, mutagenizing olmadan, ama daha düşük verimlilik ile devam edebilirsiniz. Alternatif olarak, Eko31I kaldırmak için site yönettiği mutagenesis kullanın /Bsaben kısıtlama siteleri amino asitler gen ürünlerde değiştirmemeniz için dikkat çekici.

<table><tbody><tr><td>Ampisilin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>K029.1</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Kloramfenikol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>Kolon saflaştırma</td><td>Qiagen</td><td>QIAquick PCR Saflaştırma Kiti (250)</td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme için kültür odası</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>1 oyuklu doku kültürü odası, kapak camı üzerinde II</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4903</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific, İngiltere</td><td>D139-1</td><td></td></tr><tr><td>Eco31I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FD0294</td><td></td></tr><tr><td>enjeksiyon kanülü (0.30 x 12 mm, 30 G x 1/2)</td><td>Sterican, Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kanamisin</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>T832.2</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 CLSM, HCX PL APO lambda mavisi 63x suya daldırma objeiv</td><td>Leica, Wetzlar, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Duchefa, Haarlem, Hollanda</td><td>M0221.0050</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1 CLSM, Apo LWD 25x&nbsp; 1.1 NA suya daldırma objektifi</td><td>Nikon, Minato, Tokyo, Japonya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 35/10 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Almanya</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 60/150 mm</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Almanya</td><td>628102</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı 120/120/17</td><td>Greiner Bio-One GmbH, Almanya</td><td>688102</td><td></td></tr><tr><td>Bitki agar</td><td>Duchefa, Haarlem, Hollanda</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Plazmid ekstraksiyonu</td><td>Qiagen</td><td>QIAprep Spin Miniprep Kiti</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı</td><td>Classic, Wilkinson Sword GmbH</td><td>7005115E</td><td></td></tr><tr><td>Reaksiyon tüpleri</td><td>Sarstedt AG & Co. KG</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Kurt Obermeier GmbH & Co. KG, Bad Berleburg, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>AppliChem GmbH</td><td>3834.001</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>4621.1</td><td></td></tr><tr><td>Sülfadiazin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6387</td><td></td></tr><tr><td>Tetrasiklin</td><td>AppliChem GmbH</td><td>2228.0025</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaz 5 U/&mikro; l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>T4 Ligaz 30 U/&mikro; l</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>EL0013</td><td></td></tr></tbody></table>

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade arabidopsis thaliana aracılığıyla lhgr-aracılı trans-harekete geçirmek

Inducible, Cell Type-Specific Expression in Arabidopsis thaliana Through LhGR-Mediated Trans-Activation

İndüklenebilir, doku özel ifade genetik pertürbasyon spatio-zamansal dinamiği eğitim için önemli ve güçlü bir araçtır. (Burada GR-LhG4 denir) kanıtlanmış ve eşdeğerlik LhGR sistem indüklenebilir mesaj sistemiyle klonlama esnek ve verimli GreenGate bir araya getiren bir efektör ifade sürebilirim transgenik Arabidopsis satırlar üretilip üç ana bitki sürgen türlerinde belirli hücre aralığındaki kaset. Bu amaçla, biz chimeric transkripsiyon faktörü ve geniş bir ifade düzeyleri üzerinde sıkı kontrol sağlanması bir soydaş pOp-türü organizatörü göre daha önce gelişmiş GR-LhG4 sistemi seçti. Ayrıca, sentetik transkripsiyon faktörü etkin olduğu ifade etki alanı görmek için pOp4 veya pOp6 düzenleyicinin kontrolü altında bir ER lokalize mTurquoise2 floresan muhabir sürücü satırları içinde kodlanır. Burada, bir sürücü veya efektör satırı oluşturmak ve nasıl hücre türü belirli ifade indüklenen olabilir ve sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve Arabidopsiscambium göstermek için gereken adımları açıklar. Kullanarak birkaç veya tüm sürücü satırları, bir ifade bağlam belirli etkisi veya Multipl faktörler (effectors) sentetik pOp düzenleyicinin kontrolü altında hızla, örneğin bir efektör ve çoklu arasında bir haç F1 tesislerinde tespit edilebilir sürücü satırları. Bu yaklaşım ile VND7, NAC transkripsiyon faktörü bir hücre özerk şekilde Ektopik ikincil hücre duvar ifade ikna yeteneğine sahip Ektopik ifade örneklenir.

GreenGate klonlama yoluyla sürücü ve efektör hatları nesil
Sistem klonlama GreenGate GoldenGate klonlama ve kullanım türü IIS kısıtlama endonükleaz Bsadayanmaktadır ben ya da onun isoschizomer Eko31I. Enzim üreten çıkıntılar uzak asimetrik tanıma sitesinden, çıkıntılar temel kompozisyon serbestçe olabilir gibi temel seçilen sistemin modüler oluştururlar. Her PCR tarafından oluşturulan öğe, örneğin, bir organizatörü sıra, CD veya Sonlandırıcı, ilk eşleşen bir ...

Burada, biz üretimi tarif ve transgenik Arabidopsis thaliana bir dizi uygulama etkinleştirme indüklenebilir, doku özel ifade üç ana sürgen, sürgün apikal meristem, kök apikal meristem ve cambium satırları.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Inducible, tissue-specific expression is an important and powerful tool to study the spatio-temporal dynamics of genetic perturbation. Combining the ...

Gelişim biyolojisinde temel amaç, bir genin içeriğe özgü rolünü anlamaktır. Ve bu geleneksel nakavt mutantlar veya kurucu aşırı ifade hatları ile elde etmek zor olabilir. Biz model bitki Arabidopsis thaliana üç ana meristems indükleyici sito özgü ifade için bir kaynak oluşturmak için modüler yeşil kapı klonlama sistemi kullanılır.Aynı modüler klonlama stratejisi kullanılarak, bu yöntem dönüşüme değişmez diğer bitki türlerine uygulanabilir. Bu prosedürün görsel gösterimi değerlidir, çünkü kök meristemlerinde trans aktivasyonun etkisini analiz etmek ve kısa apeks görüntülemeden önce diseksiyon gerektirir, ki bu oldukça zor olabilir. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları sterilize edin.Sonra, pH 5.8 de yarı mukavemetli Murashige ve Skoog orta hazırlamak ve yüzde bir sakaroz ve% 0.9 agar ekleyin. Otoklavlamadan sonra, DMSO'da çözünmüş Dex'i 10 ila 30 mikromolar arasında son konsantrasyonda indüksiyon plakalarına ekleyin. Kontrol plakalarına eşit miktarda DMSO ekleyin.Kök görüntüleme için tohumları tabaklara koyun ve 48 saat karanlıkta ve 4 derece santigrat derecede tabakalayın. Plakaları bir bitki kuvözde dikey bir konuma getirin ve beş gün boyunca yetiştirin. Çimlenmeden beş gün sonra, fideleri görmek için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın.Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları hazırlamak ve büyümek. Çimlenmeden 6-7 gün sonra, her fideyi ayrı bir tencerede toprağa aktarın. Bitkileri sulama yaparak indükliyorsanız, suda etanolde çözünmüş 25 milimolar DEX stoğundan hazırlanan 25 mikromolar DEX çözeltisi kullanın.İstenilen indüksiyon zamanına kadar her 2-3 günde bir su. Daldırma ile indükleme, 25 mikromolar son konsantrasyonveya DEX ve sahte tedavi için DMSO eşdeğer miktarda 0,02% Silwet L77 ve DEX içeren su 750 mililitre ile bir litrelik bir beaker hazırlayın. Tek bir bitkiyi 30 saniye boyunca indüksiyon veya sahte çözeltiye batırın.Görüntüleme istenilen zamana kadar, her iki veya üç günde bir tekrarlayın. Başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi tohumları hazırlamak ve büyümek. Çimlenmeden 6-7 gün sonra, her fideyi ayrı bir tencerede toprağa aktarın.Gövde yaklaşık bir santimetre uzunluğunda olduğunda, suda 10 ila 50 mikromolar DEX çözeltisi ile floresan SAM sprey. Gelişimin daha sonraki aşamalarında indüksiyon ve görüntüleme için, daha uzun sapları veya yan sürgünler SAM'lar neden. İndüksiyondan 24 ila 48 saat sonra, SAM'ları inceleyin ve görüntülemeye geçin.İlk olarak, propidium iyodür milileter çözeltisi başına 10 mikrogram plaka dan fide aktarın ve beş dakika boyunca onları karşı leke. Kökleri bir mikroskop görüntüleme odasına yerleştirin ve 63x su daldırma amacı ile confocal lazer tarama mikroskobu kullanarak görüntüleyin. Propidium iyodür floresansını görselleştirmek için 488 nanometre lik bir uyarma dalga boyu kullanın ve 590 ile 660 nanometre arasında emisyon toplayın.mTurquoise2 floresans için, 458 nanometre uyarma kullanın ve sıralı tarama kullanarak 460 ve 615 nanometre arasında emisyon toplamak. İlk olarak, istenilen bölümün karşı tarafında bir parmak ile bir kök düzeltmek. Bir jilet kullanarak, yaklaşık üç santimetre lik bir segment kesti ve birkaç ince kesim gerçekleştirin.Jileti musluk suyu içeren bir Petri kabında durulayın ve kök kısımlarını toplayın. Ya bölümleri leke veya doğrudan mikroskop slaytlar üzerine monte. Boyama için, bir reaksiyon tüpünde propidium iyodür mililitre çözeltisi başına 250 mikrogram bir mililitre hazırlayın.Petri kabındaki musluk suyunu bir pipetle çıkarın ve propidium iyodür çözeltisi ve beş dakika boyunca leke ile değiştirin. Daha sonra propidium iyot çözeltisini çıkarın ve suyla durulayın. İnce pratisyen veya ince bir fırça kullanarak, lekeli bölümleri mikroskop slaytlarına aktarın.Örnekleri görüntülemek için 25x daldırma su daldırma lens ile bir confocal lazer tarama mikroskobu kullanın. Propidium iyodür floresansını heyecanlandırmak ve 570 ila 620 nanometre arasında emisyon toplamak için 561 nanometre lazer ışığı kullanın. Sürücü hattı yapıları tarafından kodlanmış mTurquoise2 florofor efektörheyecan için 405 nanometre lazer ışığı kullanın ve 425 ila 475 nanometre emisyon toplamak.İlk olarak, çekim ucunun iki santimetre altında kök kesmek için forceps kullanın. Bir elinde kök tutun ve çiçek tomurcukları ve büyük primordia kaldırmak için ince forseps kullanın. Genç primordia kaldırmak için, yüzde üç agarose içeren bir Petri kabında dik bir pozisyonda SAM düzeltmek.Daha sonra, SAM yakın herhangi bir genç primordia kaldırmak için bir dürbün ve forceps kullanın. Diseksiyonlu SAM'i propidium iyodürün mililitre çözeltisi başına 250 mikrogram içeren bir tüpe aktarın. Boyama işlemi sırasında numunenin tamamen batık kalmasını sağlarken numunenin 5 ila 10 dakika lekesini bırakın.Lekeli SAM'i yüzde üç agarose orta içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin. SAM'i çift distile suyla kapatın. İncelenen SAM'ları görüntülemek için 25 x daldırma su daldırma lensi ile donatılmış bir confocal lazer tarama mikroskobu kullanın.Propidium iyodür floresansını heyecanlandırmak ve 570 ila 620 nanometre arasında emisyon toplamak için 561 nanometre lazer ışığı kullanın. MTurquoise2 florofor heyecanlandırmak ve 425 ila 475 nanometre emisyon toplamak için 405 nanometre lazer ışığı kullanın. Z yönünde 50 mikrometreye yayılan ve adım boyutu 0,5 mikrometre olan görüntü yığınlarını kaydedin.DEX ile indüksiyon kök endodermis phloem öncüleri ve cambium hücre tipi spesifik mTurquoise2 ifade yol açar, ve ateş apikal meristem kök hücreleri. Transaktivasyon için bir test çalışması olarak, V16 aktivasyon etki alanına kaynaşmış ikincil hücre duvarı ana transkripsiyon faktörü VND7'yi kodlayan bir efektör çizgi oluşturulur. Dex veya DMSO'nun 15 mikrolitresi ile beş günlük tek tedaviden sonra, başlangıç kılıfındaki ektopik lignifikasyonun görselleştirilmesi için kök kesitler hazırlanır.İndüklenen örneklerde başlangıç kılıfı hücreleri propidium iyodür kanalı için güçlü bir sinyal gösterirken, bazı hücreler ksilem hücrelerinde hücre duvarının tipik retikülat kalınlaşmasını gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, farklı dokularda gen ekspresyonunu nasıl tetiklayacağınızı ve numunelerinizi görüntülemeye nasıl hazırlayacağınızı net bir şekilde anlamanız gerekir. Bu yordamı takiben, kurulan sürücü hatları, araştırma ilgi alanlarına göre diğer kullanıcılar tarafından oluşturulan çok çeşitli efektör yapıları ile kullanılabilir.Bu kısayol, bitki araştırmacılarının hücre tipi spesifik ekspresyonun veya ayrılmış bir zamanda ilgi çeken bir genin nakavtının etkisini hızla değerlendirmelerine yardımcı olmalıdır. Bu hücre tipi spesifik indüksiyon sistemi kortikosteroid deksametazon kullanımını gerektirir. Doğrudan temastan kaçınılmalıdır, bu nedenle tedavi sırasında eldiven ve yüz maskesi takmak önemlidir.

inducible-cell-type-specific-expression-arabidopsis-thaliana-through

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Mekansal özel Fitokrom yanıtlar moleküler temeli, doku ve organ spesifik Fitokrom eksiklikleri gösteren transgenik bitkiler kullanılarak araştırılmaktadır. Belirli hücrelerin izolasyonu mikroarray analizleri takip Sıralama mekansal özel Fitokrom yanıtları yer genleri tanımlamak için kullanılmaktadır Floresan-Aktif Hücre tarafından uyarılan Fitokrom kromofor tükenmesi sergiliyor.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Özgü bitki genleri histon değişiklikleri algılamak için güvenilir ve faydalı bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yaklaşım, kromatin immunoprecipitation (ChIP) ve gerçek zamanlı kantitatif PCR birleştirir. Çeşitli fizyolojik süreçlerde bir rol ile spesifik genlerin histon modifikasyonları tespiti sağlar.

Bitki Leaves Histon değişiklik tespiti

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Biz Arabidopsis thaliana tohum tohum kat yatak tahlili (SCBA) monte prosedürü sunuyoruz. SCBA genetik ve in vitro keşfetmek için güçlü bir araç olduğu gösterilmiştir nasıl uyuyan tohum ve hafif uyaranlara yanıt olarak endosperm kontrolleri tohum çimlenme. SCBA endosperm embriyonik büyümeyi etkilemek için şüphelenilen her durumda altında uygulanabilir prensip olarak.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

Kromatin immüno-çökeltmesi DNA in vivo olarak Arabidopsis proteinlerin bağlanma yerlerinin tanımlanması için güçlü bir tekniktir. Bu prosedür, kromatin çapraz bağlama ve parçalanma, ilgi konusu proteine ​​karşı seçici antikorlar ile immünopresipitasyon ve bağlı DNA qPCR analizini içermektedir. Biz, Arabidopsis bitkiler için optimize edilmiş basit ChIP tahlili tarif eder.

Arabidopsis Protein-DNA Etkileşimleri Tespiti için Kromatin Immunoprecipitation Deneyi<em&gt; İn Vivo</em

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi (LRIS), lateral köklerin senkron indüksiyonuna izin verir ve Arabidopsis thaliana ve mısır için sunulmuştur.

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Ve Mısır

Bu iletişim kuralı Arabidopsis içinde embriyogenez embriyo Desen oluşumu bir mikroskop altında incelenmesi ve ardından ovule izni ile gözlemlemek için bir yöntem özetliyor.

Embriyogenez Arabidopsis olarak karakterize bir yöntem

Gelişmiş bir iletişim kuralı muhabir yapıları arpa aleurone hücrelerdeki geçici gen ifadeden sonra partikül bombardımanı ölçümü için sunulmaktadır. Otomatik tahıl 96-şey plaka enzim deneyleri ile bileme yordamı için yüksek üretilen iş sağlar.

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Öğrenin, Arabidopsis thaliana meristemlerinde indüklenebilir, hücre türüne özgü gen ifadesi için modüler green gate klonlama sistemini. Bu yöntem, bitki gelişim biyolojisinde gen fonksiyonlarını incelemeyi kolaylaştırır.

İndüklenebilir, hücre türüne özgü ifade Arabidopsis thaliana aracılığıyla LhGR-aracılı Trans-harekete geçirmek

Daha fazla video keşfet