Name: Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Öğrenin opsonofagositik öldürme analizini Streptococcus pneumoniae'ye karşı immün yanıt değerlendirmek için. Bu yöntem antikor etkinliğini ve bakteriyel eliminasyonu güvenilir şekilde ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. Moon Nahm (University of Alabama Birmingham) bizim laboratuvar deneyleri OPKA kurulmasında çok değerli onun yardım için teşekkür. Bu eser FYA için Ulusal Sağlık Enstitüleri Grant 1R01AI123383-01A1 tarafından desteklenmiştir.

1. Kültür, farklılaşma ve HL-60 hücre doğrulama

<ol><li>HL-60 hücre kültür medya 500 mL RPMI L-glutamin ve 50 mL ısı inaktive fetal sığır serum ile oluşan hazırlayın. Bu HL-60 hücrelere farklılaşma etkileyebilir gibi antibiyotikler eklemeyin.</li>
	<li>HL-60 hücrelerinin yayılma/bakım için kültür 5 x 106 hücre HL-60 hücre kültür medya 75 cm2 ' deki 10 ml şişe 37 ° C ve % 5 CO2Bacalı. Geçiş hücreleri 3−4 günde optimum hücre konsantrasyonları korumak için. Not: Hücre konsantrasyonu 5 x 106/mL aşmaması gerekir.</li>
	<li>HL-60 hücrelerinin çalışma stokları aliquoting yaklaşık 1 x 106 hücre/mL % 10 Dimetil sülfoksit (DMSO) ile HL60 kültür medya tarafından 1 mL kriyojenik tüpler içine oluşturur. Not: Çalışan hisse senetleri-80 ° C'de depolanmış olabilir Ana stok-120 ° C'de muhafaza edilmelidir</li>
	<li>HL-60 hücreleri kodlamayla 1.5 x 107 hücrelerde 15 mL %0,6 N, N-dimethylformamide (DMF) ile HL-60 hücre kültür medya tarafından 37 ° C ve % 5 CO2 filtre şapkalı steril 75 cm2 şişe'de 3 gün önce OPKA için ayırt etmek.</li>
	<li>HL-60 hücreleri başarıyla ayrıştırılan ve canlılık ve hücre yüzey işaretleyicileri kurulan Akış Sitometresi protokolleri16,17göre test ederek OPKA tahlil kullanımına uygun doğrulamak, 18,19. Farklılaşma sonra HL-60 hücre hasat ve CD71, CD35, annexin V ve propidium iyodür için yaklaşık 1 x 104 hücreleri ile fluorescently Birleşik antikorlar/lekeleri leke. Not: Farklılaşmış hücreler-meli var olmak ≥65% uygun, ≥55% CD35+ve ≤20% CD71aracılığıyla belirlenen + kurulan doğrulama protokolleri14 (şekil 1).</li>
</ol>
2. OPKA arabellekleri ve Kimyasalları hazırlanması

<ol><li>Steril opsonizasyonla arabelleği B (OBB) 50 mL steril 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 42,5 mL Ca2 +/Mg2 +, ısı inaktive fetal sığır serum 5 mL ve 2.5 mL % 0.1 ile steril jelatin karıştırarak hazırlayın. 4 ° C'de mağaza</li>
	<li>Bebeği tavşan tamamlayıcı almak ve-80 ° C'de depolamak</li>
	<li>Elde etmek veya bakteriyel kültür Tabaklar (yani, 15 x 100 mm%2 5 koyun kan agar tabaklar) hazırlamak.</li>
</ol>
3. bakteriyel hisse senedi örnekleri hazırlanması

<ol><li>Test edilecek bakteriyel strain(s) bir hisse senedi alın. Not: Bu iletişim kuralı için serotip 3 pnömokok (WU2, Dr. Moon Nahm tarafından cömertçe karşılanmıştır) kullanılır.</li>
	<li>Yaklaşık olarak 37 ° C'de s 2−4 için (yani, Todd-Hewitt suyu + %0.5 Maya özü bu WU2 zorlanma için) uygun bir suyu bakteriyel zorlanma büyümek Not: Optik yoğunluk 600 nm (OD600) kültür 0.6 ve 0.8 arasında olmalıdır.</li>
	<li>Santrifüjü 6.000 x g 2 min için de tarafından bakteri cips ve uygun suyu % 15 gliserol 10−30 mL hücrelerde resuspend. Aliquot steril 1,5 mL santrifüj tüpleri ve-80 ° C'de mağaza içine bakteri kültürü (aliquot başına 500 µL)</li>
	<li>Bakteriyel bir 37 ° C su banyosu stokta bir şişe dışarı çözülme. Bakteri hücreleri cips ve OBB 500 µL steril koşullar altında resuspend.</li>
	<li>OBB (yani, hiçbir seyreltme 10 µL, 10 µL 1:10, 1: 100, vb 10 µL) bakteriyel stokunun farklı dilutions hazırlayın. OPKA tahlil (Bölüm 4-6, dahil HL-60/tamamlayıcı ortak kültür) tedavi edilmezse bakteri stokunun çeşitli dilutions kullanarak aşağıda açıklandığı gibi gerçekleştirin. Plakayı gecede 30 ° C'de (hiçbir CO2) kültür. Not: Sıcaklığı 30 ° C WU2 aşırı büyüme önlemek özeldir; diğer suşların/serotipleri 37 ° C'de en iyi şekilde ulaşması</li>
	<li>Colonies için her seyreltme tedavi edilmezse bakteri stokunun HL-60 hücreleri ve tamamlayıcı ile birlikte kültürlü saymak. Belirlemek hangi seyreltme bakterilerin sayılabilir koloniler (yaklaşık 80−120 CFUs tedavi edilmezse bakteri HL-60 hücrelerle birlikte kültürlü için) en iyi sayısını verir. Bu seyreltme için gelecekteki OPKAs bakteriyel bu hisse senedi içeren dikkat edin.</li>
</ol>
4. bakteriyel tedavi ve kültür

<ol><li>3.3. adımda hazırlanan bakteriyel stokunun bir tüp çözülme. Bakteri (6.000 x g için 2 dk) cips ve hücre Pelet 3.6. adımda belirlenen en uygun seyreltme, OBB içinde resuspend.</li>
	<li>Resuspended bakteriyel seyreltme iyi bir yuvarlak alt 96-şey hücre kültür plaka başına 10 µL pipet.</li>
	<li>Uygun antikor veya uyuşturucu tedavi 20 µL yinelenen deneysel her kuyuya ekleyin. Not: Bu iletişim kuralı, farelerde oluşturulan bir serotip özgü antikor tedavisi X eklenir ve serotip 3 polisakkarit kapsülü aşağılamak için bilinen bir glikozid hidrolaz enzim tedavisi olarak Y (Şekil 2)4,20eklenir. Denetim kuyular için PBS veya OBB, x 1 tedavi kuyular için kullanılan arabellek bağlı olarak kullanın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 h için yaklaşık 90 devirde örnek plaka sallamak. Bu koşullara bağlı olarak en uygun sıcaklık veya test edilen tedavilerin sallayarak koşulları ayarlayın.</li>
</ol>
5. HL-60 bakteriyel ortak kültür

<ol><li>HL-60 hücreleri DMF ile üç gün önceden (bkz. Adım 1.4) 15 mL konik tüpler içine kabul edilir HL-60 farklılaşmış hücre hasat tarafından hazırlayın. Hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve en az 10 mL 1 x PBS yıkayın.</li>
	<li>Yıkanmış hücreler (500 x g, 3 dk) cips, süpernatant atmak ve OBB hücrelerde resuspend (1 mL OBB ile başlatmak ve 1 x 107/mL Hücre sayımı sonra son bir konsantrasyon için ayarlayabilirsiniz).</li>
	<li>Bebeği tavşan tamamlayıcı (steril, su katılmamış bebeği tavşan serum, Yaş 3−4 hafta) 1:5 son seste ekleyin. Not: HL-60-tamamlayıcı karışımı son konsantrasyonu 1 x 107/mL olmalıdır. Tamamlayıcı bağımlılık sınama olumlu sonuçlanırsa, ısı inaktive tamamlayıcı ile etkin HL-60 hücreleri içeren ikinci bir çözüm kullanılabilir (tamamlayıcı inaktive olur bir su banyosunda kuluçka > için en az 30 dk. 55 ° C).</li>
	<li>1 h bakteri kültürü tam (4.4) adımdır sonra yinelenen kuyular iki grup (yani, kullanım sadece 20 µL pipetting hata için hesap için orijinal 30 µL ortak kültür) için her örnek (yani, her 30 µL örneği de iki yeni kuyu içine 10 µL) bölün : bir set HL-60-tamamlayıcı ile birlikte kültürlü olacak ve bir bakteri yalnızca yer alacak. 50 µL wells deneysel her dizi için (Kimden adım 5.3) HL-60-tamamlayıcı karışımı ekleyin (temsilci seçilen + HL-60); OBB yalnız 50 µL bakteri sadece (temsilci seçilen -HL-60) kuyu için ekleyin. Not: Bu örnekte, yaklaşık 800 bakteriyel CFUs 5 x 105/50 µL HL-60 hücrelerle ilk ortak kültürü için kullanılır. Bu çeşitlilik enfeksiyon çok yüksek veya çok düşük son koloni numaraları tarafından belirtildiği şekilde ise, ilk bakteriyel seyreltme HL-60 hücre sayısı olarak ayarlayın.</li>
	<li>96-şey plaka için 1 h (hiçbir CO2) 37 ° C'de sallamak.</li>
</ol>
6. örnek kaplama ve gecede kuluçka

<ol><li>Her örnek en az 50 µL hacmi böylece her şey 1:5 ile OBB, oranında seyreltin.</li>
	<li>Doğrudan üzerine örnekleri arasında yeterli boşluk sağlanması bakteriyel kültür plaka, belirlenmiş bir alanda her örneğinin 50 µL pipet. 15 x 100 mm için2 yuvarlak Ağar Kaplamalar, damlalıklı yaklaşık 4 örnekleri üzerine bir tabak.</li>
	<li>Kapak ve örnekleri, oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Kaplamalar ve kültür gecede 30 ° C'de (hiçbir CO2) tersine çevirin. Alternatif olarak, tabak anoksik koşulların Bakteriyel büyüme etkiler olup olmadığını sınamak için anaerobik kavanoz veya denetime Morfoloji için kültür.</li>
	<li>Gecede kültür sonra her belirlenen örnek alanı kolonilerde saymak. Her sette karşılık gelen denetim ve/veya HL-60 cep ortak kültür almazsınız örnekleri canlı hücre sayısı karşılaştırarak veri analiz (gösterge % %0 100 hücre kurtulma hücre öldürme).</li>
</ol>

<ol><li>Romero-Steiner, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+an+opsonophagocytic+assay+for+the+measurement+of+functional+antibody+activity+against+Streptococcus+pneumoniae+using+differentiated+HL-60+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (4), 415-422 (1997).</li>
<li>Nanra, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsular+polysaccharides+are+an+important+immune+evasion+mechanism+for+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Vaccines+and+Immunotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Capsular polysaccharides are an important immune evasion mechanism for Staphylococcus aureus.</a> Human Vaccines and Immunotherapeutics. 9 (3), 480-487 (2013).</li>
<li>Ishibashi, K., Yamaguchi, O., Shiraiwa, Y., Ogihara, M., Shigeta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+therapy+of+Pseudomonas+aeruginosa+pyelonephritis+in+neutropenic+mice+with+human+antilipopolysaccharide+monoclonal+antibody+and+cefsulodin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Urology%22%5BJournal%5D)">Combination therapy of Pseudomonas aeruginosa pyelonephritis in neutropenic mice with human antilipopolysaccharide monoclonal antibody and cefsulodin.</a> Journal of Urology. 155 (6), 2094-2097 (1996).</li>
<li>Middleton, D. R., Paschall, A. V., Duke, J. A., Avci, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+Hydrolysis+of+Pneumococcal+Capsular+Polysaccharide+Renders+the+Bacterium+Vulnerable+to+Host+Defense%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Enzymatic Hydrolysis of Pneumococcal Capsular Polysaccharide Renders the Bacterium Vulnerable to Host Defense.</a> Infection and Immunity. , (2018).</li>
<li>Baker, C. J., Noya, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+use+of+intravenous+immune+globulin+for+group+B+streptococcal+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Potential use of intravenous immune globulin for group B streptococcal infection.</a> Reviews of Infectious Diseases. 12, Suppl 4 476-482 (1990).</li>
<li>Tian, H., Weber, S., Thorkildson, P., Kozel, T. R., Pirofski, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+opsonic+and+nonopsonic+serotype+3+pneumococcal+capsular+polysaccharide-specific+monoclonal+antibodies+against+intranasal+challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Efficacy of opsonic and nonopsonic serotype 3 pneumococcal capsular polysaccharide-specific monoclonal antibodies against intranasal challenge with Streptococcus pneumoniae in mice.</a> Infection and Immunity. 77 (4), 1502-1513 (2009).</li>
<li>Parameswarappa, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Semi-synthetic+Oligosaccharide+Conjugate+Vaccine+Candidate+Confers+Protection+against+Streptococcus+pneumoniae+Serotype+3+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">A Semi-synthetic Oligosaccharide Conjugate Vaccine Candidate Confers Protection against Streptococcus pneumoniae Serotype 3 Infection.</a> Cell Chemical Biology. 23 (11), 1407-1416 (2016).</li>
<li>Jackson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomized+clinical+trial+of+a+single+versus+a+double+dose+of+13-valent+pneumococcal+conjugate+vaccine+in+adults+55+through+74+years+of+age+previously+vaccinated+with+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Randomized clinical trial of a single versus a double dose of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in adults 55 through 74 years of age previously vaccinated with 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine.</a> Vaccine. 36 (5), 606-614 (2018).</li>
<li>Cywes-Bentley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+to+a+conserved+antigenic+target+is+protective+against+diverse+prokaryotic+and+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Antibody to a conserved antigenic target is protective against diverse prokaryotic and eukaryotic pathogens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 110 (24), 2209-2218 (2013).</li>
<li>Fleck, R. A., Romero-Steiner, S., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+HL-60+cell+line+to+measure+opsonic+capacity+of+pneumococcal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Diagnostic+Laboratory+Immunology%22%5BJournal%5D)">Use of HL-60 cell line to measure opsonic capacity of pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 12 (1), 19-27 (2005).</li>
<li>Collins, S. J., Ruscetti, F. W., Gallagher, R. E., Gallo, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Terminal+differentiation+of+human+promyelocytic+leukemia+cells+induced+by+dimethyl+sulfoxide+and+other+polar+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+USA%22%5BJournal%5D)">Terminal differentiation of human promyelocytic leukemia cells induced by dimethyl sulfoxide and other polar compounds.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 75 (5), 2458-2462 (1978).</li>
<li>Melnick, N., Rajam, G., Carlone, G. M., Sampson, J. S., Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+novel+therapeutic+approach+to+treating+severe+pneumococcal+infection+using+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a novel therapeutic approach to treating severe pneumococcal infection using a mouse model.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 16 (6), 806-810 (2009).</li>
<li>Dwyer, M., Gadjeva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opsonophagocytic+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Opsonophagocytic assay.</a> Methods in Molecular Biology. 1100, 373-379 (2014).</li>
<li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+fourfold+multiplexed+opsonophagocytosis+assay+for+pneumococcal+antibodies+against+additional+serotypes+and+discovery+of+serological+subtypes+in+Streptococcus+pneumoniae+serotype+20%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Vaccine+Immunololgy%22%5BJournal%5D)">Development of a fourfold multiplexed opsonophagocytosis assay for pneumococcal antibodies against additional serotypes and discovery of serological subtypes in Streptococcus pneumoniae serotype 20.</a> Clinical and Vaccine Immunololgy. 19 (6), 835-841 (2012).</li>
<li>Clarke, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-cost%2C+high-throughput%2C+automated+counting+of+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Low-cost, high-throughput, automated counting of bacterial colonies.</a> Cytometry Part A. 77 (8), 790-797 (2010).</li>
<li>Aanei, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Database-guided+Flow-cytometry+for+Evaluation+of+Bone+Marrow+Myeloid+Cell+Maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e57867(2018).</li>
<li>Hirz, T., Dumontet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+Isolation+and+Analysis+to+Determine+their+Role+in+Lymphoma+Cell+Sensitivity+to+Therapeutic+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visulaized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Neutrophil Isolation and Analysis to Determine their Role in Lymphoma Cell Sensitivity to Therapeutic Agents.</a> Journal of Visulaized Experiments. (109), e53846(2016).</li>
<li>Rieger, A. M., Nelson, K. L., Konowalchuk, J. D., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+annexin+V%2Fpropidium+iodide+apoptosis+assay+for+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Modified annexin V/propidium iodide apoptosis assay for accurate assessment of cell death.</a> Journal of Visualized Experiments. (50), 2597(2011).</li>
<li>Blair, O. C., Carbone, R., Sartorelli, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+HL-60+promyelocytic+leukemia+cells%3A+simultaneous+determination+of+phagocytic+activity+and+cell+cycle+distribution+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Differentiation of HL-60 promyelocytic leukemia cells: simultaneous determination of phagocytic activity and cell cycle distribution by flow cytometry.</a> Cytometry. 7 (2), 171-177 (1986).</li>
<li>Middleton, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+the+Streptococcus+pneumoniae+type+3+capsule-specific+glycoside+hydrolase+of+Paenibacillus+species+32352%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of the Streptococcus pneumoniae type 3 capsule-specific glycoside hydrolase of Paenibacillus species 32352.</a> Glycobiology. 28 (2), 90-99 (2018).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

OPKAs antikor aracılı bağışıklık yanıtı aşılar6,8tarafından indüklenen değerlendirmede önemli roller hizmet. Adaptasyon koşullarında test edilecek bu Basitleştirilmiş OPKA ana önemi nedir (antikorlar, enzim tedavisi, vs.). Bu tahlil opsonins (yani, antikorlar) katkısını fagositoz içinde test etmek için kullanılan bu anlamda, bu da normalde fagositik yolları inhibe virülans faktörleri (yani kapsüler polisakkaritler) aşmak için yollar değerlendirmek için kullanılab...

Tahlil (OPKA) öldürme opsonophagocytic bağışıklık yanıtı ve fonksiyon sonraki değişiklikler değişiklikler bakteriyel yapısı veya işlev bağlamak için önemli bir araçtır. Bu nedenle, bu sık sık antikor tedavisi, aşı adaylar, enzim optimizasyonu, vb bağışıklık tabanlı etkinliğini belirlemek için tamamlayıcı bir tahlil olarak kullanılır. İçinde vivo deneyleri etkili temizleme veya koruma bir bakteriyel enfeksiyon modeli belirlemek gerekli olmakla birlikte, OPKA bakteriyel hücre ölümü bağışıklık katkısı en temel bileşenleri değerlendirmek için kullanılabilir: bakteri, bağışıklık hücreleri ve deneysel tedaviler. Önceki çalışmalarda OPKAs değiştiren ve bakteri ve serotipleri, Streptococcus pneumoniae1, Staphylococcus aureus2, Pseudomonas aeruginosa3de dahil olmak üzere çeşitli için kullanılan göstermiştir. Ayrıca, bu en iyi duruma getirilmiş deneyleri bakteri Kompleman aracılı bağışıklık hücreleri4 ve antikor tedavileri geliştirmek için daha erişilebilir kılan bir enzim da dahil olmak üzere farklı deneysel tedaviler değerlendirmek için kullanılabilir opsonizasyonla5. Klasik, OPKA tahlil başarıyla temel ve klinik araştırmada kullanılmıştır ayarları korumak için güçlü bir göstergesi olarak indüklenen patojen özel antikorlar6,7,8tarafından,9 .
Bağışıklık hücreleri türleri opsonophagocytic öldürme değerlendirilmesi için kullanılan. Bir sık kullanılan fagositik nüfus HL-60 insan lösemik hücre çizgidir. Bu hücre kültürünü Inaktif promiyelosit kültür olarak tutulabilir; Ancak, onlar farklı ilaç tedavisi10,11ile çeşitli aktif Birleşik Devletleri içine farklı. Tedavisi HL60 n, N-dimethylformamide içine güçlü fagositik aktivite11ile aktif nötrofil hücre ayırır. HL-60 hücreleri optimize edilmiştir ve bu fagositoz deneyleri10için sık sık kullanılır, diğer birincil polimorfonükleer lökosit12deneme bağışıklık kolu olarak kullanılabilir.
Ayrıca, bu deneyleri Basitleştirilmiş13 olabilir veya test edilecek bakterilerin birden çok antibiyotik dirençli suşların bakmak için14 multiplexed. Çoğaltılmış yöntemi daha verimli bir şekilde bakteriyel koloni başına bir agar plaka15oracıkta birimleri (CFUs) oluşturan güvenebilirsiniz yazılım geliştirme yoluyla uygun hale getirilmiştir. Burada, bir bakteriyel zorlanma, HL-60 hücreleri, bebeği tavşan tamamlayıcı ve kan Ağar kaplamalar kullanarak akıcı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemle, birden fazla tedavi hızlı bir şekilde nasıl bakteriyel enfeksiyon doğuştan gelen bağışıklık yanıtı modülasyonlu üzerinde belirli araştırma soruları gidermek tespit edilebilir.

<table><tbody><tr><td>Annexin V (APC konjuge)</td><td>BioLegend</td><td>640919</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD35, insan (PE konjuge)</td><td>BioLegend</td><td>333405</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD71, insan (PE konjuge)</td><td>BioLegend</td><td>kullanılacak</td> bakteri suşu 334105 <td></td></tr><tr><td>(yani, Streptococcus pneumoniae, WU2)</td><td>Bakteriyel Solunum Referans Laboratuvarı (Dr. Moon Nahm)&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>kan agar plakaları</td><td>Hardy Diagnostic</td><td>A10</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Klon serum</td><td>HyClone</td><td>SH30080.03</td><td></td></tr><tr><td>gliserol</td><td>Sigma</td><td>G9012-1L</td><td></td></tr><tr><td>HL-60 hücreleri</td><td>ATCC</td><td>CCL-240</td><td></td></tr><tr><td>IgG İzotip Kontrolü (PE konjuge)</td><td>BioLegend</td><td>400907</td><td></td></tr><tr><td>N,N-dimetilformamid (DMF)</td><td>Fisher </td><td></td> L-glutamin Corning 10-040-CV ile kimyasal UN2265 <td></td></tr><tr><td>propidyum iyodür</td><td>Sigma</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>RPMI ortamı</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Bir anahtar için ev sahibi bakteriyel kolonizasyon bağışıklık yanıtının fagositoz yönüdür. Bir opsonophagocytic öldürme tahlil (OPKA) Fagositlerlerce bakteriyel birimleriyle işbirliği kültürlü olan deneysel bir işlemdir. Bağışıklık hücreleri phagocytose ve bakteri kültürleri bir tamamlayıcı bağlı şekilde öldürmek. İmmün aracılı hücre öldürme verimliliğini bir dizi faktöre bağlıdır ve ne kadar farklı bakteriyel belirlemek için kullanılan kültürler karşılaştırmak direnç hücre ölümü ile ilgili olarak. Bu şekilde, potansiyel bağışıklık tabanlı tedavi etkinliğinin belirli bakteri suşları ve/veya serotipleri karşı tespit edilebilir. Bu protokol için temel kültür koşulları ve tedavi koşulları ve HL-60 bağışıklık hücreleri ile ortak kültür sonra bakteri hücre canlılığı belirlemek için sayma hücre kullanır bir basitleştirilmiş OPKA açıklar. Bu yöntem başarılı bir şekilde birkaç farklı pnömokok serotipleri, kapsül ve acapsular suşları ve diğer bakteriyel türler ile kullanıldığında vardır. (Bu tahlil antikor tedavisi opsonins olarak sınırlı değildir) bu OPKA Protokolü avantajları sadeliği çok yönlülük şunlardır ve zaman ve temel deneysel grupları değerlendirmek için reaktif indirilmesi.

Doğrulama HL-60 farklılaşma OPKA başlamadan önce gerçekleştirilmelidir. Bu hücre dışı ifade CD11b, CD35, CD71 ve annexin V (şekil 1) belirlemek için Akış Sitometresi kullanılarak gerçekleştirilebilir. Propidium iyodür bir canlılık marker olarak da kullanılabilir. DMF ile 3 gün sonra tedavi altına, CD35 ifade artırılmalıdır (tüm hücreleri ≥55%) ve CD71 ifade düşmüştür (tüm hücreleri ≤20%). Annexin V + ve propidium iyodür (PI +) hücreleri birlikte yüzdesi olmalıdır &lt; % 35 yeterli sağlamak i...

Bu opsonophagocytic öldürme tahlil yeteneği yanıt ve farklı tedaviler ve/veya koşullar üzerinde temel bakterileri öldürmek için fagositik bağışıklık hücrelerinin karşılaştırmak için kullanılınır. Klasik, bu tahlil bir bakteri bağlar olarak karşı kaldırdı antikorlar efektör fonksiyonları değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Bu test, bakteriyel yapı ve fonksiyonun modülasyonunu bağışıklık hücresi bazlı antibakteriyel aktiviteye bağlar. Bu nedenle, potansiyel bir tedavinin önemli bir immünoterapötik geliştirilmiş bakteriyel açıklık olasılığını belirlemede değerlendirilebilir. Opsonofagositik öldürme sadratiği geleneksel olarak bakteriye karşı yükseltilen antikorların obsonant olarak etkili işlevlerini değerlendirmek için altın standart olarak hizmet vermektedir.Bu protokol, mevcut yüksek iş artışı standart testlerinde basitlik ve çok yönlülük sunar. Bu protokolde, bir ilaç tedavisinin streptokok pnömonisi üzerindeki etkilerini ve bu etkilerin bakterinin geliştirilmiş fagositozuna nasıl dönüştüğünü araştırıyoruz. Burada, OPKA'yı streptokok pnömoni hücrelerine uyguluyoruz.Ancak bu protokol, diğer patojenlerin bağışıklık hücreleri tarafından fagositik olarak öldürülmesini değerlendirmek için kabul edilebilir. Bakteri stoklarını optimize etmek ve son CPU'ların sayılması için zaman ayırın optimum aralıkta yer alın. HL60 hücrelerinin canlı ve aktif olmasını sağlamak ve işlevsel olarak aktif hücreleri sağlamak için farklı kültür koşulları denemek için akış sitometrisini kullanmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz.Görsel gösteri, numunenin nasıl kaplanacak ve sayılabilir örneklerin nasıl elde edilebildiğini daha iyi anlama sağlayacaktır. Başlamak için, L-glutamin ve 15 mililitre ısı inaktive fetal sığır serumu ile desteklenen 500 mililitre RPMI oluşan HL60 hücre kültürü medya hazırlamak. HL60 hücrelerinin yayılması ve bakımı için, 75 santimetre kare lik hl60 hücre kültürü medyasının 10 mililitresinde beş milyon hücre, 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit leğenli şişeleri boşaltTı.HL60 hücrelerinin çalışma stokları oluşturmak için, HL60 kültür medya% 10 dimetil sülfoksit ile desteklenen bir mililitre kriyojenik tüpler içine mililitre başına yaklaşık bir milyon hücre ekleyin. HL60 hücrelerini ayırt etmek için, kültür 1.5 kat 10 HL60 hücre kültürü medya 15 mililitre yedi hücreye steril filtre% 0.6 DMF ile desteklenmiş 75 santimetre kare şişeleri 37 santigrat derece ve 5% karbondioksit üç gün önce OPKA için. Bakteriyel stok örnekleri hazırlamak için, 37 santigrat derece yaklaşık 2-4 saat boyunca uygun bir et suyu WU2 bakteri suş büyümek.Daha sonra, iki dakika için altı bin kez G santrifüj ile bakteri pelet ve uygun suyu% 15 gliserol 10 ila 30 mililitre hücreleri askıya. Aliquot steril içine bakteri kültürü 1.5 mililitre santrifüj tüpler ve saklamak 80 santigrat derece. Sonra, 37 derece santigrat su banyosunda bir şişe bakteri stoku eritin.Pellet bakteri hücreleri ve steril koşullar altında OBB 500 mikrolitre resuspend. Kan agar plakaları üzerinde tedavi edilmemiş bakteri stokunun plaka seyreltmeleri ve kültür tabakları bir gecede 30 santigrat derece. Kuluçka adımından sonra, hl60 hücreleri ile birlikte kültüre işlenmemiş bakteriyel stok her seyreltme için koloniler saymak.Bu bakteri stoğu ile gelecekteki OPK'lar için en uygun sayıda bakteri nin seyreltilmesinin en uygun sayıda kisiye verim verdiğini kaydedin. Bir tüp bakteri stokunu erit. Pelet bakterileri iki dakika boyunca altı bin kez G'de bulunur ve obb'deki hücre peletini bir önceki adımda elde edilen optimum seyreltmede yeniden askıya alın.Pipet yuvarlak bir alt 96 iyi hücre kültürü plaka iyi başına resuspended bakteriyel seyreltme 10 mikrolitre. Daha sonra, her deneysel kuyuya uygun bir antikor veya ilaç tedavisinin 20 mikrolitresini ekleyin. Kontrol kuyuları için, tedavi kuyuları için kullanılan tamponbağlı olarak 1XPBS veya OBB kullanın.Bir saat boyunca oda sıcaklığında yaklaşık 90 rpm örnek plaka sallayın. Üç gün önce DMF ile tedavi edilen HL60 farklılaştırılmış hücreleri hasat etmek için hücreleri 500 kez G'de üç dakika peletleyin. Supernatant atın ve 1XPBS en az 10 mililitre ile pelet yıkayın.Yıkanmış hücreleri 3 dakika boyunca 500 kez G'de peletleyin. Supernatant atın ve OBB hücreleri yeniden askıya. Steril seyreltilmemiş bebek tavşan serumu bir ila beş son cilt ekleyin.Bir saat bakteri kültürü sonra, iki grup için yinelenen kuyular halinde her örnek bölün. Daha sonra, her bir deney seti kuyulara 50 mikrolitre HL60 kompleman karışımı ve sadece bakteri kuyularına 50 mikrolitre OBB ekleyin. Bir saat boyunca 37 santigrat derece 96 kuyu plaka sıkış.Plaka örnekleri için, her numunenin en az 50 mikrolitre lik bir hacme sahip olması için OBB ile her kuyuya 1-5 son hacimde seyreltin. Daha sonra, pipet 50 mikrolitre her numune doğrudan bir bakteri kültürü plaka belirli bir alana, numuneler arasında yeterli boşluk sağlanması. Kapak ve oda sıcaklığında yaklaşık 15 dakika kurulamak için örnekler sağlar.Tabakları ve kültürü bir gecede 30 derecede tersine çevirin. Alternatif olarak, anoksik koşulların bakteri büyümesini etkileyip etkilemediğini veya morfolojiyi kontrol edip etmediğini test etmek için anaerobik kavanozlarda kültür plakaları. Bir gecelik kültürden sonra, belirlenen her örnek alandaki kolonileri sayın ve her kümedeki canlı hücre sayısını ilgili denetimlerle karşılaştırarak verileri çözümlemeye geçin.Bu tekniği ilk kez oluşturmanın en zor yönleri büyük olasılıkla bakteri stokunun başlangıç CPU'larını optimize etmek ve HL60 hücrelerinin etkin bir şekilde farklılaşmasını sağlamak olacaktır. OPKA'ya başlamadan önce HL60 farklılaşması proidium iyodürlü akış sitometrisi kullanılarak uygulanabilirlik belirteci olarak doğrulandı. Üç gün DMF ile tedavi edildikten sonra CD35 ekspresyonu artırıldı ve CD71 ekspresyonu azaltıldı.HL60 tedavi edilen gruplardaki bakteriyel CPU'ların ortalama yüzdeleri, farklı tedavilerin bakteri hücre sağkalımını karşılaştırmak için hl60'a ait olmayan tedavi gruplarına göre kullanılmıştır. Sonuçlar, etkili bir tedavi ile koloni lerin sayısının HL60 ortak kültürü ile HL60 hücreleri arasında farklı olduğunu ve daha verimli fagositon olduğunu göstermiştir. Sonuçlar, bakteriyel seyreltme optimize edilmediğinde veya koloni büyümesinin kaplamadan sonra dikkatle gözlemlenmediğini, kolonilerin aşırı büyümesinin kolonilerin doğru sayımını önleyebileceğini göstermiştir.Bu prosedürü denerken hatırlanması gereken en önemli şey, CUV'ların aşırı büyümesini önlemek için bakteri kuluçkasını dikkatle izlemektir. In vivo tahliller bir konak içinde etkili bakteriyel açıklık asses için kullanılabilir. Bu tahliller OPKA ile gözlenen bağışıklık etkinliğini doğrulamak için kullanılabilir insan veya hayvan modelleri ne dönüştürülebilir.Opsonofazor öldürücü köz, antibakteriyel tedavileri fagostik immün yanıtlara bağlamak için önceki önemli araştırma çalışmalarında büyük etki yaratmıştır. Bakteriyel patojenlerle çalışmak tehlikeli olabilir. Lütfen bu test sırasında her zaman koruyucu kişisel ekipman giyin.

opsonophagocytic-killing-assay-to-assess-immunological-responses

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz reseptörleri sağlayan birden fazla Fc ifade floresan antijen kaplı boncuklar ve monositik hücre hattı kullanan standart bir reseptör kullanımı ve fagositik aktivite tayinleri ve klinik örneklerde antijen-spesifik antikorların fagositik aktivitesini belirlemek için yüksek verimli bir akış sitometrik tahlil mevcut ilgi herhangi bir antijen için tekrarlanabilir moda.

Klinik Antikor Örnekleri fagositik Aktivitesi Belirlenmesi

Kaynak: Nagre, N. ve diğerleri. Alveolar makrofaj fagositoz ve farelerde bakteri temizlemesi. J. Vis. Exp. (2019).Bu video, IgM ve komplement ile opsonize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleri kullanılarak komplement reseptörü aracılı fagositozun değerlendirilmesini ve ardından fare makrofajları tarafından alınmasını göstermektedir. Fagositoz kapsamı, diaminoflorenin hemoglobin-katalize edilmiş oksidasyonuyla oluşan mavi kromojenik ürünün ölçülmesiyle ölçülür.

Opsonize Kırmızı Kan Hücreleri Kullanarak In Vitro Komplement Aracılı Fagositoz Modellenmesi

Kaynak: Seman, B. G., et.al. Gram-negatif bakteriyel sepsisin yenidoğan görüntüleme modeli. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, nötrofillerin ve inflamatuar monositlerin neonatal fare dalaklarından izole edilmesini ve bunların parlak bakteri öldürücü testte uygulanmasını göstermektedir. Mekanik ayrışma, kırmızı kan hücresi lizisi, manyetik boncuk bazlı hücre zenginleştirmesi, bakteriyel kuluçka ve antibiyotik koruma konularını kapsar. Zamanlanmış lüminesans ölçümleri, başlangıçta bakteriyel...

Yenidoğan fare dalak fagositleriyle bakteriyel öldürmenin in vitro değerlendirmesi

Bu video, serumda bulunan antikorların kompleman aracılı bakterisidal aktivitesini değerlendirmek için bir teknik göstermektedir. Bu yaklaşım, izole edilmiş serumu patojenik bakteriler ve eksojen kompleman proteinleri ile birleştirir. İnkübasyondan sonra, bakteriler bir agar plakası üzerinde büyütülür ve üretilen koloniler, serum bakterisidal titresini ölçmek için ölçülür.

Antikorların Kompleman Aracılı Bakterisidal Aktivitesi için Bir Serum Bakterisidal Testi

Bu videoda, akış sitometrisi kullanarak fagositozu takiben insan nötrofillerine karşı virülan ve daha az virülan Staphylococcus aureus suşlarının sitotoksisitesini tespit etmek için bir test gösteriyoruz.

Fagositozu Takiben Nötrofiller Üzerinde Staphylococcus aureus Suşlarının Sitotoksisite Testi

Video, Streptococcus pneumoniae ile insan nötrofillerinin bir ko-kültürü kullanılarak in vitro opsonofagositik bir öldürme testini göstermektedir. Antikorlar ve kompleman proteinleri, bakterilerin opsonizasyonunu kolaylaştırarak nötrofillerin bakterileri tanımasını ve öldürmesini sağlar, başarılı nötrofil opsonofagositik aktivite gösterir.

Bakteriyel Patojenlere Karşı Opsonofagositik Öldürme Aktivitesinin Değerlendirilmesi

Bu video, opsonize bakteriler ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimi incelemek için bir opso-uyum testini göstermektedir. Anti-kapsül antikorları içeren test serumu ile tedavi edilen floresan işaretli bakteriler, makrofajlarla inkübe edilir. Makrofajlar floresan ile boyandıktan sonra, makrofaj yüzeyine yapışan bakteriler görselleştirme için mikroskop altında gözlenir.

Kapsüllenmiş Bakterilerin Anti-Kapsül Antikorları Tarafından Opsonizasyonunu Değerlendirmek için Bir Opso-Uyum Testi

Burada, D. discoideum (amip) ana bilgisayar olarak kullanarak planktonik veya yüzey bağlı bakterilerin virülans ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Virülans bir 1 saat boyunca ölçülür ve öldürme ana bilgisayar floresans mikroskobu ve görüntü analizi ile sayılabilir. Biz bakteri P. aeruginosabu iletişim kuralı'nı göstermek.

Amip kullanarak bir yansıma tabanlı hızlı bakteriyel virülans tahlil

Burada etkinliği ve ana bilgisayar bağışıklık yanıtı aşı vivo içinde değerlendirilmesi için zarif bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı eğitim viral, bakteriyel aşı modelleri veya paraziter patojenler için adapte edilebilir.

Ana bilgisayar-patojen yanıt ve aşı etkinliği farelerde değerlendirilmesi

Burada antikor serum Shigellacidal etkinliğini ölçmek için bir iletişim kuralı mevcut. Serum bakteri ve inkübe, eksojen tamamlayıcı ile karıştırılır ve reaksiyon karışımı Ağar kaplamalar üzerinde kaplama. Canlı bakteri bir otomatik koloni Numaralandırıcı kullanarak ve bakterisidal titresi belirlemek için kullanılan dikkate alınır koloniler oluştururlar.

Bir yüksek-den geçerek Shigella-belirli bakterisidal tahlil

Opsono-bağlılık testi, antikorların aşı geliştirmedeki opsonik fonksiyonlarını değerlendirmek için opsono-fagositik öldürme testine alternatif bir yöntemdir.

Bacillus anthracis ve Diğer Kapsüllenmiş Patojenlere Karşı Aşı Geliştirmede Fonksiyonel Antikorları Değerlendirmek için Opsono-Adherence Tahlili

Öğrenin opsonofagositik öldürme analizini Streptococcus pneumoniae'ye karşı immün yanıt değerlendirmek için. Bu yöntem antikor etkinliğini ve bakteriyel eliminasyonu güvenilir şekilde ölçer.

Opsonophagocytic öldürme tahlil bakteriyel patojenlere karşı immünolojik yanıt değerlendirmek için

Daha fazla video keşfet