Name: Tayvanda Yarasa Popülasyonunun Lyssavirus Gözetimi için Standart Çalışma Prosedürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-08-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 s
Description: Öğrenin, Tayvan'daki yarasa popülasyonlarında Lyssavirus varlığını değerlendirmek için standart laboratuvar prosedürlerini. Bu yöntem, zoonotik hastalık izleme kapasitesini artırır ve halk sağlığı araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Tien-Cheng Li, Yi-Tang Lin, Chia-Jung Tsai ve Ya-Lan Li bu çalışma sırasında yardım için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Hayvan ve Bitki Sağlığı Teftiş ve Karantina Bürosu, Tarım Konseyi, Executive Yuan, Tayvan'dan 107AS-8.7.1-BQ-B2 (1) numaralı hibe ile desteklenmiştir.

1. Lyssavirüsleri kullanırken güvenlik önlemleri
<ol><li>Yarasa numunelerini işleyen tüm laboratuvar çalışanlarının ön pozlama kuduz profilaksisi aldığından emin olun17. İşçilerin kuduz antikor düzeylerini önceden izleyin ve her 6 ayda bir yeniden inceleyin17. Antikor düzeyleri 0.5 IU/mL 17'nin üzerinde olanlariçinkuduz aşısının takibi gereklidir.</li>
	<li>Laboratuvarın bulunduğu ülkenin biyogüvenlik yönetmeliklerine bağlı olarak, aşağıdaki prosedürlerin uygun biyogüvenlik seviyesi laboratuvarlarında (örneğin, Tayvan'daki BSL-2 laboratuvarları ve Avustralya'daki BSL-3 laboratuvarları) ve işçiler şu anda nitelikli ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek18. NOT: Kuduz aşısı, II ve III18gruplarına ait lyssavirüslere karşı çok az koruma sağlar. İşçiler, yarasa19'da çeşitli zoonotik patojenlerin tespit edildiği ve numuneleri uygun biyogüvenlik seviyesi laboratuvar koşullarında uygun kişisel koruyucu ekipmanla ele alması gerektiği konusunda bilgilendirilmelidir.</li>
</ol>2. Örnek toplama
<ol><li>Bulunan zayıf veya hasta yarasalar veya leşler kullanın. NOT: Zayıf veya hasta yarasalar veteriner bakımı veya araştırması için Taipei Yarasa Koruma Derneği'ne teslim edilirken, karkaslar doğrudan Hayvan Sağlığı Araştırma Enstitüsü'ne teslim edilir. Bu gözetleme programında hiçbir sağlıklı yarasa ötenazi yapılmadı.</li>
	<li>Bir yarasa ekolojist morfolojik özellikleri20 ile yarasa türlerini tanımlamak var.</li>
	<li>Lyssavirus pozitif tanısı konulduğunda yarasa türlerinin DNA barkodlamasını yapın, daha önce yayınlanmış prosedürler kullanılarak21.</li>
	<li>Her yarasa leşi (toplama sitesi, türler, klinik işaretler, vb) bir bilgi sayfası gönderin.</li>
</ol>3. Yarasa örneklerinin nekropsisi
<ol><li>Malzemeleri hazırlayın.<ol>
<li>Temiz bir diseksiyon tahtası hazırlayın ve nekropsi için steril bir emici ped yerleştirin.</li>
		<li>Yarasa organları toplamak için toplama tüpleri hazırlayın.</li>
		<li>Nekropsi için tek kullanımlık cımbız ve neşter hazırlayın. Her yarasanın nekropsisi arasında alet değiştirin. Örnekleme sırasında cımbız ve neşterlerin temizlenmesi için %70 etanol ile nemlendirilmiş pamuk topları hazırlayın.</li>
		<li>FAT için iki mikroskop slaytı hazırlayın. Histopatolojik inceleme için taze numuneleri toplayın ve formalin çözeltisinde düzeltin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nekropsi öncesi tüm dış deifeleri inceleyin. Tür farklılaşması için yarasanın dış özelliklerini, özellikle baş, kulakve kanatları fotoğrafla.</li>
	<li>Oral bez örneği toplayın. Yarasayı ventral recumbency'ye tahtaya yerleştirin ve yarasanın kafasını cımbızla düzeltin. Bir neşter ile calvaria orta hattı boyunca deri kesin ve lateral yanlara deri çekin. Bir neşter ile calvaria orta hattı boyunca kafatası kesin ve beyin dokusu ortaya çıkarmak için cımbız ile açın.</li>
	<li>Beyin dokusunu kafatasından çıkarın ve steril bir dil depressörüne yerleştirin ve beyin dokusundan etki smear yapın (bkz. adım 4.2). Taze beyin dokusu küçük bir parça toplamak ve histopatolojik inceleme için formalin düzeltmek. Nükleik asit ekstraksiyonu için bir tüp kalan beyin dokusunu içerir.</li>
	<li>Numune toplama arasında tutulan dokuları temizlemek için %70 etanol ile nemlendirilmiş pamuk toplarla cımbız ve neşter temizleyin.</li>
	<li>Dorsal recumbency tahtaya yarasa yerleştirin ve aksilla ve kuyruk topuk her iki tarafında iğneler ile tahta üzerinde düzeltmek.</li>
	<li>Mandibuladan anüse kadar vücudun orta çizgisi boyunca deri eğim. Asansör ve cımbız ile cilt ve altta yatan kas dokuları ayırın. Mandibular kemiğe yakın tükürük bezleri, toplamak.</li>
	<li>Cımbızla göğüs kafesini hafifçe kaldırın ve orta hat boyunca göğüs kafesini ve karın duvarını neşterle kesin. Köprücük kemiğini neşterle kesin. Göğüs boşluğu açmak için iğneler ile tahtaya sol ve sağ göğüs kafesleri düzeltin.</li>
	<li>İğrenç lezyonları ve ölüm sonrası değişimin derecesini kaydedin.</li>
	<li>Viziyal dokuları (yani, kalp, akciğerler, karaciğer, böbrekler, bağırsak) cımbız ve neşter kullanarak karkas kaldırın. Gelecekteki araştırmalar için gerekli olan visseral örnekleri toplayın. NOT: Yinelenen örneklerin toplanması önerilir. Biri moleküler tanı için toplanmalı, diğeri viral kültür için viral taşıma ortamı olan veya olmayan -80 °C'de dondurulmalıdır22.</li>
</ol>4. Doğrudan floresan antikor testi (FAT)
<ol><li>FAT için beyin dokusunun izlenimini edin. Fat'i daha önce açıklandığı gibi18,23'te aşağıdaki değişikliklerle gerçekleştirin.</li>
	<li>Beyin dokusunu cımbızla bağlı sinir dokusundan yavaşça ayırın ve beyin dokusunu steril bir dil depressörüne aktarın. Beyin sapı ve beyincik18,23dahil olmak üzere beynin kesit, kesin . Beyin dokusunun kesik yüzeyine hafifçe dokunarak beyin dokusunun izlenimini edin ve fazla dokuyu çıkarmak için lens dokusuna kaydırak tuşuna basın.</li>
	<li>30 dk. Test edilmiş slaytları ve pozitif ve negatif kontrolleri eşleçle boyamadan önce -20 °C'de aseton ile düzeltin.</li>
	<li>Lyssavirus antijeni boyama için ticari olarak mevcut iki FITC konjuge anti-kuduz antikorlarının her birinin kullanılması şiddetle tavsiye edilir23. İlk boyama dan önce ticari eşlegate çalışma konsantrasyonu belirleyin. Seyreltilmiş konjugatları 0,45 μM şırınga filtresinden slaytların üzerine bırakın ve kaydırakları 37 °C'de 30 dk boyunca ıslak bir oda içinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Slaytlardan fazla eşleç drenaj ve kuluçka sonrası fosfat tamponlu salin (PBS) ile slaytlar yıkayın.</li>
	<li>Slaytlar üzerinde% 10 gliserol küçük bir miktar bırakın ve kapak slaytlar ile kaplayın.</li>
	<li>Slaytları floresan mikroskopla inceleyin.</li>
</ol>5. Nükleik asit ekstraksiyonu
<ol><li>Beyin dokusuna (%10 w/v) MEM-10'un uygun hacmini (%10 fetal sığır serumu ile desteklenen minimum esansiyel ortam) ekleyin.</li>
	<li>10 dk için 825 x g bir homogenizer alet ve santrifüj 5 mm çelik boncuk ile beyin dokusu homojenate.</li>
	<li>Son hacmi 50°L olan nükleik asidi, aletle ticari olarak kullanılabilen toplam nükleik asit çıkarma kitini kullanarak süpernatantın 200°L'sinde ayıklayın.</li>
</ol>6. RT-PCR ve filogenetik analiz
NOT: Bilinen tüm lyssaviruses veya belirli lyssaviruses tespit etmek için çeşitli astar setleri yayınlanmıştır. Burada açıklanan protokol, laboratuvarımızın kullandığı ve tüm deneysel ihtiyaçlar için uygun olmadığı bir örnektir. Laboratuvar ihtiyaçlarına göre uygun astarları seçin.
<ol><li>Tek adımlı RT-PCR reaktifini aşağıdaki gibi hazırlayın: 2,5 μL 10x reaksiyon arabelleği, 0,5 μL ileri ve ters astar (her biri 10 μM), 4 μL 1,25 mM dNTP, 0,3 μL RNase inhibitörü (40 U/μL) içeren reaksiyon karışımına 5 μL çıkarılmış nükleik asit ekleyin , 0.3 μL ters transkriptaz (10 U/μL), 0.4 μL DNA polimeraz (5 U/μL) ve 11.5 μL DEPC ile işlenmiş su. NOT: Bu protokolde kullanılan astar seti JW12 (5'-ATGTAACACCYCTACAATG-3') ve N165-146 (5'-GCAGGGTAYTTRTACTCATA-3')24' dir. Reaktiflerin ve bisiklet koşullarının hazırlanmasını kullanılan astar setlerine göre değiştirin.</li>
	<li>Aşağıdaki koşullar altında bisiklet gerçekleştirin: 42 °C'de 40 dk için kuluçka; 10 dakika boyunca 94 °C'de ilk denatürasyon; 30 s için 94 °C, 30 s için 55 °C ve 30 s için 72 °C 35 döngüleri; ve son olarak, 10 dakika için 72 °C daha fazla uzatma.</li>
	<li>Tanısal duyarlılığı artırmak için başka veya daha fazla astar kümeleri kullanın.<ol>
<li>N113F (5'-GTAGGATGCTATATGGG-3') ve N304R (5'-TTGACGAAGATCTTGCTCAT-3') 25,26'yı tek adımlı RT-PCR reaktifini aşağıdaki gibi hazırlamak için kullanın: 5 μL 10x tampon, 5 μL içeren bir reaksiyon karışımına 5 μL çıkarılan çekirdekasit ibaresini ekleyin ileri ve geri astarlar (her biri 4 μM), 5 μL 1,25 mM dNTP, 0,5 μL RNase inhibitörü (40 U/μL), 0,2 μL ters transkriptaz (10 U/μL), 1 μL DNA polimeraz (5 U/μL) ve 23,3 μL DEPC ile tedavi edilen su.</li>
		<li>Aşağıdaki koşullar altında bisiklet gerçekleştirin: 42 °C'de 40 dk için kuluçka; 5 dk için 95 °C'de ilk denatürasyon; 1 dk için 95 °C' nin 35, 1 dk ve 20 s'lik 55°C ve 1 dk için 72 °C; ve son olarak, 10 dakika için 72 °C daha fazla uzatma. NOT: Laboratuvar ihtiyaçlarına bağlı olarak, tanı için uygun astarları seçin. N113F başlangıçta kuduz virüsü amplifikasyon için tasarlanmıştır, ancak diğer lyssaviruses için iyi çalışmayabilir. N113F ve N304R seti kuduz virüsü (Tayvan gelincik porsuğu varyantı) ve Tayvan yarasa lyssavirus için iyi çalışır. Lyssavirus yukarıdaki iki astar kümesinin her ikisi tarafından da yükseltilirse, JW12 ve N304R astarsetini kullanarak tüm nükleoprotein dizilerini elde etmek daha kolay olacaktır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR ürününü %2 agarose jel elektroforez üzerinde analiz edin ve UV ışık aydınlatması ile görselleştirin.</li>
	<li>PCR ürünlerini ticari sıralama hizmetine göre sırala.</li>
	<li>Sırayı Nucleottide Basic Local Hizalama Arama Aracı'nın (BLAST) web sayfasına girin veya yükleyin. "Diğerleri (nr vb)" veritabanını seçin ve organizmayı Lyssavirusolarak girin. MegaBlast algoritmasını seçin ve BLAST'ı çalıştırın.</li>
</ol>7. Virüs yalıtımı
NOT: 1) FAT veya 2) RT-PCR pozitifliği gösterdiğinde virüs yalıtımı yapın.
<ol><li>MEM-10'da beyin örneğini %10 (w/v) süspansiyonda homojenize edin. 10 dk için 825 x g santrifüj.</li>
	<li>3 x 106 MNA (fare nöroblastomu) hücrelerinin 1 mL'si MEM-10'da %1 CO2ile 37 °C'de 200 μL süpernatant inoküle edin. Beyni homojen hücre süspansiyonuna 25 cm 2'lik bir şişeye aktarın ve 6 mL MEM-10 ekleyin.</li>
	<li>Aynı anda 6 mm çapında 4 kuyute Teflon kaplı cam kaydırakta beyin homojen hücre süspansiyonunun 1 mL'sini yetiştirin.</li>
	<li>37 °C'de %1 CO2ile 3-4 günlük kuluçkadan sonra, 4 kuyudaki hücreleri %100 aseton (v/v) ile düzeltin.</li>
	<li>4.4-4.7 adımlarını takiben slaytları iki FITC konjuge anti-kuduz antikoruile lekelendirin. İntrasitoplazmik inklüzmler incelendiğinde hücreler enfekte olur. Enfekte hücrelerin yüzdesini kaydedin.</li>
	<li>Slaytlar negatif olarak boyandığında aşılanmış hücre kültürünün tripsinizasyonunu ve alt kültürünü gerçekleştirin:<ol>
<li>Orta çıkarın ve 5 mL PBS ile şişeyi durula.</li>
		<li>Şişeye 1 mL tripsin ekleyin ve şişenin dibine sıkıca vurun.</li>
		<li>6 mL MEM-10 ekleyin ve hücreleri yeniden askıya alın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonuna yeni bir doku şişesine (6 mL) ve 4 kuyu slaytına (1 mL) koyun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>%100 enfekte olana kadar 7.4-7.6 adımlarını tekrarlayın.</li>
	<li>Kuluçka 24 saat sonra supernatant toplamak.</li>
</ol>

<ol><li>Kuzmin, I. V. Basic facts about lyssavirus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuzmin%2C+IV+%22Current+laboratory+techniques+in+rabies+diagnosis%2C+research%2C+and+prevention%2C+volume+1%22">Current laboratory techniques in rabies diagnosis, research, and prevention, volume 1</a>. Rupprecht, C. E., Nagarajan, T. , Elsevier. California. 3-21 (2014).</li>
<li>Aréchiga Ceballos, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+lyssavirus+in+bat%2C+Spain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Novel lyssavirus in bat, Spain.</a> Emerging Infectious Diseases. 19 (5), 793-795 (2013).</li>
<li>Gunawardena, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Indian+Flying+Foxes%2C+Sri+Lanka%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Indian Flying Foxes, Sri Lanka.</a> Emerging Infectious Diseases. 22 (8), 1456-1459 (2016).</li>
<li>Hu, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+in+Japanese+Pipistrelle%2C+Taiwan%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus in Japanese Pipistrelle, Taiwan.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), 782-785 (2018).</li>
<li>Nokireki, T., Tammiranta, N., Kokkonen, U. -M., Kantala, T., Gadd, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tentative+novel+lyssavirus+in+a+bat+in+Finland%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+Emerging+Diseases%22%5BJournal%5D)">Tentative novel lyssavirus in a bat in Finland.</a> Transboundary Emerging Diseases. 65 (3), 593-596 (2018).</li>
<li>Banyard, A. C., Evans, J. S., Luo, T. R., Fooks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssaviruses+and+bats%3A+emergence+and+zoonotic+threat%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Lyssaviruses and bats: emergence and zoonotic threat.</a> Viruses. 6 (8), 2974-2990 (2014).</li>
<li>Pal, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+infection+of+a+flying+fox+bat%2C+Pteropus+policephalus+in+Chandigarh%2C+Northern+India%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+and+Geographical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rabies virus infection of a flying fox bat, Pteropus policephalus in Chandigarh, Northern India.</a> Tropical and Geographical Medicine. 32 (3), 265-267 (1980).</li>
<li>Smith, P. C., Lawhaswasdi, K., Vick, W. E., Stanton, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+rabies+virus+from+fruit+bats+in+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Isolation of rabies virus from fruit bats in Thailand.</a> Nature. 216 (5113), 384(1967).</li>
<li>Tang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pivotal+role+of+dogs+in+rabies+transmission%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Pivotal role of dogs in rabies transmission, China.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (12), 1970-1972 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses+%28Aravan+and+Khujand%29+from+Central+Asia%3A+phylogenetic+relationships+according+to+N%2C+P+and+G+gene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses (Aravan and Khujand) from Central Asia: phylogenetic relationships according to N, P and G gene sequences.</a> Virus Research. 97 (2), 65-79 (2003).</li>
<li>Arguin, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+Lyssavirus+infections+among+bats%2C+the+Philippines%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of Lyssavirus infections among bats, the Philippines.</a> Emerging Infectious Diseases. 8 (3), 258-262 (2002).</li>
<li>Lumlertdacha, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survey+for+bat+lyssaviruses%2C+Thailand%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Survey for bat lyssaviruses, Thailand.</a> Emerging Infectious Diseases. 11 (2), 232-236 (2005).</li>
<li>Kuzmin, I. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyssavirus+surveillance+in+bats%2C+Bangladesh%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Lyssavirus surveillance in bats, Bangladesh.</a> Emerging Infectious Diseases. 12 (3), 486-488 (2006).</li>
<li>Reynes, J. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+evidence+of+lyssavirus+infection+in+bats%2C+Cambodia%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Serologic evidence of lyssavirus infection in bats, Cambodia.</a> Emerging Infectious Diseases. 10 (12), 2231-2234 (2004).</li>
<li>Nguyen, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bat+lyssaviruses%2C+northern+Vietnam%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bat lyssaviruses, northern Vietnam.</a> Emerging Infectious Diseases. 20 (1), 161-163 (2014).</li>
<li>Liu, Y., Zhang, S., Zhao, J., Zhang, F., Hu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Irkut+virus+from+a+Murina+leucogaster+bat+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Isolation of Irkut virus from a Murina leucogaster bat in China.</a> PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (3), 2097(2013).</li>
<li>Kaplan, M. M. Safety precautions in handling rabies virus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaplan%2C+MM+%22Laboratory+Techniques+in+Rabies%2C+4th+Ed%22">Laboratory Techniques in Rabies, 4th Ed</a>. Meslin, F. X., Kaplan, M. M., Kiprowski, H. , World Health Organization. Geneva. 3-8 (1996).</li>
<li>World Organization for Animal Health (OIE). Rabies (infection with rabies and other lyssavirus. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf">http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health_standards/tahm/3.01.17_RABIES.pdf</a> (2019).</li>
<li>Smith, I., Wang, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bats+and+their+virome%3A+an+important+source+of+emerging+viruses+capable+of+infecting+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Bats and their virome: an important source of emerging viruses capable of infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 3 (1), 84-91 (2013).</li>
<li>Corbet, G. B., Hill, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCorbet%2C+GB+%22The+mammals+of+the+Indomalayan+region%3A+a+systematic+review%22">The mammals of the Indomalayan region: a systematic review</a>. , Oxford University Press. Oxford, New York. (1992).</li>
<li>Mayer, F., von Helversen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryptic+diversity+in+European+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cryptic diversity in European bats.</a> Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 268 (1478), 1825-1832 (2001).</li>
<li>Epstein, J. H., Field, H. E. Anthropogenic epidemics: the ecology of bat-borne viruses and our role in their emergence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEpstein%2C+JH+%22Bats+and+viruses%3A+a+new+frontier+of+emerging+infectious+diseases%22">Bats and viruses: a new frontier of emerging infectious diseases</a>. Wang, L. F., Cowled, C. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, New Jersey. 249-280 (2016).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. Protocol for postmortem diagnosis of rabies in animals by direct fluorescent antibody testing. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf">https://www.cdc.gov/rabies/pdf/rabiesdfaspv2.pdf</a> (2019).</li>
<li>Hayman, D. T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+real-time+assay+for+the+detection+of+Lyssaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">A universal real-time assay for the detection of Lyssaviruses.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 87-93 (2011).</li>
<li>Franka, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+phylogenetic+lineage+of+rabies+virus+associated+with+western+pipistrelle+bats+%28Pipistrellus+hesperus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">A new phylogenetic lineage of rabies virus associated with western pipistrelle bats (Pipistrellus hesperus).</a> Journal of General Virology. 87 (8), 2309-2321 (2006).</li>
<li>Trimarchi, C. V., Smith, J. S. Diagnostic evaluation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTrimarchi%2C+CV+%22Rabies%2C+1st+ed%22">Rabies, 1st ed</a>. Press, A., Jackson, A. C., Wunner, W. H. , Academic Press. San Diego, CA. 307-349 (2002).</li>
<li>Moldal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+detection+of+European+bat+lyssavirus+type+2+%28EBLV-2%29+in+Norway%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Veterinary+Research%22%5BJournal%5D)">First detection of European bat lyssavirus type 2 (EBLV-2) in Norway.</a> BMC Veterinary Research. 13, 216(2017).</li>
<li>Robardet, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assay+of+fluorescent+antibody+test+results+among+twelve+European+National+Reference+Laboratories+using+various+anti-rabies+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparative assay of fluorescent antibody test results among twelve European National Reference Laboratories using various anti-rabies conjugates.</a> Journal of Virological Methods. 191 (1), 88-94 (2013).</li>
<li>Hanlon, C. A., Nadin-Davis, S. A. Laboratory diagnosis of rabies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHanlon%2C+CA+%22Rabies%2C+3rd+ed%22">Rabies, 3rd ed</a>. Jackson, A. C. , Academic Press. San Diego, CA. 409-459 (2013).</li>
<li>Fischer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+step+forward+in+molecular+diagnostics+of+lyssaviruses--results+of+a+ring+trial+among+European+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A step forward in molecular diagnostics of lyssaviruses--results of a ring trial among European laboratories.</a> PLoS ONE. 8 (3), 58372(2013).</li>
<li>David, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabies+virus+detection+by+RT-PCR+in+decomposed+naturally+infected+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rabies virus detection by RT-PCR in decomposed naturally infected brains.</a> Veterinary Microbiology. 87 (2), 111-118 (2002).</li>
<li>Robardet, E., Picard-Meyer, E., Andrieu, S., Servat, A., Cliquet, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+interlaboratory+trials+on+rabies+diagnosis%3A+an+overview+of+results+and+variation+in+reference+diagnosis+techniques+%28fluorescent+antibody+test%2C+rabies+tissue+culture+infection+test%2C+mouse+inoculation+test%29+and+molecular+biology+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">International interlaboratory trials on rabies diagnosis: an overview of results and variation in reference diagnosis techniques (fluorescent antibody test, rabies tissue culture infection test, mouse inoculation test) and molecular biology techniques.</a> Journal of Virological Methods. 177 (1), 15-25 (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Bu laboratuvar standart işletim prosedürü (SOP) Tayvan lyssavirus antijenlerin varlığı için yarasa örnekleri test etmek için bir seri süreç sağlar. Önemli adımlar arasında FAT ve RT-PCR istihdamı yer alıyor. Uygun örneklerin seçilmesi ve virüsün başarılı bir şekilde izole edilmesi de önemlidir. Ayrıca, yarasa lyssaviruses izlenmesi sırasında bazı sorun giderme yapılmıştır. En büyük fark hedef hayvanlardı. Başlangıçta (2008-2009), yarasa lyssavirus gözetim hedef hayvanlar tayvan Kinmen Adası'nda sıkışıp sonra ötanazi sonr...

Lyssavirus cinsinden virüsler zoonotik patojenlerdir. İnsan vakaları ile ilişkili en az yedi lyssavirus türü vardır1. Bu cins116 türek olarak,2,3, Tayvan yarasa lyssavirus (TWBLV)4 ve Kotalahti yarasa lyssavirus5 son zamanlarda yarasatespit edilmiştir, ancak taksonomik durumları henüz belirlenmelidir.
Yarasalar en lyssaviruses doğal konaklar, Mokola lyssavirus ve Ikoma lyssavirus hariç, henüz herhangi bir yarasa tespit edilmemiştir1,2,3,6. Asya yarasalarında lyssaviruses hakkında bilgi hala sınırlıdır. Asya yarasalar iki tanımsız lyssaviruses (Hindistan ve Taylanddiğer) 7,8 bildirilmiştir. Çin'de bir yarasa ısırığı ile ilişkili bir insan kuduz durumda 2002 yılında bildirilmiştir, ancak tanı sadece klinik gözlem9ile konulmuştu . Orta Asya'da, Aravan lyssavirus 1991 yılında Kırgızistan'da fare kulaklı yarasa(Myotis blythi)ve Khujand lyssavirus 2001 yılında Tacikistan'daki bıyıklıyarasada(Myotis mystacinus)tespit edilmiştir. Güney Asya'da, Gannoruwa yarasa lyssavirus Hint uçan tilki tespit edildi(Pteropus medius) Sri Lanka'da 20153. Güneydoğu Asya'da, Filipinler yarasalar üzerinde çeşitli serolojik çalışmalar, Tayland, Bangladeş, Kamboçya, ve Vietnam değişken seroprevalans11gösterdi,12,13,14, 15. yıl. Irkut lyssavirus jilin eyaleti, Çin 201216yılında büyük tüp burunlu yarasa(Murina leucogaster)tespit edilmiş olmasına rağmen, Doğu Asya yarasa popülasyonlarında lyssaviruses tam türleri ve yerleri bilinmemektedir.
Tayvanyarasa popülasyonlarında lyssavirus varlığını değerlendirmek için, hem doğrudan FAT hem de RT-PCR kullanan bir gözetim programı başlatıldı. Tayvan yarasa lyssavirus 2016-2017 yılında Japon pipistrelle(Pipistrellus abramus)4 iki olgutespit edilmiştir. Bu makalede, Tayvan yarasa nüfusunun lyssavirus gözetim için bir laboratuvar standart işletim prosedürü tanıtıldı. Laboratuvarımızda yarasa lyssavirus tanısının akış şeması Şekil1'de vettir.

<table><tbody><tr><td>% 2.5 Tripsin (10x)</td> <td>Gibco</td><td>15090046</td><td>Tripsin</td></tr><tr><td>25 cm <2 / sup> şişesi</td><td>Greiner bio-one</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Honeywell</td><td>32201-1L</td><td></td></tr><tr><td>Agaroz I</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>97062-250</td><td></td></tr><tr><td>Alkol</td><td>NIHON SHIYAKU REAKTIFI</td><td>NS-32294</td><td></td></tr><tr><td>AMV Ters Transkriptaz</td><td>Promega</td><td>M5101</td><td></td></tr><tr><td>Antibiyotik-Antimikotik(100X)&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>MEM-10 Bıçaklı</td></tr><tr><td></td><td>Braun</td><td>BA215</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Kemilümineans sistemi</td><td>TOP BIO CO.</td><td>MGIS-21-C2-1M Toplama</td><td></td></tr><tr><td>tüpü</td><td>Qiagen</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Toplama tüpü</td><td>SSI</td><td>2341-SO</td><td></td></tr><tr><td>Kapak sürgüsü</td><td>Muto Pure chemical Co., LTD.</td><td>24505</td><td></td></tr><tr><td>DNA analizörü</td><td>Applied Biosystems</td><td>3700XL</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>FITC Anti-Kuduz Monoklonal Globulin</td><td>Fujirebio Teşhis A.Ş.</td><td>800-092</td><td>FITC konjuge anti-kuduz antikorları: reaktif B</td></tr><tr><td>Dört kuyulu Teflon kaplama cam slayt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>30-86H-WHITE</td><td></td></tr><tr><td>Jel Elektroforez Sistemi</td><td>Ana Bilim</td><td>MJ-105-R</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (1x)</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Tripsin</td></tr><tr><td>İnkübatörü</td><td>ASTEC</td><td>SCA-165DS</td><td></td></tr><tr><td>Ters Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>HAFİF TEŞHİS Kuduz YAĞ reaktifi</td><td>EMD Millipore Corporation</td><td>5100</td><td>FITC-konjuge anti-kuduz antikorları: reaktif A</td></tr><tr><td>MagNA Saf Kompakt Alet</td><td>Roche</td><td>03731146001</td><td></td></tr><tr><td>MagNA Saf Kompakt NA İzolasyon Kiti 1</td><td>Roche</td><td>03730964001</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10x)</td><td>Gibco</td><td>11430030</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM NEAA (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>MEM vitamin çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>11120052</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck</td><td>1.06329.0500</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>İğne</td><td>Terumo</td><td>NN*2332R9</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Medicago</td><td>09-8912-100</td><td></td></tr><tr><td>Astar sentezi</td><td>Misyon Biyoteknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNasin ribonükleaz inhibitörü</td><td>Promega</td><td>N2111</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama hizmeti</td><td>Misyon Biyoteknoloji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Slayt</td><td>Termo Bilimsel</td><td>AA00008032E00MNT10</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>MEM-10</td></tr><tr><td>Paslanmaz Çelik</td><td>Boncuk QIAGEN</td><td>69989</td><td></td></tr><tr><td>Steril emici ped</td><td>3M</td><td>1604T-2</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Nalgene</td><td>171-0045</td><td></td></tr><tr><td>Taq polimeraz</td><td>JMR Holdings</td><td>JMR-801</td><td></td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>2720</td><td></td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>QIAGEN</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Dil bastırıcı</td><td>HONJER CO., LTD.</td><td></td><td></td>122246</tr><tr><td>Cımbız</td><td>Tennyson tıbbi alet geliştirme CO., LTD.</td><td>A0601</td><td></td></tr><tr><td>Tylosin Tartarat</td><td>Sigma</td><td>T6271-10G</td><td>MEM-10</td></tr></tbody></table>

tayvan'da yarasa popülasyonunun lyssavirus gözetimi için standart Çalışma prosedürü

Standard Operating Procedure for Lyssavirus Surveillance of the Bat Population in Taiwan

Lyssavirus cinsinden virüsler zoonotik patojenlerdir ve en az yedi lyssavirüs türü insan vakalarıile ilişkilidir. Yarasalar çoğu lyssaviruses doğal rezervuarlar olduğundan, yarasaların bir lyssavirus izleme programı yarasalar bu virüslerin ekolojianlamak için 2008 yılından bu yana Tayvan'da yürütülmektedir. Bu programda, sivil toplum yarasa koruma örgütleri ve yerel hayvan hastalığı kontrol merkezleri ölü yarasalar veya yarasalar zayıflık veya hastalık tan ölen toplamak için işbirliği yaptı. Yarasaların beyin dokuları nekropsi yoluyla elde edildi ve lyssavirus antijenleri ve nükleik asitlerin saptanması için doğrudan floresan antikor testi (FAT) ve ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonuna (RT-PCR) tabi tutuldu. FAT için en az iki farklı kuduz tanı konjugatları önerilir. RT-PCR için lyssavirus nükleoprotein geninin kısmi dizisini yükseltmek için iki set astar (JW12/N165-146, N113F/N304R) kullanılır. Bu gözetim programı yarasalarda lyssaviruses ve diğer zoonotik ajanları izler. Tayvan yarasa lyssavirus 2016-2017 yılında Japon pipistrelle(Pipistrellus abramus)iki olguda bulunmuştur. Bu bulgular halk, sağlık profesyonelleri ve yarasalar ve diğer yaban hayatı temas potansiyel riskleri bilim adamları bilgilendirmek gerekir.

2014-Mayıs 2017 tarihleri arasında 13 türden 332 yarasa leşi gözetim altında toplandı. İki test pozitif çıktı. İlk yarasa durumunda, beyin izlenimi, ticari FITC konjuge anti-kuduz antikorlarından biriyleFAT kullanılarak negatif test edildi (Şekil 2), iki astar kümesinin her birini kullanan RT-PCR'ler (JW12/N165-146, N113F/N304R) olumlu sonuçlar (Şekil 3). 428 bp amplicon dizisi (N113F/N304R ile güçlendirilmiş ve kısmi nükleoprotein geni içeren) elde edildi. Dizi...

Bu protokol Tayvan yarasalar lyssavirus antijenlerin tanısal test için standart bir laboratuvar işletim prosedürü tanıttı.

Tayvan'da Yarasa Popülasyonunun Lyssavirus Gözetimi için Standart Çalışma Prosedürü

Viruses within the genus Lyssavirus are zoonotic pathogens, and at least seven lyssavirus species are associated with human cases. Because bats are ...

Lyssavirus bir hayvanat bahçesi-no-tik patojenler olduğunu. Tayvanyarasa popülasyonlarında Lyssavirus varlığını değerlendirmek için bir gözetleme programı başlattık. Ve 2016'dan 2018'e kadar dört Lyssavirüs tespit etti.Bu protokol Tayvan'da vi-al Lyssavirus gözetim için adım adım giriştir. Biz vi-al Lyssavirus gözetim ilgilenen araştırmalar için yararlı olacağını umuyoruz. Doğru tac-fıçı sembolübağlamak önemlidir.Ölü ya da ölmekte olan bir yarasa, Lyssavirus gözetimi için canlı bir yarasadan daha uygundur. Laboratuvarın bulunduğu ülkenin biyo-güvenlik yönetmeliklerine bağlı olarak aşağıdaki işlemleri uygun bir biyo-güvenlik düzeyinde laboratuvarda gerçekleştirin. Ve araştırmacılar şu anda nitelikli olduğundan emin olun ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.Zayıf veya hasta yarasalar veya leşlerin toplanması üzerine, bir yarasa ekolojisti numunenin morfolojik özelliklerine göre yarasa türlerini tanımlar. Her yarasa numunesi ile toplama alanı, türler, klinik işaretler ve diğer ilgili verileri içeren bir bilgi sayfasını laboratuvara gönderin. Nekoskopiye başlamadan önce, tüm dış delikleri inceleyin ve yarasaların dış özelliklerinin fotoğrafını, özellikle tür farklılaşması için baş,

standard-operating-procedure-for-lyssavirus-surveillance-bat

Research

JoVE Journal

Environment

Çevre

Burada, Abdovirüs çoğaltma ve Abdovirüs çoğaltma kısıtlamak 2) ökaryotik ana faktörler teşvik 1) virüs kodlanmış immunomodulators tanımlamak için protokolleri mevcut. Floresan ve ışıldama dayalı yöntemlerin araştırmacılar hızla düşük sinyal noise oranları ile basit deneyleri Abdovirüs çoğaltma nicel veriler elde etmek için izin verir.

Araçlar Viral Immunomodulators ve ana bilgisayar Antiviral faktörler tanımlanması için eleme olarak Abdovirüs enfeksiyonlar

Bir Pan-Lyssavirus iç içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu özellikle tüm bilinen lyssaviruses algılamak için geliştirilmiştir. Farklı hayvan türlerinin kuduz beyin örneklerini kullanarak doğrulama Bu yöntemin altın standart floresan antikor testi için bir duyarlılık ve özgüllük eşdeğer olduğunu gösterdi ve rutin kuduz tanısı için kullanılabilir.

Lyssaviruses tespiti için evrensel Iç Içe Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu değerlendirilmesi

Bu, vahşi doğada yakalanan yarasaların genomik, transkripsiyonik ve proteomik analizleri için en uygun doku hazırlığı için bir protokoldür. Bu yarasa yakalama ve diseksiyon, doku koruma ve yarasa dokusunun hücre culturing için protokoller içerir.

-Omics Analizleri ve Birincil Hücre Kültürü için Yarasaların Doku Toplama

DsDNA enterkalasyon boya kullanarak bu gerçek zamanlı RT-PCR Lissavirüse enfeksiyonları teşhis etmek için uygundur. Yöntem, kuduz şüpheli ante-mortem veya post-mortem örneklerinden çıkarılan RNA ile başlar, ana karışım hazırlama, RNA ilavesi, gerçek zamanlı makinenin kurulumu ve sonuçların doğru yorumlanması hakkında ayrıntı.

Pan-Lyssavirus gerçek zamanlı RT-PCR Rabies tanı için

Beyin biyopsisi örneklemesinden son yoruma kadar hızlı immünokromattografik tanı testi (RIDT) ile alan koşullarında hayvan kuduzlarının postmortem tanısı için tam bir protokol salıyoruz. Ayrıca moleküler analiz ve viral genotipleme için cihazı kullanarak daha fazla uygulama açıklar.

Field Postmortem Kuduz Hızlı İmmünromatografik Tanı Testi Kaynak Sınırlı Ayarlar için Diğer Moleküler Uygulamalar ile

Bu protokol, bazı kuduz olmayan lizavirüsler ve lagomorflar için test performansını iyileştirmek için primer dizileri ve formülasyonlardaki güncellemeler de dahil olmak üzere, doku toplamadan sonuç yorumlamaya kadar pan-lizavirüs LN34 gerçek zamanlı ters transkripsiyon-polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) testini gösterir. Ayrıca, tek kuyulu LN34 çoğullanmış (LN34M) formatı için tahlil kurulumunu da gösteriyoruz.

Güncellenmiş, Çoğullanmış LN34 Gerçek Zamanlı Ters Transkripsiyon-Polimeraz Zincir Reaksiyonu Testi ile Hayvanlarda Kuduz Postmortem Tanısı

Sucul ortamlarda eser metal çalışmaları için su örneklerinin uygun şekilde toplanması ve işlenmesi için "temiz tekniklerin" kullanılmasına özel dikkat gösterilmesi gerekmektedir. Ayrıntılı eser metal çalışmaları için güvenilir çevresel izleme verileri ve yüksek hassasiyete sahip sonuçlar elde etmek amacıyla numune alma, işleme ve analitik prosedürler için bir protokol sunulmaktadır.

Temiz Örnekleme ve Eser Metal Çalışmaları Nehri ve haliç Waters Analizi

Plankton ve askıya alınan parçacıklar okyanusta biyojeokimyasal döngüleri içinde önemli bir rol oynamaktadır. Burada, deniz suyu büyük miktarlarda işleme yeteneği ile parçacıklar ve plankton denizde irili ufaklı derlemesinin bir ultra temiz, düşük stres yöntemi sağlamak.

Şeker boyutu deniz Plankton ve askıya alınan parçacıkları toplamak için Ultra temiz bir çok katmanlı aparat

Biz Brønsted asidik iyonik sıvılar (BAILs) varlığı su katalizör ile bir yenilenebilir olmayan yenilebilir lignocellulosic biyokütle (yani, jüt) C5 şekerler (ksiloz ve arabinoz) sentezi için bir iletişim kuralı mevcut. BAILs katalizör geleneksel mineral asit katalizörler daha iyi katalitik performans sergiledi (H2SO4 ve HCl).

Pentosan analizi için yeni bir yöntem mevcut Jüt biyokütle ve şeker monomerleri asidik iyonik sıvı kullanarak içine onun dönüşüm

Bu kağıt filtre malzemeleri, demir içeren üzerine Fosfonat adsorpsiyon araştırmak için bir prosedür tanıttı biraz çaba ve yüksek güvenilirlik ile özellikle taneli demir hidroksit. Arabelleðe alýnmýþ bir çözümde phosphonate bir rotator kullanarak adsorbent temas getirdim ve bir minyatür fosfor tayini yöntemi ile analiz.

Fosfonat adsorpsiyon taneli ferrik minyatürize fosfor belirleme yöntemini kullanarak hidroksit üzerine belirlemek için en iyi duruma getirilmiş yordamı

Öğrenin, Tayvan'daki yarasa popülasyonlarında Lyssavirus varlığını değerlendirmek için standart laboratuvar prosedürlerini. Bu yöntem, zoonotik hastalık izleme kapasitesini artırır ve halk sağlığı araştırmalarına katkı sağlar.

Tayvan'da Yarasa Popülasyonunun Lyssavirus Gözetimi için Standart Çalışma Prosedürü

Daha fazla video keşfet