İnsan Yağtüretilmiş Mezenkimal Kök HücrelerinIn İzolasyon ve Genişlemesi için Enzimsiz Bir Yöntem

Bu protokol, hücre fenotipini ve davranışını değiştirebilen sert enzimler veya santrifüj adımları kullanmadan ASC'leri izole etmek için basit bir maliyet etkin bir yol sağlar. Sert adımların olmayışı, enzimler ve santrifüj kullanılarak izole edilenhücrelerden daha az manipüle edilmiş hücreler emerek, deneysel gözlemlerin izolasyon yönteminin bir eseri olup olmadığı sorularını en aza indirir. Bu eksplant yöntemi çeşitli hastalıkları tedavi etmek veya yaşam da araştırma uygulamaları göze genişletmek için bir hastaya tanıtılacak klinik ilgili ASCs oluşturabilir.

Kıyma yöntemini kelimelerle tam olarak açıklamak zordur. Görsel gösteri diğer bilim adamlarına da dokuyu parçalamayı öğrenme güçlükleri sunabilir. Benzer eksplant yöntemleri, göbek dokuları gibi mscs diğer popülasyonları izole etmek için kullanılabilir.

Abdominoplasti doku örneklerini kıymak için önce dokuyu steril 100 milimetrelik bir plakanın kapağına aktarın. Sonra yerde doku bir parça tutmak için steril bir iğne kullanın ve bir milimetreden daha az parçalar halinde doku kesmek için steril bir neşter kullanın. Yeni bir tüp ve ters veya tüm katmanların karıştırılmasını sağlamak için örnek beş ila altı kez sallamak doku aktarın.

Sonra, steril bir spatula ile, 100 milimetre vakum gaz plazma tedavi doku kültür plaka doku 2,5 ila beş mililitre aktarın. Taze bir santrifüj tüpüiçine dökerek numunenin hacmini ölçün. Daha sonra, plakaya eşdeğer bir doku kültürü ortamı ekleyin ve düzgünce içeriğini karıştırmak için plakayı döndürün.

Plakanın tabanında yeterli sayıda hücre görülene kadar plakayı %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın. Yeterli sayıda hücre tabakta veya yedi gün sonra , hangisi daha erken olursa, kalan tüm doku parçalarını çıkarın. Daha sonra, doku kültürü medyasındaki ASC'ler %70 biraraya gelene veya kümeler yoğun hale gelene kadar hücrelerin hangi noktada geçeceğini gösterene kadar kültür.

Plakayı 1X fosfat tamponlu tuzlu suyla hafifçe durulayın. Yapışık hücreleri denemek için, fosfat tamponlu tuzlu aspire, her plaka için% 0.25 EDTA ile takviye tripsin bir mililitre ekleyin ve beş dakika boyunca 37 santigrat derece kuluçka. Trypsin'i devre dışı bırakmak için plakaya az miktarda ortam ekleyin.

Daha sonra hafifçe plakanın üstünden aşağı doğru medya trypsin pipet, plaka herhangi bir zayıf bağlı hücreleri kaybetme. Hücreleri tohumlamak için, önce plakaya ortam ekleyin. Daha sonra, damla gibi hücreleri ekleyin ve daha sonra plaka arasında eşit dağılımı sağlamak için plaka girdap.

Üç pasajdan sonra, sitometri ve farklılaşma tahlilleri akışına devam edin. Üç pasajdan sonra, lipoaspirate ve abdominoplasti örneklerinden izole ASC'lerde enzimatik bir sindirimi takiben izole ASC'lere benzer bir MSC morfolojisi ve fenotip saptandı. Diğer MSC'ler gibi, explant yalıtılmış ASC'ler CD45 için negatif ve CD73, CD90 ve CD105 için pozitiftir.

Doku kıyma zaman, her parçanın yüzey alanı ascs doku dışına göç için yeterince büyük olmalıdır. Bunlar, çok çeşitli uygulamalar için kullanılabilen temel kök hücrelerdir. İzole ASC'ler herhangi bir downstream uygulaması için kullanılabilir, in vivo veya in vitro.