Bütün Mount Epifluorescence kullanarak fare embriyogenez sırasında kalp odası gelişimin analizi
17 Nisan 2019
Biz bütün Dağı epifluorescent mikroskobu ventrikül belirli MLC-2v-tdTomato muhabir çakma fareler disseke fare embriyosu üzerinde kullanarak fare kalp geliştirme incelemek için protokolleri mevcut. Bu yöntem her aşamasında emek yoğun histochemical yöntemleri olmadan fare kalp geliştirme sırasında ventrikül oluşumu doğrudan görselleştirmek için bize izin verir.
Bu yöntemi kullanarak doğrudan farz embriyodaha deneysel manipülasyonlar olmadan kalp tüpü oluşumu, döngü ve tam oda oluşumu nu muayene edebilirsiniz. Her ne kadar, biz bir örnek olarak MLC-2v-tdTomato fareler kullanmak, bu basit yöntem yaygın diğer floresan muhabir fare hatları ile kullanılabilir. Bu protokolün en büyük avantajı çok basit olması ve herhangi bir karmaşık teknik veya ekipman gerektirmemesidir.
Normal laboratuar ortamında yapılabilir. Erkek fareler ile kadın çifte sonra, hem MLC-2v-tdTomato 8 ila 10 hafta eski, vajinal fişler için barajlar kontrol edin her sabah. Gebe barajlar lay, farklı günlerde post coitum ötanazi, supine pozisyonda ve sprey karın% 70 etanol ile.
Hem deri hem de karın duvarı nın kesisi ile karın boşluğunu açmak için keskin cerrahi makas ve forseps kullanın. Karın boşluğunun dorsal kısmında ikili rahim boynuzları yerini aldıktan sonra, dikkatle her iki tarafta oviducts üzerinde kesmek için keskin cerrahi makas ve forseps kullanarak tüm rahim ayırın. Buz soğuk PBS ile 10 santimetre petri çanak tüm parçalanmış rahim yerleştirin.
Keskin cerrahi makas ve forceps kullanarak, dikkatle rahim boynuzu boyunca her amniyotik kese ayırın. Her embriyobuz soğuk PBS ile dolu bir 35 milimetrelik kültür plakası içine aktarmak için cımbız kullanın. Keskin cerrahi makas ve forceps kullanarak, amniyotik bir kese açın ve göbek kordonu keserek her embriyo ortaya çıkarmak ve daha sonra embriyolara zarar vermeden mümkün olduğunca ekstra embriyonik dokuları kesmek.
Fiber optik mikroskop aydınlatıcı ile bir diseksiyon mikroskobu altında, embriyonun başını kesip 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın 100 mikrolitre tampon A daha sonra epifloresan görüntüleme sonuçları ile ilişkili genotipleme için. İnce profeler kullanarak embriyonun göğsünü açın. Keskin cerrahi makas ve forceps ile, uzak akciğerler ve vaskülatür kalp kaldırın.
Parçalanmış embriyonik kalbi PBS ile 35 milimetrelik bir kültür plakasına aktarmak için cımbız kullanın. Bir epifloresan diseksiyon mikroskop altında fare embriyonik kalpleri ile plaka yerleştirin. Gelişmekte olan ventriküller sınav karşı karşıya olduğu gibi embriyonik kalpleri konumlandırmak için ince forseps kullanın.
Parlak alan modunda 0,63x hedefi kullanarak odak noktasını ayarlayın. Parlak alan pozlamaları alın ve birden çok görüntü yakalayın. tdTomato ifadesini görselleştirmek için fiber optik mikroskop aydınlatıcısını kapatın ve filtreyi kırmızı floresan için ayarlayın.
Gerekirse görüntünün yeniden netleşmesini ayarlayın, parlaklığı ve kontrastı ayarlayın, kırmızı floresan pozlamalar yapın ve birden çok görüntü yakalayın. Embriyo genotipleme için, tampon A'da daha önce izole edilmiş kafa örneklerini 100 santigrat derecede 30 dakika kaynatın. Santrifüj 11 iki dakika, 360 kez G.Transfer 20 mikrolitre supernatant yeni bir 1.5 mililitretüp içine tampon B ve mix 20 mikrolitre ile.
Bir DNA şablonu olarak karışık supernatant 4,5 mikrolitre kullanın ve 10 mikromolar özgü ileri ve ters astarlar, 2x-premix polimeraz ve reaksiyon tampon 10 mikrolitre her 0,5 mikrolitre ile birleştirmek ve daha sonra 20 mikrolitre toplam hacmine su ekleyin. El yazmasında açıklandığı gibi bir PCR çalıştırın. 100 baz çifti DNA merdiveninde tamamlanan reaksiyonu %1 agarose jelüzerine yükleyin ve 1x TAE tamponunda 140 voltta 25 dakika çalıştırın.
Tamamlanmış jeli uv transilluminator'a yerleştirin ve DNA bantlarını tanımlamak için UV ışığını açın. MLC-2v kalp gelişimi sırasında ventriküler oda belirtimi için erken belirteç olarak kabul edilir. MLC-2v-tdTomato muhabiri knock-in farelerde, E8.0 de lineer kalp tüpü tdTomato nispeten zayıf ifade e8.5 de embriyoların tam monte epiflourescent görüntüleme kullanılarak gösterildiği gibi daha güçlü hale gelir.
Diseksiyonlu kalbin tam montaj epiflourescent görüntüleme seksiyonu kullanılarak fare kalp gelişimi sırasında ventriküler oda oluşumu kolayca belirlenebilir. E10.5'teki fare embriyosu olan bütün bir fare embriyonun kesiştiği kalpte MLC-2v-tdTomato muhabiri nin ifadesi, giriş yolu, çıkış yolu veya gelecekteki atria'da değil, kalbin ventriküler kısmında gösterilmiştir. E12.5'ten E13.5'e kadar, tdTomato muhabiri sadece dört odalı kalbin karıncıklarında ifade edilir.
Benzer ventriküler spesifik ekspresyon deseni E16.5'teki kesitli fare embriyosuna gösterilmiştir. Tüm görüntülemeden sonra, embriyoların genotipliği PCR genotipleme için iki set astar kullanılarak belirlendi ve tdTomato knock-in alel, heterozigot ve yabani tip embriyoları taşıyan homozigot embriyolar doğrulandı. Bu yöntem oldukça basit ve gerçekleştirmek kolaydır.
Kritik adım embriyonik kalpleri incelemektir. Kalp gelişimi sırasında kardiyak anatomi anlamak başarıyla tüm embriyo kalp izole etmek için gereklidir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, MLC-2v-tdTomato raporörlü nakavt MLC'leri üzerinde tam montaj epifloresan mikroskopi kullanarak fare kalp gelişimini incelemek için protokolleri sunar. Yöntem, karmaşık histokimyasal teknikler olmadan ventrikül oluşum aşamalarının doğrudan görselleştirilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Kardiyovasküler Araştırmalar
Arka Plan
- Kalp gelişimi, gelişimsel biyolojideki kritik bir çalışma alanıdır.
- Geleneksel kalp morfolojisi çalışma yöntemleri iş gücü gerektirebilir.
- Floresan raporörlü fareler, kalp yapılarını görselleştirmek için yeni bir yaklaşım sağlar.
- MLC-2v-tdTomato fareleri bu çalışmalar için yararlı bir model görevi görür.
Çalışmanın Amacı
- Kalp gelişimi aşamalarını görselleştirmek için basit bir yöntem sağlamak.
- Gelişimsel çalışmalarda floresan raporörlü farelerin kullanımının faydasını göstermek.
- Karmaşık tekniklere ihtiyaç duymadan araştırmayı kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tam montaj epifloresan mikroskopi.
- MLC-2v-tdTomato raporörlü nakavt MLC'lerinin kullanımı.
- Gelişimin çeşitli aşamalarındaki embriyoların diseksiyonu.
- Normal laboratuvar ortamlarına uygun basit deneysel kurulum.
Ana Sonuçlar
- Kalp tüpü oluşumunun ve döngülenmesinin başarılı görselleştirilmesi.
- Tam boşluk oluşumunun net gözlemlenmesi.
- Yöntemin diğer floresan raporörlü fare çizgileri için uygulanabilir olması.
- Protokolün standart bir laboratuvar ortamında kullanım kolaylığını göstermes.
Sonuçlar
- Sunulan yöntem, kalp gelişimi çalışmasını basitleştirir.
- Araştırmacıların karmaşık prosedürler olmadan kritik aşamaları görselleştirmelerini sağlar.
- Bu yaklaşım, kardiyak morfogenezin anlaşılmasını artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
This protocol enables direct visualization of ventricular chamber formation in mouse embryos using fluorescent reporter lines, supporting early-stage target validation in cardiovascular drug discovery. By simplifying heart morphology assessment without complex histochemistry, it enhances mechanistic de-risking of developmental pathways. The approach provides predictive confidence for evaluating compound effects on cardiac morphogenesis in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of ventricular specification mechanisms using MLC-2v as an early marker for chamber development.
- Operational Value: Supports functional target validation by directly linking genetic reporters to structural heart formation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline ventricular morphology.
- Operational Value: Enables assay standardization through reproducible whole-mount epifluorescent imaging across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system for studying conserved cardiac morphogenesis pathways across vertebrates.
- Operational Value: Facilitates translational biomarker alignment by correlating tdTomato expression with ventricular chamber maturation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling direct assessment of cardiac structural phenotypes following genetic or pharmacological perturbation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of genes or compounds affecting heart tube looping and chamber septation.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence readouts to compare ventricular formation across experimental conditions.
- Analytics: Generates spatial and intensity-based measurements of tdTomato expression to evaluate ventricular specificity.
- Translational Research: Connects early ventricular patterning to preclinical continuity through conserved developmental mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform applicable to multiple fluorescent reporter lines beyond MLC-2v-tdTomato.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in ventricular chamber formation assessment.
- Operational Value: Improves reproducibility through standardized dissection and imaging protocols in regular lab settings.
- Strategic Value: Enhances capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on cardiac structural phenotypes.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying developmental liabilities in lead compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection and cardiac anatomy identification.
- Dependent on epifluorescent microscopy with appropriate filter sets for tdTomato detection.
- Necessitates standardization of embryo staging and heart isolation procedures across users.
- Involves adaptation considerations when applying to different fluorescent reporter lines with varying expression patterns.
- Limited by the need for embryonic tissue access, restricting use to ex vivo developmental studies.
