Name: Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Öğrenin, bronkoalveoler lavaj sıvısından alveoler makrofaj ve CD4+ T hücre izolasyonu yöntemiyle akciğer HIV rezervuarlarını değerlendirmeyi. Bu teknik, immünofenotipleme ve virolojik analiz için saf hücre popülasyonları sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar onların fon kabul etmek istiyorum: Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri (CıCR) (CC, MAJ, NC #153082 hibe); Réseau SıDA et maladies, CC ve MAJ 'a ve CC 'ye fon veren McGill Üniversitesi Tıp Fakültesi 'ne fon veren du Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) ' e bulaşır. Bu çalışmada ayrıca Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsü (CIR)-Kanadalı HıV Cure Enterprise (CanCURE) Team Grant HB2-164064 MAJ, CC ve NC tarafından finanse edilmiştir. MAJ, Immünviroloji ve CC ve NC 'de, sırasıyla FRQ-S Junior 1 ve Junior 2 araştırma maaş ödülünü taşıyan CıSC Kanada araştırma koltuğu seviye 2 ' ye sahiptir. ET, RI-MUHC Studentship MSc ödülüne sahiptir.
Buna ek olarak, yazarlar Josée Girouard ve tüm klinik personel örnekleri koordine ve alma dahil olmak üzere, yanı sıra respiratuar terapistler kabul etmek istiyorum; Ekaterina ıourtchenko, Hélène Pagé-Veillette, ve Marie-Hélène Lacombe RI-MUHC Immünophenotyping platformunda; ve Dr. Marianna Orlova mikroskopi fotoğrafları sağlanması için. En önemlisi, yazarlar bu araştırma mümkün olmayacaktır kim olmadan birçok gönüllülere teşekkür etmek istiyorum.

<ol><li>Chun, T. W., Fauci, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+reservoirs+of+HIV%3A+obstacles+to+the+eradication+of+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Latent reservoirs of HIV: obstacles to the eradication of virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 10958-10961 (1999).</li>
<li>Finzi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Latent+infection+of+CD4%2B+T+cells+provides+a+mechanism+for+lifelong+persistence+of+HIV-1%2C+even+in+patients+on+effective+combination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Latent infection of CD4+ T cells provides a mechanism for lifelong persistence of HIV-1, even in patients on effective combination therapy.</a> Nature Medicine. 5, 512-517 (1999).</li>
<li>Costiniuk, C. T., Jenabian, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lungs+as+anatomical+reservoirs+of+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The lungs as anatomical reservoirs of HIV infection.</a> Reviews in Medical Virology. 24, 35-54 (2014).</li>
<li>Center for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+Kaposi%27s+sarcoma+and+Pneumocystis+carinii+pneumonia+among+homosexual+male+residents+of+Los+Angeles+and+Orange+Counties%2C+California%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">A cluster of Kaposi's sarcoma and Pneumocystis carinii pneumonia among homosexual male residents of Los Angeles and Orange Counties, California.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 31, 305-307 (1982).</li>
<li>Fitzpatrick, M., Crothers, K., Morris, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+directions%3A+lung+aging%2C+inflammation%2C+and+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+Chest+Medicine%22%5BJournal%5D)">Future directions: lung aging, inflammation, and human immunodeficiency virus.</a> Clinics in Chest Medicine. 34, 325-331 (2013).</li>
<li>Kunisaki, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Will+expanded+ART+use+reduce+the+burden+of+HIV-associated+chronic+lung+disease%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+HIV+and+AIDS%22%5BJournal%5D)">Will expanded ART use reduce the burden of HIV-associated chronic lung disease?</a> Current Opinion in HIV and AIDS. 9, 27-33 (2014).</li>
<li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22WHO+%7C+Tuberculosis+and+HIV%22">WHO | Tuberculosis and HIV</a>. , https://www.who.int/hiv/topics/tb/en (2018).</li>
<li>Jambo, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+alveolar+macrophages+are+infected+preferentially+by+HIV+and+exhibit+impaired+phagocytic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Small alveolar macrophages are infected preferentially by HIV and exhibit impaired phagocytic function.</a> Mucosal Immunology. 7, 1116-1126 (2014).</li>
<li>Yeligar, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+Alveolar+Macrophage+PPAR%CE%B3%2C+NADPH+Oxidases%2C+and+TGF%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of Alveolar Macrophage PPARγ, NADPH Oxidases, and TGFβ.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 33, 1018-1026 (2017).</li>
<li>Cribbs, S. K., Lennox, J., Caliendo, A. M., Brown, L. A., Guidot, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Healthy+HIV-1-infected+individuals+on+highly+active+antiretroviral+therapy+harbor+HIV-1+in+their+alveolar+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Research+and+Human+Retroviruses%22%5BJournal%5D)">Healthy HIV-1-infected individuals on highly active antiretroviral therapy harbor HIV-1 in their alveolar macrophages.</a> AIDS Research and Human Retroviruses. 31, 64-70 (2015).</li>
<li>Holt, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+immune+and+inflammatory+cells+from+human+lung+parenchyma%3A+evaluation+of+an+enzymatic+digestion+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Extraction of immune and inflammatory cells from human lung parenchyma: evaluation of an enzymatic digestion procedure.</a> Clinical & Experimental Immunology. 66, 188-200 (1986).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+frequencies+of+polyfunctional+HIV-specific+T+cells+are+associated+with+preservation+of+mucosal+CD4+T+cells+in+bronchoalveolar+lavage%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">High frequencies of polyfunctional HIV-specific T cells are associated with preservation of mucosal CD4 T cells in bronchoalveolar lavage.</a> Mucosal Immunology. 1, 49(2007).</li>
<li>Mwandumba, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+tuberculosis%3B+Resides+in+Nonacidified+Vacuoles+in+Endocytically+Competent+Alveolar+Macrophages+from+Patients+with+Tuberculosis+and+HIV+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium tuberculosis; Resides in Nonacidified Vacuoles in Endocytically Competent Alveolar Macrophages from Patients with Tuberculosis and HIV Infection.</a> The Journal of Immunology. 172, 4592(2004).</li>
<li>Gordon, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+delivery+of+23-valent+pneumococcal+polysaccharide+vaccine+does+not+result+in+enhanced+pulmonary+mucosal+immunoglobulin+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Inhaled delivery of 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine does not result in enhanced pulmonary mucosal immunoglobulin responses.</a> Vaccine. 26, 5400-5406 (2008).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+persistence+in+mucosal+CD4%2B+T+cells+within+the+lungs+of+adults+receiving+long-term+suppressive+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">HIV persistence in mucosal CD4+ T cells within the lungs of adults receiving long-term suppressive antiretroviral therapy.</a> AIDS. 32, 2279-2289 (2018).</li>
<li>American Thoracic Society. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22American+Thoracic+Society+-+Bronchoalveolar+Lavage%22">American Thoracic Society - Bronchoalveolar Lavage</a>. , https://www.thoracic.org/professionals/clinical-resources/critical-care/clinical-education/critical-care-procedures/bronchoalveolar-lavage.php (2004).</li>
<li>King, T. E. Jr <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKing%2C+TE+%22Basic+principles+and+technique+of+bronchoalveolar+lavage+-+UpToDate%22">Basic principles and technique of bronchoalveolar lavage - UpToDate</a>. , https://www.uptodate.com/contents/basic-principles-and-technique-of-bronchoalveolar-lavage?topicRef=105799&source=see_link (2018).</li>
<li>Lea, S., Dungwa, J., Ravi, A., Singh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophage+size+is+increased+in+COPD+patients+compared+to+controls%5BTitle%5D)+AND+%22European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophage size is increased in COPD patients compared to controls.</a> European Respiratory Journal. 50, (2017).</li>
<li>Kuse, R., Schuster, S., Schübbe, H., Dix, S., Hausmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+lymphocyte+volumes+and+diameters+in+patients+with+chronic+lymphocytic+leukemia+and+normal+controls%5BTitle%5D)+AND+%22Blut%22%5BJournal%5D)">Blood lymphocyte volumes and diameters in patients with chronic lymphocytic leukemia and normal controls.</a> Blut. 50, 243-248 (1985).</li>
<li>Heron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bronchoalveolar+lavage+cell+pattern+from+healthy+human+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bronchoalveolar lavage cell pattern from healthy human lung.</a> Clinical & Experimental Immunology. 167, 523-531 (2012).</li>
<li>Rheinländer, A., Schraven, B., Bommhardt, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD45+in+human+physiology+and+clinical+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Letters%22%5BJournal%5D)">CD45 in human physiology and clinical medicine.</a> Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).</li>
<li>Yu, Y. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+Cytometric+Analysis+of+Myeloid+Cells+in+Human+Blood%2C+Bronchoalveolar+Lavage%2C+and+Lung+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54, 13-24 (2015).</li>
<li>Geiser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+Macrophage+Clearance+of+Inhaled+Micro-+and+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Aerosol+Medicine+and+Pulmonary+Drug+Delivery%22%5BJournal%5D)">Update on Macrophage Clearance of Inhaled Micro- and Nanoparticles.</a> Journal of Aerosol Medicine and Pulmonary Drug Delivery. 23, 207-217 (2010).</li>
<li>Costiniuk, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+and+predictors+of+airflow+obstruction+in+an+HIV+tertiary+care+clinic+in+Montreal%2C+Canada%3A+A+cross+sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22HIV+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prevalence and predictors of airflow obstruction in an HIV tertiary care clinic in Montreal, Canada: A cross sectional study.</a> HIV Medicine. , (2019).</li>
<li>Balfour, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altruism+motivates+participation+in+a+therapeutic+HIV+vaccine+trial+%28CTN+173%29%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS+Care%22%5BJournal%5D)">Altruism motivates participation in a therapeutic HIV vaccine trial (CTN 173).</a> AIDS Care. 22, 1403-1409 (2010).</li>
<li>Vandergeeten, C., Fromentin, R., Chomont, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cytokines+in+the+establishment%2C+persistence+and+eradication+of+the+HIV+reservoir%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+%26+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">The role of cytokines in the establishment, persistence and eradication of the HIV reservoir.</a> Cytokine & Growth Factor Reviews. 23, 143-149 (2012).</li>
<li>Rennard, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+volume+of+epithelial+lining+fluid+recovered+by+lavage+using+urea+as+marker+of+dilution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology+%281985%29%22%5BJournal%5D)">Estimation of volume of epithelial lining fluid recovered by lavage using urea as marker of dilution.</a> Journal of Applied Physiology (1985). 60, 532-538 (1986).</li>
<li>Twigg, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+highly+active+antiretroviral+therapy+on+viral+burden+in+the+lungs+of+HIV-infected+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effect of highly active antiretroviral therapy on viral burden in the lungs of HIV-infected subjects.</a> The Journal of Infectious Diseases. 197, 109-116 (2008).</li>
<li>Duan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+Macrophage+Subpopulations+Characterize+Acute+Infection+and+Chronic+Inflammatory+Lung+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Distinct Macrophage Subpopulations Characterize Acute Infection and Chronic Inflammatory Lung Disease.</a> The Journal of Immunology. 189, 946(2012).</li>
<li>Garn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+aspects+of+flow+cytometric+analysis+of+cells+from+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Specific aspects of flow cytometric analysis of cells from the lung.</a> Experimental and Toxicologic Pathology. 57, 21-24 (2006).</li>
<li>Szaniawski, M. A., Spivak, A. M., Bosque, A., Planelles, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+influences+SAMHD1+activity+and+susceptibility+to+HIV-1+in+primary+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Sex influences SAMHD1 activity and susceptibility to HIV-1 in primary human macrophages.</a> The Journal of Infectious Diseases. , (2018).</li>
<li>Avalos, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+Productively+Infected+Monocytes+and+Macrophages+of+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of Productively Infected Monocytes and Macrophages of Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> Journal of Virology. 90, 5643-5656 (2016).</li>
</ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Burada, ciğerleri içinde HıV rezervuar araştırmak için incelenebilir uyumlu PBMCs ile birlikte CD4 T hücreleri ve AMs elde etmek için BAL sıvısı işleme için bir yöntem açıklanmıştır. Biz son zamanlarda HIV DNA kantifikasyon içinde CD4 t hücrelerinde eşleşen periferik kan ve bal örnekleri bildirilen, ve bizim grup HIV olduğunu göstermiştir 13 pulmoner CD4 t hücrelerinde daha bol periferik kan olanlar daha15. Ancak, AMs HıV DNA seviyeleri donör bağımlı ve bu yüzden, şimdiye kadar, macrofajlar15ile karşılaştırıldığında lenfositlerde HIV DNA seviyeleri arasında tutarlı bir korelasyon olmamıştır. Bu birincil makrophaj hücre subsets erişim, ancak, bu soruyu sorgulamak ve HıV rezervuar bağlamında akciğer viral yük daha iyi bir anlayış kazanıyor için hayati bir araç olacaktır.
Ön sanat döneminde ve BAL sıvısı kullanan diğer çeşitli çalışmalarda, katılımcılar şüpheli bir patolojinin teşhisi veya solunum belirtileri için mikrobiyolojik tanı almak amacıyla bronkoskopi yapıldı3. Ancak, herhangi bir Aktif akciğer belirtileri veya patolojileri olmadan katılımcılar işe başardık ve tüm katılımcılar etik onay formu imzaladı15. Obstrüktif akciğer hastalığı24için Spirometri tarama çalışması gibi diğer çalışmalara katılan merkezimizin katılımcılarının yanı sıra lökoferez gibi diğer araştırma prosedürlerini de geçirebiliriz. Kolonoskopi. HıV ile yaşayan insanlar arasında önceki araştırma, bu fedakarlık araştırma çalışmaları25önemli bir faktör motive katılımı olduğunu göstermiştir. Birçok insan numuneleri gibi, biz kişi-to-Person değişkenlik büyük bir kaydetti. Hangi katılımcılar biz iyi karşı kötü hücre verimi ile BAL elde edeceğini "tahmin" için bir yolu yoktu. Periferik kanın aksine, hangi lenfosit oldukça tutarlı sayılar verir, BAL sıvı hücre numaraları çok değişkendir. Akciğer içine normal tuz daha büyük bir hacim enjekte (BAL sıvı daha büyük bir dönüş elde umuduyla ile) normal tuz daha büyük hacimli genellikle daha öksürük ve ateş postbronkoskopi daha yüksek bir risk ile ilişkili olduğu gibi her zaman mümkün değildir. Biz daha küçük bir (yerine daha büyük) çapı bronkoskop kullanarak respirolog bronş daha derin ulaşmak ve hücre daha büyük miktarlarda içeren sıvı elde etmek için etkin olduğunu fark ettik. Tutarlı bir bulgu, tütün içenlerin, AMs 'in enkaz ve partikül maddeyi yutması olarak beklendiği gibi, BAL sıvısı içinde lenfositlerden çok daha büyük orantıları vardı. Ayrıca, sigara içenlerden gelen BAL sıvısının, PCR makineleri ve akış cytometreleri gibi kullanılan donanımı engelleyen enkaz içerdiği gözlenmiştir. Benzer sorunlar, yüksek kirlilik veya bireyler daha sık zayıf hava kalitesine maruz alanlarda görülebilir.
HıV rezervuarlarının kurulması ve viral Kalıcılık ile ilgili olarak, CD4 T hücrelerinin saflığı ve AMs önemli bir önem taşımaktadır. Bu nedenle, son derece saf hücre popülasyonları elde etmek için floresan aktif hücre sıralama (FACS) kullanmayı tercih ettik. Bir bronkoskopi sırasında bazı küçük kanama bekleniyor olarak toplanan BAL sıvısı kan ile kontamine olabilir de mümkündür; naif B hücrelerinin varlığı bunu gösterecektir, ve hücreler bu sorunu aşmak için kırmızı kan hücresi liziz tamponunun içinde yıkanabilir. BAL sıvısının incelenmesi ile ilgili bir diğer zorluk, HıV Kalıcılık26' nın anlaşılması için önemli olan inflamatuar belirteçleri ve sitokinlerin ölçüleceği ile ilgilidir. Sertleştirilen tuz BAL sıvısını seyreltilince, inflamatuar mediatörlerin ve sitokinlerin seviyeleri ölçmek zor olabilir. Seyreltme için bir üre düzeltme faktörü önerilse de, kullanımı27, 28 ' iaçıklayan nispeten az literatür vardır.
AMs son derece autofluorescent, hangi hücre sıralama ve akış sitometri fenotipik analizi sırasında bir sorun oluşturmaktadır. Özellikle, etkisi, AMs tamamen siyah renk olabilir sigara içenler daha belirgindir, önemli ölçüde kendi otomatik yağ etkileyen. Standart mavi 488 nm lazer ile heyecanlı olduğunda, otofloresans yaklaşık 540 NM, fitc ve PE29,30gibi yaygın olarak kullanılan Konjugat floresan spektrumlu ile çakışıyor zirvesinde. İki ayrı lazerin FITC ve PE 'yi heyecanlandırmak için kullanıldığına dikkat çekiyor (örn. mavi 488 lazer tarafından sarı/yeşil ve FITC tarafından PE). FITC ile içsel otomatik yağışların üstesinden gelmek için, otomatik netleme arka planını belirlemek için lekelenmeli AMs kullandık. Buna ek olarak, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri kullanımı bu teknik konularda mücadele için çok yararlı olabilir. Daha büyük boncuklar (örn. 7,5 μm), makrofaj nüfusu telafi etmek için daha yakın olan, daha küçük boncuklar (örn., 3,0 μm) ile karşılaştırıldığında, lenfosit nüfusu telafi etmek için kullanılabilir. Daha uygun bir yaklaşım, tek leke kontrolleri olarak hücrelerin küçük bir kısmını kullanmak olacaktır, HLA-DR veya CD45 gibi, alt üzerinde bilinen, yüksek ifade marker kullanarak, her istenilen fluorochromes için conjuated, hangi için izin verecek bir çok daha boncuk ile elde edilebilir daha doğru tazminat. Sigara içenlerin numuneleri durumunda, bu taktik özellikle makrofajlar çok daha büyük ve daha fazla autofluorescent olarak yararlıdır. Buna ek olarak, hazırlık adımından, tüm BAL örnek protokolün Bölüm 3 ' te açıklandığı gibi sıralamadan önce bir plaka kültürlü olabilir, bağlılık tarafından nüfus ayrılması izin. Bu şekilde, bağlı macrofajlar lenfositler gibi diğer yapışmaz hücrelerden izole edilebilir. Lenfosit ve nüfusu birlikte incelendiğinde yerine ayrılırsa, tazminat çok daha az zordur; Ancak, bağlılık güvenmek makrofajlar kaybına neden olur, hangi hücre numaraları zaten sınırlarken önemli bir önem taşımaktadır. Ayrıca, bir yapışma adım bu hücreler kullanılarak oluşturulan aşağı sonuç etkileyebilir yapışan monositlerin istenmeyen aktivasyonuna neden olabilir. Hücrelerde daha az etkili olan hücreleri sıralama değeri, sonraki deneyler için bu tür hücrelerin daha düşük olması kısıtlamasına karşı tartılması gerekir.
Diğer modeller, en önemlisi duvar modelleri, makrophaj immunolojik özellikleri ve biyoloji çalışması için kullanılmıştır. Bu modeller son derece yararlıdır ve manipüle etmek zor bir hücre türü içine büyük anlayış izin verirken, sınırlamalar var. Hücre yüzeyi işaretçileri birçok insan AMs immünofenotip tamamen anlaşılmadı gibi fareler ve insanlar arasında değişir. Ancak, bu model sistemi, her hayvanın kullanılabilir düşük hücre numaraları nedeniyle çeşitli fareler havuzu gerektirir. Buna ek olarak, havuz numuneleri gereksinimi genetik yatkınlık ve cinsiyet hususlarını önler. Son zamanlarda, cinsiyet kısıtlama faktörü SAMHD-131farklı ifade nedeniyle HIV-1 tarafından makrofajların infeksiyonunda bir rol oynar gösterildi. İnsanlık dışı primatlar (NHP) insanlara en yakın modeli temsil eder ve Simian immünyetmezlik virüsü (SıV) enfeksiyonunun ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkisinin incelenmesi, doku-yerleşik makrofajların rolüne göre anlayış sağlayan monosit türevi makrofajlar. Rhesus Macaques içinde, aynı zamanda bir çoğaltma-yetkili virüs BAL limanından akciğer makrophage yalıtır gösterildi; bir viral büyüme tahlil (VOA) doku yerleşik hücreler32SIV davranışını analiz etmek için kullanıldı. Böyle bir bulgu önemli bir araştırma değeri ama yine de uygulanabilir önce insanlarda doğrulanmalıdır ve NHPs kullanarak yüksek maliyetli büyük örnek nüfus kullanımını önler. Buna ek olarak, insan AMs in vitro viral/mikrobiyal enfeksiyon ve tüberküloz/HıV koenfeksiyon gibi diğer patojenlerin çalışmaları gibi birçok diğer uygulamalar için yararlı olacaktır.

HIV enfeksiyonu için bir tedavi karşı karşıya en önemli zorluklardan biri antiretroviral tedavinin kesilmesi sonrasında plazma viremi bir rebound nedenleri gizli HIV rezervuar varlığı (sanat)1,2. Uzun vadeli sanat sırasında HıV rezervuar iyi, ikincil lenfoid organları, bağırsak ilişkili lenfoid doku (GALT) ve merkezi sinir sistemi (CNS) de dahil olmak üzere çeşitli doku bölmeleri, belgelenmiştir, akciğerler çalışma alanı olarak gözden geçti Pre-ART çağından beri3. Ancak, akciğerler HıV patogenezinde merkezi bir rol oynamaktadır. Gerçekten de, pulmoner semptomlar AıDS 'le ilgili fırsatçı enfeksiyonların ilk göstergeleri arasında yer aldı4. Modern sanat döneminde bile, HIV 'li kişiler HıV olmayan kişilerden daha fazla bulaşıcı ve bulaşıcı olmayan akciğer hastalıkları geliştirme riskine sahiptir. Örneğin, HIV enfeksiyonu olan kişiler invazif streptococcal pneumoniae enfeksiyonunun yanı sıra kronik obstrüktif pulmoner hastalık (kod)5,6için de yüksek risk altındadır. Ayrıca, tüberküloz (TB) ve HıV koenfeksiyon dünyanın belirli bölgelerinde önemli bir kamu sağlığı meydan okuma, özellikle de, Sahra-altı Afrika, HıV-enfekte bireyler 16 ila 27 kat daha fazla tüberküloz HıV olmadan kişiler daha olasılığı7. Pulmoner enfeksiyon ve kronik hastalığa bu duyarlılık için bazı açıklamalar8,9,10, HIV bastırılmış olan bireyler tarafından hassas hücresel mekanizmalar önerilmiştir rağmen akciğer komplikasyonları için yüksek risk altında kalan plazma viral yük tamamen elükidated olmamıştır. Önemlisi, HıV akciğer enfeksiyonu ve kronik hastalık için çok güçlü bir risk faktörüdür, Sigara durumu6bağımsız.
Akciğer bağışıklık ortamının analizi, bu nedenle, sağlık ve hastalık rolünü anlamak için çok önemlidir. Noninvaziv, indüklenmiş balgam örnekleri nadir pulmoner lenfositler ve hiçbir AMs ile epitelyal hücreler ve enkaz büyük miktarlarda içeren eğilimindedir rağmen, belirli uygulamalar için rol sınırlamaktadır. Bunun tersine, önemli kanama ve pnömotoraks (akciğerin çöküşü) ile ilgili riskler nedeniyle şüpheli hastalığın yokluğunda büyük miktarda doku biyopsisi elde edilemez. Ayrıca, pulmoner bağışıklık hücrelerinin çoğunluğu özellikle akciğerlerin sürekli solunum sırasında antijenler tarafından uyarılan mukozal düzeyde bulunur. Bu amaçla, BAL sıvısı elde etmek için bronkoskopi lenfositler ve AMs nispeten güvenli erişim sağlayan avantajı vardır (bkz. Şekil 1). Makrofajlar BAL sıvısı içindeki hücrelerin en büyük oranını oluşturmaktadır, ardından lenfositler11. Bu nedenle, BAL sıvısı tarafından immunophenotyping, hücre kültürü, transcriptomics veya başka uygulamalar gibi sonraki uygulamalarda kullanılmak üzere işlenecek bir yöntem oluşturmak için yararlıdır. Burada özetlenen BAL sıvısının işlenmesi için protokol, daha önce açıklanan ve kullanılan çeşitli akış uygulamaları için optimize edilmiş genel prosedürlerden uyarlanmıştır. Bu metodoloji hem pulmoner lenfoid ve miyeloid mukozal bağışıklık hücrelerinin onların fenofonal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yalıtım, hem de HIV ile yaşayan yetişkinlerde HıV rezervuar bir değerlendirme sağlar.
Bu protokolü kurmak için, çalışma katılımcıları15' i işe almak için aşağıdaki kriterleri kullandık. Katılımcıların bu araştırmaya katılmalarına uygun olmaları için, aşağıdaki kriterlere uyan HıV enfekte bireyler olmaları gerekiyordu: (1) ART üzerinde en az 3 yıl; (2) bastırılmış viral yük (VL) en az 3 yıl; (3) ≥ 200/mm3CD4 T hücre sayısı; (4) araştırma Spirometri ve bronkoskopi geçmesi istekli. Aşağıdaki kriterlere sahip hastalar çalışma dışında bırakıldı: (1) bronkoskopi için kontrendikasyon (ler); (2) yüksek kanama riski: koagulopati veya warfarin veya klopidogrel tedavisi; (3) trombositopeni (düşük platelets); (4) aktif pulmoner enfeksiyon veya başka bir akut pulmoner süreç; (5) hamile/hamile olmaya çalışıyorum.

<table><tbody><tr><td>70 ve mikro; m Steril Hücre Süzgeci</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td>70 & mikro ile naylon örgü filtreler; ACH-2 Hücrelerini ayırmadan önce BAL numunesindeki safsızlıkları gidermek için m gözenekler</td></tr><tr><td></td><td>NIH</td><td>349</td><td>HIV-1 gizli T hücresi klonu, CD4 ifade etmeyen bir entegre proviral kopya ile</td></tr> BD <tr><td></td><td>Biosciences</td><td>N/A</td><td>Hücre sıralayıcı (aynı anda 16 rengi algılayacak şekilde yapılandırılmıştır)</td></tr> <tr><td>BD LSRFortessa X-20</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A&nbsp;</td><td>Akış sitometresi (aynı anda 14 rengi algılayacak şekilde yapılandırılmış)</td></tr><tr><td>Bronkoskop</td><td>Olympus</td><td>BF-1TH190&nbsp;</td><td>EEIII HD terapötik bronkoskop; kanal genişliği 2.8 mm; dış çap 6.0 mm</td></tr><tr><td>Hücre Ayrışma Çözümü</td><td>Sigma</td><td>C5914&nbsp;</td><td>Yapışkan hücre tiplerini plastik veya cam yüzeylerden nazikçe çıkarmak için enzimatik olmayan formülasyon.</td></tr><tr><td>CD169&nbsp; BB515</td><td>BD Biosciences</td><td>565353</td><td>Akış sitometrisi CD14 için kullanılan sialik asit bağlayıcı molekül antikoru</td></tr><tr><td>; BV786</td><td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td>Akış sitometrisi CD206 için kullanılan endotoksin reseptör antikoru</td></tr><tr><td>; PE</td><td>BD Biosciences 555954</td><td></td><td>Akış sitometrisi CD3&nbsp; için kullanılan mannoz reseptör antikoru</td></tr><tr><td>; Alexa700</td><td>BD Biosciences</td><td>557943</td><td>Akış sitometrisi CD4 için kullanılan T hücresi ko-reseptör antikoru</td></tr><tr><td>; PE-Cy5</td><td>BD Biosciences</td><td>555348</td><td>Akış sitometrisi CD45 için kullanılan T hücresi ko-reseptör antikoru</td></tr><tr><td>; PE Cy-7</td><td>BD Biosciences</td><td>557748</td><td>Akış sitometrisi CD8 için kullanılan reseptöre bağlı protein tirozin fosfataz antikoru</td></tr><tr><td>; BV605</td><td>BD Biosciences</td><td>564116</td><td>Akış sitometrisi için kullanılan T hücresi ko-reseptör antikoru</td></tr><tr><td>CompBead Plus</td><td>BD</td><td>560497</td><td>Anti-fare&nbsp; Ig, &kappa; &nbsp; ve akış sitometrisinde floresan kompanzasyonunu optimize etmek için kullanılan negatif kontrol polistiren mikropartikülleri</td></tr><tr><td>DNaz I</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td> RNA dNTP Set 100 mM Invitrogen&nbsp'den <td>kontaminasyonu gidermek için tek ve çift sarmallı DNA'yı 5' fosfat içeren oligodeksiribonüleotidlere sindirir</td></tr><tr><td></td><td></td><td>; 10297-018</td> PCR Dimetil Sülfoksit (DMSO) Sigma D8418&<td>nbsp'de kullanım için dört deoksinükleotidden (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) oluşur</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>; Canlı hücrelerin dondurularak saklanması için ortam yapmak için kullanılan apolar, protik çözücü</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9912</td><td>Dnase I enzim aktivitesini durdurmak için kullanılır</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td>Ortamı desteklemek için birinci sınıf fetal sığır serumu</td></tr><tr><td>FcR Bloke Edici Reaktif, İnsan</td><td>Miltenyi</td><td>130-059-901</td><td>Akış antikorlarının</td></tr> <tr><td>spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için hücre yüzeyindeki Fc reseptörüne bağlanırFlowJo v10</td><td>FlowJo LLC</td><td>N/A</td><td>Tüm analizler için kullanılan akış sitometrisi analiz yazılımı</td></tr><tr><td>HLA-DR&nbsp; BV650</td><td>BD Biosciences</td><td>564231</td><td>Akış sitometrisi için kullanılan MHC sınıf II hücre yüzeyi reseptör antikoru</td></tr><tr><td>HyClone HEPES çözeltisi</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3023701</td><td>Fizyolojik pH'ın korunmasını sağlayan tampon;</td></tr><tr><td>Canlı/Ölü&nbsp; APC-H7</td><td>Invitrogen</td><td>L34975</td><td>Akış sitometrisi için kullanılan canlılık belirteci</td></tr><tr><td>Lenfosit Ayırma Ortamı (LSM)</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>350-000-CL</td><td>PBMC'nin tam kandan izolasyonu için Polisakaroz</td></tr><tr><td>Mr. Frosty Dondurma</td><td>Kabı ThermoFisher</td><td>5100-0001</td><td>-1 °C'ye çok yakın soğutma hızı sağlayan dondurma kabı; C/dk, hücre koruması için en uygun oran</td></tr><tr><td>OneComp eBeads</td><td>Invitrogen</td><td>01-1111-41</td><td>PBMC örneklerinin telafisi için anti-fare, sıçan ve hamster antikorları</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>311-010-CL</td><td>Hücre yıkama ve boyama için fosfat tamponlu salin</td></tr><tr><td>PCR Tüpleri Corbett Rotor-Gene</td><td>Axygen</td><td>PCR-0104-C</td><td>Corbett Rotor-Gene ile kullanım için 0,1 mL kapasiteli 4 şeritli PCR tüpleri</td></tr><tr><td>PerfeCTa qPCR ToughMix</td><td>Quantabio</td><td>95112</td><td>DNA şablonlarının PCR amplifikasyonu için 2x konsantre kullanıma hazır reaksiyon kokteyli&nbsp;</td></tr><tr><td>QiaAmp DNA Mini Kiti</td><td>Genomik, mitokondriyal</td>, bakteriyel, parazit veya viral DNA izolasyonu için Qiagen <td>51304</td><td>Kiti. QIAamp Mini Spin Kolonları, QIAGEN Proteinaz K, Reaktifler, Tamponlar, Toplama Tüpleri içerir</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td> 100 &'ye kadar saflaştırma için <td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Kiti; g hücrelerden, dokulardan ve mayadan toplam RNA. RNeasy Mini Spin Kolonları, Toplama Tüpleri, RNaz İçermeyen Reaktifler ve Tamponlar içerir</td></tr><tr><td>Rotor-Gene Q</td><td>Qiagen</td><td>9001550</td><td>Gerçek zamanlı PCR döngüleyici</td></tr><tr><td>RPMI 1640 1x</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>350-000-CL</td><td>Hücre kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Steril Su</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>809-115-CL</td><td>DNase, RNase ve proteaz içermez</td></tr><tr><td>Superscript ve ticaret; III Tek Adımlı RT-PCR Sistemi&nbsp;</td>Tek bir tüpte hem cDNA <td>sentezini</td> hem de PCR amplifikasyonunu gerçekleştiren <td>Invitrojen</td><td>12574018 RT-PCR kiti. SuperScript III RT / Platin Taq Karışımı, 2x Reaksiyon Karışımı (her dNTP'den 0,4 mM, 3,2 mM MgSO4 içeren), magnezyum sülfat</td></tr><tr><td>Taq DNA Polimeraz ve nbsp içerir;</td><td>Invitrogen</td><td>18038-042</td><td>dNTP'ler ve bir primer varlığında tek sarmallı şablonlardan DNA sentezleyen termostabil enzim. Taq DNA Polimeraz, 10x PCR tamponu, magnezyum klorür</td></tr><tr><td>Transkripsiyon Faktörü Tampon Seti</td><td>BD Biosciences</td><td>562725</td><td>Akış sitometrisi için hücre içi boyama tamponları içerir. Fiksasyon/geçirgenlik tamponu, seyreltici tamponu, perma/yıkama tamponu içerir</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma</td><td>T8154</td><td>Hematitometre kullanarak hücreleri saymak için canlılık boyası&nbsp;</td></tr></tbody></table>

alveoler makrophaj ve cd4+ t-cell immünophenotyping ve hiv rezervuar değerlendirmesi için bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Processing of Bronchoalveolar Lavage Fluid and Matched Blood for Alveolar Macrophage and CD4+ T-cell Immunophenotyping and HIV Reservoir Assessment

Bronkoskopi, normal salin bir bronkoskopla akciğerlere enjekte edildiği ve daha sonra emme uygulandığında, Bronkoalveoler Lavaj (BAL) sıvısının kaldırılması ile uygulanan tıbbi bir işlemdir. BAL sıvısı hücrelerde zengindir ve böylece pulmoner immün ortamın ' anlık görüntüsünü ' sağlayabilir. CD4 T hücreleri en iyi karakterize HıV rezervuarları, orada alveoler makrofajlar (AMs) dahil olmak üzere doku makrofajlar, ayrıca viral rezervuar olarak hizmet önermek için güçlü bir kanıt varken. Ancak, çok hala HıV rezervuar kurulması ve bakım bağlamında AMs rolü hakkında bilinmiyor. Bu nedenle, virolojik ve immünolojik olarak kullanılan hücreleri elde etmek için BAL sıvısının işlenmesi için bir protokol geliştirmek, akciğer içindeki hücre nüfusunu ve alt setleri karakterize etmek ve değerlendirmek, akciğerlerin HıV rolünü anlamak için ilgilidir. Rezervuar. Burada, basit santrifüjleme ve Akış sitometrisi gibi standart teknikler kullanan bir protokol açıklanmaktadır. CD4 T hücreleri ve AMs daha sonra immünofenotipleme ve HIV DNA ve RNA ölçümü de dahil olmak üzere sonraki uygulamalar için kullanılabilir.

Çoğu sigara içmeyen BAL sıvısı steril bir kabın içinde alınır ve biraz bulanık sarı-turuncu renkli bir sıvıdır. Donör bronkoskopide Endobronşiyal biopsleri uyguluysa ve bazı kanama meydana geldiği takdirde sıvı Pinker renk olabilir. Eğer donör bir sigara içen ise sıvı renk koyu olabilir. Santrifüjden sonra, bal süpernatant neredeyse açık ve biraz turuncu olacak, hücre peletleri renk kapalı-beyaz çok koyu kahverengi olabilir iken, örnek durumuna bağlı olarak ve donör bir sigara içen ya da olmadığını.
Tüm bal numunesi sayırken,18 μm çapında daha büyük, yuvarlak makrofajlar ve yaklaşık 7,3 μm çapında daha küçük yuvarlak lenfositler dahil olmak üzere farklı hücre tipleri görselleştirilebilir (bkz. Şekil 2). Macrofajlar%18yaklaşık 40 tarafından sigara içenler büyütülür. Hücre türleri arasındaki ayrım ayrı olarak macrofajlar ve lenfosit sayımı için izin verir. Ayrıca, özellikle sigara içenlerin örneklerinde, alanda görülebilir bazı enkaz olabilir. Macrofajlar BAL en bol hücre türüdür, yaklaşık% 85 için muhasebe, Sigara içmeyen20hücrelerin, ve onlar neredeyse özel görünebilir böylece sigara içiciler zenginleştirilmiştir.
BAL hücrelerinin toplama eğilimi vardır, bu nedenle tüm manipülasyonlar sırasında iyi karıştırılmalıdır. Pelet birkaç yıkama adımında bile karanlık görünebilir. Eğer filasentöz enkaz hücre sıralama için boyama sonra fraksiyonda belirgindir, hücre Sıralayıcı aracılığıyla çalıştırmadan önce bir 70 μm filtre ile hücreleri geçirin.
BAL hücrelerinin sıralanması, makrofajları barındıracak kadar büyük damlacık boyutlarını sağlamak için düşük basınçta yapılmalıdır. Hücreler ilk olarak tüm CD45+21 hücrelerini içerecek şekilde tutulur ve ardından tüm ölü hücrelerin dışlanabilmesini sağlamak için dayanılabilirlik temelinde (bkz. Şekil 3). Singlet hücreleri sonra seçilir ve bu içinde, iki nüfus boyutu ve morfoloji, yani daha büyük miyeloid hücreler ve daha küçük lenfositler dayalı (bkz. Şekil 3) Gated. Daha büyük hücreler içinde, hücreler CD20622,23 ve CD16922 ve çift pozitif hücreler AMs olarak sıralanır, daha küçük hücreler içinde, CD3+ hücreler seçilir ve, CD4 ve CD8 üzerinde Gated; CD4 tek pozitif ve CD8 tek pozitif hücreler sıralanır (bkz. Şekil 3). Kullanılan işaretçiler, fagositik hücreler23' te bulunan mannoz reseptör CD206 ve sialoyapışan reseptör CD16922gibi AMs 'nin önceden anlatılan fenotipleri üzerine dayalı olarak seçilmiştir.
PBMCs sıralamada, hücreler ilk olarak ileri ve yan dağılımda, homojen bir lenfosit popülasyon göstermelidir, hepsi alınır, sıfır eksenine yakın gürültü hariç (veriler gösterilmez). Nüfus Gated ve CD45, ve canlı CD45+ hücreler kullanılır. Bu nüfus daha sonra CD3 üzerinde Gated; monosit yalıtmak için, CD3- nüfus daha sonra CD14 üzerinde Gated ve tüm tek pozitif hücreler sıralanır. Lenfosit subsets izole etmek için, CD3+ hücreler CD4 ve CD8 üzerinde Gated ve hem tek pozitif ve hücre nüfus sıralanır.
<img alt="Ultra hassas PCR yöntemi kullanılarak HIV rezervuar analizi için pulmoner ve kan hücresi izolasyon diyagramı." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1 : Protokole genel bakış. Oluşturulan numunelerin olası aşağı akış kullanımları da dahil olmak üzere protokolün iş akışını gösteren şematik. PBMC = periferik kan mononükleer hücreler; BAL = Bronkoalveoler Lavaj; LSM = lenfosit ayırma orta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig1large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Lökositleri (L), monositleri (M) ve kırmızı kan hücrelerini (RBC) gösteren kan yayma mikroskobu görüntüsü." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2 : Tüm bal sıvısının mikroskop alanı görünümü. (A) bir sigara içmeyen ve (B) görünür lenfositler (L), makrofajlar (M) ve kırmızı kan hücreleri (RBC) ile bir sigarandan mikroskop görüntüleri. Büyütme 1, 000x (yağ daldırma ile 10X oküler ve 100x lens). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig2large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<img alt="Akış sitometrisi diyagramı, hücre popülasyonu geçidi, belirteçler: CD45, CD3, CD4, CD8, CD169, CD206." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59427/59427fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3 : Tüm bal hücrelerinin hücre sıralaması Için temsilci gating stratejisi. Alveoler makrofajlar (AM), CD4 ve, tüm BAL hücre örneklerinden CD8 T hücrelerini sıralamak için kullanılan gating stratejisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59427/59427fig3large.jpg" target="_blank">Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Örnek</td>
			<td>Antikor</td>
			<td>Florokrom</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Test başına hacim (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="5">BAL ve PBMC</td>
			<td>Canlı/ölü</td>
			<td>APC-H7</td>
			<td>-</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD45</td>
			<td>PE-Cy7</td>
			<td>HI30</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3</td>
			<td>Alexa700</td>
			<td>UCHT1</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>PE-cy5</td>
			<td>RPA-T4</td>
			<td>4</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>BV605</td>
			<td>SK1</td>
			<td>3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sadece BAL</td>
			<td>CD206</td>
			<td>Pe</td>
			<td>19,2</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>CD169</td>
			<td>BB515</td>
			<td>7-239</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sadece PBMC</td>
			<td>CD14</td>
			<td>BV786</td>
			<td>M5E2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: tüm BAL hücrelerinin ve yalıtılmış PBMCs 'lerin sıralanması için akış paneli.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Hedef</td>
			<td>Adım</td>
			<td>Primer adı</td>
			<td colspan="4">Primer sıra</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">HıV Total DNA veya HıV LTR-gag RNA</td>
			<td>Ön amplifikasyon PCR</td>
			<td>UR1</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA TCT CTC TCC TTC ETIKET C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>ULF1</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC TCT GGG TCT CTC TGG TTA GAC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerçek zamanlı PCR</td>
			<td>UR2</td>
			<td colspan="4">5 '-CTG AGG GAT CTC TAG TTA CC-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>LambdaT</td>
			<td colspan="4">5 '-ATG CCA CGT AAG CGA AAC T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>UHIV FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/CA CTC AAG G/ZEN/C AAG CTT TAT TGA GGC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD3 DNA</td>
			<td>Ön amplifikasyon PCR</td>
			<td>HCD3 dışarı 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-ACT GAC ATG GAA CAG GGG AAG-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>HCD3 dışarı 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCA GCT CTG AAG TAG GGA ACA TAT-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerçek zamanlı PCR</td>
			<td>HCD3 içinde 5 '</td>
			<td colspan="4">5 '-GGC TAT KEDI TCT TCT TCA AGG T-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>3 ' te HCD 3 '</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT CTC TTC AGC CAT TTA AGT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>CD3 FamZen:</td>
			<td colspan="4">5 '-/56-FAM/AG CAG AGA A/ZEN/C AGT TAA GAG CCT CCA T/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td>GUSB RNA</td>
			<td>Ön amplifikasyon PCR</td>
			<td>GUSB Ileri 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-ACC TAG AAT CTG CTG GCT ACT A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB ters 1:</td>
			<td colspan="4">5 '-GTT CAA ACA GAT CAC ATC CAC ATA C-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>Gerçek zamanlı PCR</td>
			<td>GUSB Ileri 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-TGC TGG CTA CTA CTT GAA GAT G-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB ters 2:</td>
			<td colspan="4">5 '-CCT TGT CTG CTG KEDI AGT ETIKET A-3 '</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>GUSB-HEX:</td>
			<td colspan="4">5 '-/5HEX/TCGCTCACA/ZEN/CCAAATCCTTGGACC/3IABkFQ/-3 '</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: HıV DNA ve RNA ölçümü için primer ve prob dizileri.

Biz Bronkoalveoler Lavaj sıvısı işleme için bir yöntem tarif ve pulmoner HıV rezervuarları değerlendirmek için antiretroviral tedavi kronik HıV enfekte bireylerin periferik kan eşleşen. Bu yöntemler, son derece saf CD4 T hücrelerinin satın alınması ve daha sonra ultrason polimeraz zincir reaksiyonu ile immünofenotipleme ve HIV DNA/RNA ölçülerinde kullanılabilir alveoler makrofajlar sonuçlanır.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Bronchoscopy is a medical procedure whereby normal saline is injected into the lungs via a bronchoscope and then suction is applied, removing ...

HIV hücresel ve anatomik rezervuarlarda kalıcılığı nedeniyle tedavi edilemez. Bu yöntem akciğerlerden izole bağışıklık hücrelerinin BIR HIV rezervuar değerlendirmesi sağlar. Bu teknik, pulmoner mukozal T hücrelerinin ve alveoler makrofajların BAL sıvısından izole edilmesine izin verir ve hiv hücresel rezervuarları olarak daha fazla fenotipik veya virolojik değerlendirme sağlar.Alveoler makrofajların ve CD4-pozitif T hücrelerinin biyolojisini ve HIV rezervuarına olan katkılarının anlaşılması, HIV tedavisinin karşı karşıya olduğu güçlüklere dair önemli içgörülere yol açabilir. Primer makrofajların BAL'dan izolasyonu astım ve tüberküloz gibi inflamatuar veya enfeksiyöz akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir. Standart protokollere göre bir insan hastadan BAL sıvısı alındıktan sonra, numuneyi biyogüvenlik kabini içinde 50 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce orijinal toplama tüpündeki sıvıyı girdaplayın.Sıvı çok bulanık veya ipliksi doku ile kontamine görünüyorsa, yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 70 mikrometre naylon örgü filtre ile örnek filtre. Santrifüjden sonra, süpernatant'ı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve tüm BAL hücrelerini içeren peleti yavaşça parçalamak için bir pipet ucu kullanın. RPMI 1640 orta bir mililitre pelet resuspend ve 10 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerher ayrılmış supernatant bir mililitre ekleyin.15 mililitrelik konik tüpler içine kalan supernatant 10 mililitrelik aliquots ekleyin ve eksi 80 derece santigrat depolama tüm supernatant örnekleri yerleştirin. Pelet hücresi süspansiyonunu her 25 mililitre orijinal numune için 10 mililitre orta lıkta seyreltin ve SANtrifüj ile BAL hücrelerini toplayın. Sonra orta bir mililitre pelet resuspend 10% fetal sığır serumu ile takviye, veya FBS, saymak için.Tüm BAL ve periferik kan mononükleer hücrelerinin sıralanması için, lekesiz ve canlılık lekeli kompanse kontrolleri için alt küme başına iki beş mililitrelik yuvarlak dipli polistiren tüplerin her birine beş hücreye beş kat 10 ekleyin ve her alt küme örneğinin geri kalanını numune başına bir beş mililitrelik tüpe ekleyin. Hücreleri santrifüj le toplayın ve kontrol peletlerini kullanılana kadar buzdaki tüp başına 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Fc reseptör bloke tampon bir saat için dört derece santigrat herhangi bir non-spesifik bağlama engellemek için bir saat için bir 20 seyreltme bir 250 mikrolitre sıralama için hücrelerin pelet resuspend.Engelleme kuluçka sonunda, dört santigrat derece ek bir saatlik kuluçka için ilgi uygun antikor kokteyl ekleyin. Birincil antikor kuluçka sonunda, santrifüj için her tüp e bir mililitre PBS ekleyin ve sıralama kadar ışıktan korunan buz üzerinde sıralama tampon 250 mikrolitre pelet resuspend. Telafi kontrolleri hazırlamak için, üç damla anti-fare immünglobulin kappa tazminat boncuk ve bir mikrosantrifüj tüp pbs bir mililitre başına negatif kontrol tazminat boncuk her ekleyin ve her örnek için kullanılacak boncuk çözeltisi 100 mikrolitre transfer.Boncuk içeren her ayrı tüp için kokteyl her antikor bir mikrolitre ekleyin ve her canlılık leke telafi kontrol tüpü için canlılık leke bir mikrolitre ekleyin. Işıktan korunan dört santigrat derecede 20 dakika sonra, numuneleri tüp başına bir mililitre PBS ile yıkayın ve tüp başına 250 mikrolitre taze PBS'de peletleri yeniden askıya alın. Tüm BAL hücresi lekesiz kontrol örneğini akış sitometresine yükleyin ve telafi matrisini ayarlayın.Sonraki örnek tüp yük ve düşük basınç altında hücreleri sıralamak, gürültü hariç gating, canlı ve CD45-pozitif hücreleri dahil etmek, ve doublets hariç. Daha büyük miyeloid popülasyoniçinde, CD206 ve CD169 çift pozitif hücreleri alveoler makrofajlar olarak sıralayın. Küçük lenfosit popülasyonu içinde, CD3-pozitif hücreleri izole ve CD4 ve CD8 tek pozitif popülasyonları sıralamak.Periferik kan mononükleer hücre örneğini sıralamak için, gürültü ve doublets dışlamak ve gösterildiği gibi canlı CD45-pozitif hücreleri dahil etmek için kapı. CD3'ü gating ettikten sonra, tek pozitif monositleri sıralamak için CD3-negatif, CD14-pozitif hücreleri kaplayın ve cd3-pozitif, CD4 ve CD8-pozitif hücreleri tek pozitif popülasyonların her ikisini de sıralamak için kapılayın. Bal örneğinin tamamı sayıldığında, daha büyük, yuvarlak makrofajlar ve daha küçük yuvarlak lenfositler de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri görüntülenebilir.Makrofajlar BAL sıvısında ki en bol hücre tipidir ve sigara içmeyen akciğerlerdeki hücrelerin yaklaşık %85'ini oluşturur. Bu hücreler sigara içenlerde neredeyse özel görünen noktaya kadar zenginleştirilmiş ve sigara içmeyenlerde gözlenen makrofajlara göre yaklaşık %40 oranında büyütülme eğilimindedir. BAL sıvı örneklerinden alveoler makrofajların ayıklanmasında kullanılan belirteçler, fagositik hücrelerde bulunan mannose reseptör CD206 ve sialoadhesin reseptör CD169 gibi daha önce tanımlanmış alveoler makrofajların fenotiplerine göre seçilmiştir.İzolasyonlarını takiben, alveoler makrofajlar ve diğer hücre tipleri, akış sitometrisi, immünolojik fonksiyonel tahliller veya ultraduyarlı PCR ile rezervuar nicelemesi ile immünofenotiyolog için kullanılabilir. Bu teknik, tarihsel olarak ulaşılması zor olan son derece saf doku yerleşik makrofajlara erişim sağlar ve bu da önemli bağışıklık hücresi popülasyonunun daha önce ulaşılmaz bir şekilde incelenmesine olanak sağlar.

processing-bronchoalveolar-lavage-fluid-matched-blood-for-alveolar

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Tregs bağışıklık sisteminin güçlü bastırıcılar. Bunları tanımlamak için benzersiz yüzey belirteçleri bir eksikliği vardır, dolayısıyla, Tregs tanımları öncelikle fonksiyonel. Burada bir optimize...

Insan In Vitro Bağışıklık Dengesizlik Erken Devlet Tanıma Tarama Aracı Olarak Bastırılması

Biz düşük basınçlı emme kullanarak fiberoptik bronkoskopi ve bronkoalveoler lavaj için bir araştırma tekniği açıklar. Bu teknik, akciğer bronkoalveoler yüzeylerinden bağışıklık hücreleri hasat etmek için kullanılır. Lokal anestezik ve hafif bilinçli sedasyon (midazolam) kullanılır. Denekler prosedür iyi ve deneyim minimal yan etkileri tolere.

Araştırma Bronkoalveoler Lavaj (BAL); Yeterli Örnek Verim Alma

Bu video, bronkoalveoler lavaj sıvısındaki çeşitli bağışıklık hücrelerini tanımlamak ve saymak için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. Başlangıçta, tek bağışıklık hücreleri bir canlılık boyası kullanılarak tanımlanır, ardından yüzey işaretleyici proteinlerin diferansiyel boyanması ile her hücre tipinin kesin sayımı sağlanır.

Bronkoalveoler Lavaj Sıvısındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri ile Tanımlanması ve Sayımı

Biz HIV-spesifik CD4 T hücreleri tarafından sitokin salgılanmasının düzenlenmesinde immünregulatuar yolların rolünü araştırmak için bir in vitro testi geliştirdi.

Vitro Testi HIV-spesifik CD4 T hücre efektör işlevi üzerinde immünoregülatör yolları etkisini değerlendirmek için

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Konfokal mikroskopi tarafından fagosite Aspergillus sporlarının büyümesini kontrol için izole edilmiş fare alveolar makrofaj yeteneğini değerlendirmek için bir yöntem.

Eşodaklı Mikroskopi İzole Alveoler Makrofagların anti-fungal Hareketi değerlendirilmesi

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

Bu iletişim metodolojisi yalıtım ve kültür insanlardan alveoler makrofajlar ve deneysel amaçlar için fare modelleri açıklar.

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Anne sütü insan immün yetmezlik virüsü (HIV) iletir, ancak HIV enfekte anneler tarafından emzirilen bebeklerin sadece ~% 15 enfekte olur. Anne sütüyle beslenen bebekler günlük ~105−108 maternal lökosit yutmaktadır, ancak bu hücreler incelenmiştir. Burada anne sütü lökositlerinin izolasyonu ve fagositik kapasitelerinin analizini anlatıyoruz.

Hiv Hedeflerinin Antikorbağımlı Hücresel Fagositoz Sataşanında Kullanılmak Üzere İnsan Anne Sütünden Lökositlerin İzolasyon

Öğrenin, bronkoalveoler lavaj sıvısından alveoler makrofaj ve CD4+ T hücre izolasyonu yöntemiyle akciğer HIV rezervuarlarını değerlendirmeyi. Bu teknik, immünofenotipleme ve virolojik analiz için saf hücre popülasyonları sağlar.

Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi (Video) | JoVE Journal

Alveoler Makrophaj ve CD4⁺ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

Daha fazla video keşfet