İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem
16 Aralık 2019
Bu protokol, ekstrektif bir yöntem kullanılarak abdominoplasti ve lipoaspirate örneklerinden mezenkimal kök hücrelerin izole imal etmek için enzimsiz bir yöntem sağlar. Sert enzimlerin veya santrifüj adımlarının olmaması, in vitro çalışmalarda kullanılabilecek veya kliniğe geri transfer edilebilen klinik olarak ilgili kök hücreleri sağlar.
Bu protokol, hücre fenotipini ve davranışını değiştirebilen sert enzimler veya santrifüj adımları kullanmadan ASC'leri izole etmek için basit bir maliyet etkin bir yol sağlar. Sert adımların olmayışı, enzimler ve santrifüj kullanılarak izole edilenhücrelerden daha az manipüle edilmiş hücreler emerek, deneysel gözlemlerin izolasyon yönteminin bir eseri olup olmadığı sorularını en aza indirir. Bu eksplant yöntemi çeşitli hastalıkları tedavi etmek veya yaşam da araştırma uygulamaları göze genişletmek için bir hastaya tanıtılacak klinik ilgili ASCs oluşturabilir.
Kıyma yöntemini kelimelerle tam olarak açıklamak zordur. Görsel gösteri diğer bilim adamlarına da dokuyu parçalamayı öğrenme güçlükleri sunabilir. Benzer eksplant yöntemleri, göbek dokuları gibi mscs diğer popülasyonları izole etmek için kullanılabilir.
Abdominoplasti doku örneklerini kıymak için önce dokuyu steril 100 milimetrelik bir plakanın kapağına aktarın. Sonra yerde doku bir parça tutmak için steril bir iğne kullanın ve bir milimetreden daha az parçalar halinde doku kesmek için steril bir neşter kullanın. Yeni bir tüp ve ters veya tüm katmanların karıştırılmasını sağlamak için örnek beş ila altı kez sallamak doku aktarın.
Sonra, steril bir spatula ile, 100 milimetre vakum gaz plazma tedavi doku kültür plaka doku 2,5 ila beş mililitre aktarın. Taze bir santrifüj tüpüiçine dökerek numunenin hacmini ölçün. Daha sonra, plakaya eşdeğer bir doku kültürü ortamı ekleyin ve düzgünce içeriğini karıştırmak için plakayı döndürün.
Plakanın tabanında yeterli sayıda hücre görülene kadar plakayı %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Yeterli sayıda hücre tabakta veya yedi gün sonra , hangisi daha erken olursa, kalan tüm doku parçalarını çıkarın. Daha sonra, doku kültürü medyasındaki ASC'ler %70 biraraya gelene veya kümeler yoğun hale gelene kadar hücrelerin hangi noktada geçeceğini gösterene kadar kültür.
Plakayı 1X fosfat tamponlu tuzlu suyla hafifçe durulayın. Yapışık hücreleri denemek için, fosfat tamponlu tuzlu aspire, her plaka için% 0.25 EDTA ile takviye tripsin bir mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Trypsin'i devre dışı bırakmak için plakaya az miktarda ortam ekleyin.
Daha sonra hafifçe plakanın üstünden aşağı doğru medya trypsin pipet, plaka herhangi bir zayıf bağlı hücreleri kaybetme. Hücreleri tohumlamak için, önce plakaya ortam ekleyin. Daha sonra, damla gibi hücreleri ekleyin ve daha sonra plaka arasında eşit dağılımı sağlamak için plaka girdap.
Üç pasajdan sonra, sitometri ve farklılaşma tahlilleri akışına devam edin. Üç pasajdan sonra, lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinden izole ASC'lerde enzimatik bir sindirimi takiben izole ASC'lere benzer bir MSC morfolojisi ve fenotip saptandı. Diğer MSC'ler gibi, explant yalıtılmış ASC'ler CD45 için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 için pozitiftir.
Doku kıyma zaman, her parçanın yüzey alanı ascs doku dışına göç için yeterince büyük olmalıdır. Bunlar, çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilen temel kök hücrelerdir. İzole ASC'ler herhangi bir downstream uygulaması için kullanılabilir, in vivo veya in vitro.
Genel Bakış
Bu protokol, abdominal plasti ve lipoaspirat örneklerinden eksplant tekniği kullanılarak adipoz kaynaklı kök hücrelerin (ASKH) izole edilmesine yönelik enzim içermeyen bir yöntemi özetlemektedir. Bu yaklaşım, hücre manipülasyonunu minimize ederek çeşitli uygulamalar için uygun, klinik açıdan anlamlı kök hücrelerin elde edilmesini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Kök Hücre Biyolojisi
- Rejeneratif Tıp
- Hücre İzolasyon Teknikleri
Arka Plan
- ASC'lerin izole edilmesi için kullanılan geleneksel yöntemler genellikle sert enzimler ve santrifüjleme içerir.
- Bu yöntemler hücre fenotipini ve davranışını değiştirebilir.
- Eksplant yöntemi daha nazik bir alternatif sunar.
- Görsel gösterimler, doku kıyma sürecinin anlaşılmasına yardımcı olabilir.
Çalışmanın Amacı
- ASC'leri izole etmek için düşük maliyetli ve basit bir yöntem geliştirmek.
- Sert izolasyon tekniklerinin neden olduğu deneysel gözlemlerdeki artefakt riskini azaltmak.
- Terapötik uygulamalar için klinik olarak ilgili ASC'ler üretmek.
Kullanılan Yöntemler
- Kıyılmış abdominoplasti dokusu, bir doku kültürü plağında kültüre edilir.
- Hücreler, CO2 ortamında 37°C'de inkübe edilir.
- Yeterli hücre büyümesinden sonra, kalan doku parçaları uzaklaştırılır.
- Hücreler pasajlanır ve kök hücre markerları açısından karakterize edilir.
Ana Sonuçlar
- İzole edilen ASC'ler, enzimatik sindirim yoluyla elde edilenlerle benzer morfoloji ve fenotip sergiler.
- Eksplant yöntemiyle izole edilen ASC'ler; CD45 için negatif, CD73, CD90 ve CD105 için ise pozitiftir.
- Bu yöntem, daha az manipüle edilmiş hücreler sağlayarak deneysel güvenilirliği artırır.
- ASC'ler, hem in vivo hem de in vitro olarak çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilir.
Sonuçlar
- Eksplant yöntemi, ASC'lerin izole edilmesi için uygun bir alternatiftir.
- Bu teknik, hücre özelliklerini geleneksel yöntemlere göre daha iyi korur.
- İzole edilen ASC'ler, araştırma ve klinik uygulamalar için geniş bir potansiyele sahiptir.
Sıkça Sorulan Sorular
Endüstriyel Uygulama ve Önemi
Bu enzim içermeyen izolasyon yöntemi, rejeneratif tıbbaki temel bir sorunu çözmektedir: sert enzimatik veya mekanik işlemlerden kaynaklanan artefaktlar oluşturmadan, klinik olarak ilgili mezenkimal kök hücrelerin elde edilmesi. Hücrenin doğal fenotipi ve fonksiyonu korunarak, bu yaklaşım hastalık modelleme ve terapötik tarama gibi sonraki uygulamalarda öngörüsel güveni artırır. Yöntem, biyolojik risk azaltmanın ve hedef doğrulamanın güvenilir, minimal manipülasyona uğramış hücre kaynaklarına bağlı olduğu erken keşif iş akışlarını desteklemektedir.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Çok potansiyellilikleri ve yüzey belirteç profilleri korunmuş adipoz kaynaklı kök hücreler kullanarak terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Enzim kaynaklı fenotipik değişiklikleri ortadan kaldırarak deneysel sonuçlardaki değişkenliği azaltır.
- Öngörücü Değer: Hedef doğrulama analizleri için daha az manipüle edilmiş hücrelerin üretimi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tutarlı mezenkimal fenotipler gerektiren standartlaştırılmış in vitro analizler için uygun adipoz kaynaklı kök hücreler üretir.
- Operasyonel Değer: CD73, CD90 ve CD105 pozitifliğini koruyan eksplant tabanlı genişletme yoluyla analiz hazırlığını kolaylaştırır.
- Ölçeklenebilirlik: Bileşik tarama ve mekanistik çalışmalar için tekrarlanabilir hücre üretimini destekler.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Rejeneratif tıp uygulamalarıyla uyumlu, klinik olarak ilgili bir hücre kaynağı sağlar.
- Preklinik Model: Ksenojenik enzim maruziyeti olmadan, hastalıkla ilgili sistemler için adipoz türevli kök hücrelerin üretilmesine olanak tanır.
- Mekanistik Risklerin Azaltılması: İzolasyon artefaktlarının farklılaşma veya immünomodülatör fonksiyon değerlendirmelerini etkilemesine yönelik endişeleri azaltır.
Hattın ve İş Akışının Entegrasyonu
Bu yöntem, erken dönem kök hücre izolasyonundan preklinik doğrulamaya kadar uzanan keşif sürecine uygun olup, hücre kaynağı bütünlüğünün veri güvenilirliğini ve devam/durdurma kararlarını etkilediği iş akışlarını desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Doğal benzeri morfoloji ve fenotipe sahip adipoz kaynaklı kök hücreler sağlayarak hipotez testlerini destekler.
- Tarama: Mezenkimal stromal hücre özellikleri gerektiren analiz platformları için standartlaştırılmış ve ekspansiyona hazır hücreler sunar.
- Analitik: Kök hücre kimliğini doğrulamak için üç pasajdan sonra akış sitometrisi ve farklılaşma analizlerini mümkün kılar.
- Translasyonel Araştırma: Klinik olarak ilgili hücre özelliklerini koruyarak izolasyonu terapötik potansiyelle ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Farklı projeler genelinde adipoz kaynaklı kök hücre üretimi için yeniden kullanılabilir, enzim içermeyen bir platform oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Kök hücre deneylerinde izolasyon kaynaklı artefaktları minimize ederek öngörüsel güvenilirliği artırır.
- Operasyonel Değer: Pahalı enzimlere veya santrifüjasyona bağımlılık olmadan, maliyet etkin ve basit bir protokol sunar.
- Stratejik Değer: Hücre tabanlı analiz sonuçlarındaki güvenilirliği artırarak "devam/dur" kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Preklinik değerlendirme için güvenilir mezenkimal kök hücreler sağlayarak risk ayarlı ilerlemeyi destekler.
Uygulama Hususları
- Mekanik kıyma ve eksplant kültürü için aseptik teknik ve temel doku kültürü ekipmanı gerektirir.
- Doku hazırlama için skalpel, iğne ve spatula dahil olmak üzere steril aletlere bağımlıdır.
- Optimal hücre büyümesi için 37°C ve %5 CO2 içeren standardize inkübasyon koşullarını gerektirir.
- İlk doku uzaklaştırmasından sonra konfluens veya küme yoğunluğuna dayalı manuel pasajlama içerir.
- İzolasyon sonrası fenotipik onay için akış sitometrisi ve diferansiyasyon analizlerine dayanır.
