Tayvan'da Yarasa Popülasyonunun Lyssavirus Gözetimi için Standart Çalışma Prosedürü

Lyssavirus bir hayvanat bahçesi-no-tik patojenler olduğunu. Tayvanyarasa popülasyonlarında Lyssavirus varlığını değerlendirmek için bir gözetleme programı başlattık. Ve 2016'dan 2018'e kadar dört Lyssavirüs tespit etti.

Bu protokol Tayvan'da vi-al Lyssavirus gözetim için adım adım giriştir. Biz vi-al Lyssavirus gözetim ilgilenen araştırmalar için yararlı olacağını umuyoruz. Doğru tac-fıçı sembolübağlamak önemlidir.

Ölü ya da ölmekte olan bir yarasa, Lyssavirus gözetimi için canlı bir yarasadan daha uygundur. Laboratuvarın bulunduğu ülkenin biyo-güvenlik yönetmeliklerine bağlı olarak aşağıdaki işlemleri uygun bir biyo-güvenlik düzeyinde laboratuvarda gerçekleştirin. Ve araştırmacılar şu anda nitelikli olduğundan emin olun ve uygun kişisel koruyucu ekipman giymek.

Zayıf veya hasta yarasalar veya leşlerin toplanması üzerine, bir yarasa ekolojisti numunenin morfolojik özelliklerine göre yarasa türlerini tanımlar. Her yarasa numunesi ile toplama alanı, türler, klinik işaretler ve diğer ilgili verileri içeren bir bilgi sayfasını laboratuvara gönderin. Nekoskopiye başlamadan önce, tüm dış delikleri inceleyin ve yarasaların dış özelliklerinin fotoğrafını, özellikle tür farklılaşması için baş, kulak ve kanatları niçin fotoğraflayın.

Bir oral bez örnek toplamak için steril bir diseksiyon tahtası üzerinde ventral recumbency yarasa yerleştirin ve cımbız ile baş düzeltmek. Baldır alanının orta hattı boyunca deri kesmek için bir neşter kullanın;ve yanal kenarlara deri çekin, buzağı alanının orta hattı boyunca kafatasında bir kesi yapmak için. Beyin dokusunu ortaya çıkarmak için cımbızla kafatasını açın ve beyin dokusunu bağlı sinir dokusundan nazikçe ayırmak için cımbızları kullanın.

Beyin sapı ve beyincik de dahil olmak üzere beynin kesitini kesin ve smear gösterimi yapmak için beyin dokusunun kesilen yüzeyine cam kaydıraklarla hafifçe dokunun. Fazla dokuyu çıkarmak ve eksi 20 derece santigrat asetondaki yayma gösterim slaytlarını 30 dakika boyunca düzeltmek için lens dokusuna kaydırak tuşuna basın. Sonra histopatolojik inceleme için formalin, taze beyin dokusu küçük bir parça düzeltmek.

Ve nükleik asit ekstraksiyonu için dokunun geri kalanını emi-em 10'a yerleştirin. Daha sonra, vücudun orta hattı boyunca anüs manifoldu ndan deri eğim, ve kaldırmak ve cildi ayırmak ve kas dokuları altını çizmek için cımbız kullanın;tükürük bezlerinin toplanması için, mandibular kemik yakınında bulunan. Biraz cımbız ile sternum kaldırma, orta hat boyunca sternum ve karın duvarı kesmek ve köprücük kemiği kesmek için neşter kullanın.

Göğüs boşluğunu açmak için sol ve sağ göğüs kafeslerini diseksiyon panosuna sabitlemek için iğneler kullanın. İğrenç lejyonları ve ölüm sonrası değişim derecesini kaydedin. Sonra planlanan downstream analizi için uygun olarak visseral dokuları kaldırmak için cımbız ve neşter kullanın.

Fiksasyon sonunda doğrudan floresan antikor testi yapmak için, yayma gösterim slaytları kuru ve analiz için en az iki floresan konjuge anti-kuduz antikorları seçin. 0,45 mikrometrelik bir süzgeçten her slayta bir antikor süzün. Ve kaydırakları nemli bir odada 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın.

Kuluçka sonunda, fazla konjuge drenaj ve PBS ile slaytlar yıkayın. Daha sonra slaytlar üzerine kapak-slips monte etmek ve floresan mikroskopi ile slaytlar görüntü% 10 gliserol küçük bir hacim kullanın. Floresan antikor testi veya RT-PCR analizi pozitifliği gösterdiğinde, emi-en 10'daki %10 süspansiyondaki beyin örneğini homojenleştirin ve fleu-rry dokularını santrifüj ile tortulayın.

Süper nat-en'in 200 mikrolitresini 3 çarpı 10 ile 6'ncı fare nöroblastom hücreleri ve bir mililitre emi-en 10'u 37 santigrat derece ve %1 karbondioksitle bir saat boyunca aşılayın. Ve beyni homojen hücre süspansiyonuna aktarın 25 santimetre karelik bir şişeye, altı mililitre taze emi-en 10 içeren. Dört kuyulu Teflon kaplı cam slayt içine beyin homojen hücre süspansiyon bir mililitre at, altı milimetre çapında ve 37 santigrat derece ve% 1 karbondioksit üç ila dört gün slayt yerleştirin.

%100 aseton ile fiksasyon dan sonra, floresan antikor testi için kullanılan aynı iki floresan konjuge anti-kuduz antikorları ile slaytlar leke. Ve intrasita-plas-mik inklüs sayısını belirlemek için floresan mikroskopi ile slaytlar görselleştirin. Standart protokollere göre aşılanmış hücre kültürünü denedikten ve alt tanTana ettikten sonra, %100 enfekte olana kadar enfekte hücre sayısının tekrar sayımı ile soğuk kültürünü hücre kültürü kuluçka makinesine 3-4 gün daha geri döndürün.

Ocak 2014'ten Mayıs 2017'ye kadar 13 türden 332 yarasa leşi gözetim altında toplandı. İki pozitif yarasa olgusu bu temsili analizinde, beyin izlenimi, flüoresan antikor testi kullanılarak, ticari, fit-sy konjuge anti-kuduz antikorlarından biriyle negatif test edilirken, iki farklı astar setinin her birini kullanan RT-PCR olumlu sonuçlar verdi. Gen banka veritabanında patlama sorgulama elde edilen ampli-con dizisinin öznel sekans tespit Lyssaviruses kimliklerini destekleyen az% 79 kimlikleri ile Lyssaviruses benzer olduğunu ortaya koymuştur.

İki Lyssaviruses daha sonra başarılı floresan antikor testi ve sıralama ile doğrulandı olarak iki beyin izole edildi. Lyssavirus pozitifliğini belirlemek için önemli adım floresan antikor testi ve RT-CPR analizidir. Astar setlerinde iki veya daha fazla anti-kuduz antikorunun kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Lyssavirus'a ek olarak diğer zoo-ical yarasa patojenleri kapalı tanı yöntemleri ile izlenebilir. Veriler daha sonra yarasalarla temastan kaçınma konusunda halkı bilgilendirmek için kullanılabilir. Yarasa Lyssavirus'u ne kadar çok inceleyebildiysek, onun evrimini ve halk sağlığı üzerindeki etkisini o kadar iyi anlayabiliriz.