Alveoler Makrophaj ve CD4+ T-Cell Immünophenotyping ve HIV rezervuar değerlendirmesi Için Bronkoalveolar lavaj sıvısı ve eşleştirilen kanın işlenmesi

HIV hücresel ve anatomik rezervuarlarda kalıcılığı nedeniyle tedavi edilemez. Bu yöntem akciğerlerden izole bağışıklık hücrelerinin BIR HIV rezervuar değerlendirmesi sağlar. Bu teknik, pulmoner mukozal T hücrelerinin ve alveoler makrofajların BAL sıvısından izole edilmesine izin verir ve hiv hücresel rezervuarları olarak daha fazla fenotipik veya virolojik değerlendirme sağlar.

Alveoler makrofajların ve CD4-pozitif T hücrelerinin biyolojisini ve HIV rezervuarına olan katkılarının anlaşılması, HIV tedavisinin karşı karşıya olduğu güçlüklere dair önemli içgörülere yol açabilir. Primer makrofajların BAL'dan izolasyonu astım ve tüberküloz gibi inflamatuar veya enfeksiyöz akciğer hastalıkları da dahil olmak üzere çeşitli araştırma alanlarına uygulanabilir. Standart protokollere göre bir insan hastadan BAL sıvısı alındıktan sonra, numuneyi biyogüvenlik kabini içinde 50 mililitrelik bir tüpe aktarmadan önce orijinal toplama tüpündeki sıvıyı girdaplayın.

Sıvı çok bulanık veya ipliksi doku ile kontamine görünüyorsa, yeni bir 50 mililitrelik tüp içine 70 mikrometre naylon örgü filtre ile örnek filtre. Santrifüjden sonra, süpernatant'ı yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve tüm BAL hücrelerini içeren peleti yavaşça parçalamak için bir pipet ucu kullanın. RPMI 1640 orta bir mililitre pelet resuspend ve 10 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerher ayrılmış supernatant bir mililitre ekleyin.

15 mililitrelik konik tüpler içine kalan supernatant 10 mililitrelik aliquots ekleyin ve eksi 80 derece santigrat depolama tüm supernatant örnekleri yerleştirin. Pelet hücresi süspansiyonunu her 25 mililitre orijinal numune için 10 mililitre orta lıkta seyreltin ve SANtrifüj ile BAL hücrelerini toplayın. Sonra orta bir mililitre pelet resuspend 10% fetal sığır serumu ile takviye, veya FBS, saymak için.

Tüm BAL ve periferik kan mononükleer hücrelerinin sıralanması için, lekesiz ve canlılık lekeli kompanse kontrolleri için alt küme başına iki beş mililitrelik yuvarlak dipli polistiren tüplerin her birine beş hücreye beş kat 10 ekleyin ve her alt küme örneğinin geri kalanını numune başına bir beş mililitrelik tüpe ekleyin. Hücreleri santrifüj le toplayın ve kontrol peletlerini kullanılana kadar buzdaki tüp başına 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Fc reseptör bloke tampon bir saat için dört derece santigrat herhangi bir non-spesifik bağlama engellemek için bir saat için bir 20 seyreltme bir 250 mikrolitre sıralama için hücrelerin pelet resuspend.

Engelleme kuluçka sonunda, dört santigrat derece ek bir saatlik kuluçka için ilgi uygun antikor kokteyl ekleyin. Birincil antikor kuluçka sonunda, santrifüj için her tüp e bir mililitre PBS ekleyin ve sıralama kadar ışıktan korunan buz üzerinde sıralama tampon 250 mikrolitre pelet resuspend. Telafi kontrolleri hazırlamak için, üç damla anti-fare immünglobulin kappa tazminat boncuk ve bir mikrosantrifüj tüp pbs bir mililitre başına negatif kontrol tazminat boncuk her ekleyin ve her örnek için kullanılacak boncuk çözeltisi 100 mikrolitre transfer.

Boncuk içeren her ayrı tüp için kokteyl her antikor bir mikrolitre ekleyin ve her canlılık leke telafi kontrol tüpü için canlılık leke bir mikrolitre ekleyin. Işıktan korunan dört santigrat derecede 20 dakika sonra, numuneleri tüp başına bir mililitre PBS ile yıkayın ve tüp başına 250 mikrolitre taze PBS'de peletleri yeniden askıya alın. Tüm BAL hücresi lekesiz kontrol örneğini akış sitometresine yükleyin ve telafi matrisini ayarlayın.

Sonraki örnek tüp yük ve düşük basınç altında hücreleri sıralamak, gürültü hariç gating, canlı ve CD45-pozitif hücreleri dahil etmek, ve doublets hariç. Daha büyük miyeloid popülasyoniçinde, CD206 ve CD169 çift pozitif hücreleri alveoler makrofajlar olarak sıralayın. Küçük lenfosit popülasyonu içinde, CD3-pozitif hücreleri izole ve CD4 ve CD8 tek pozitif popülasyonları sıralamak.

Periferik kan mononükleer hücre örneğini sıralamak için, gürültü ve doublets dışlamak ve gösterildiği gibi canlı CD45-pozitif hücreleri dahil etmek için kapı. CD3'ü gating ettikten sonra, tek pozitif monositleri sıralamak için CD3-negatif, CD14-pozitif hücreleri kaplayın ve cd3-pozitif, CD4 ve CD8-pozitif hücreleri tek pozitif popülasyonların her ikisini de sıralamak için kapılayın. Bal örneğinin tamamı sayıldığında, daha büyük, yuvarlak makrofajlar ve daha küçük yuvarlak lenfositler de dahil olmak üzere farklı hücre tipleri görüntülenebilir.

Makrofajlar BAL sıvısında ki en bol hücre tipidir ve sigara içmeyen akciğerlerdeki hücrelerin yaklaşık %85'ini oluşturur. Bu hücreler sigara içenlerde neredeyse özel görünen noktaya kadar zenginleştirilmiş ve sigara içmeyenlerde gözlenen makrofajlara göre yaklaşık %40 oranında büyütülme eğilimindedir. BAL sıvı örneklerinden alveoler makrofajların ayıklanmasında kullanılan belirteçler, fagositik hücrelerde bulunan mannose reseptör CD206 ve sialoadhesin reseptör CD169 gibi daha önce tanımlanmış alveoler makrofajların fenotiplerine göre seçilmiştir.

İzolasyonlarını takiben, alveoler makrofajlar ve diğer hücre tipleri, akış sitometrisi, immünolojik fonksiyonel tahliller veya ultraduyarlı PCR ile rezervuar nicelemesi ile immünofenotiyolog için kullanılabilir. Bu teknik, tarihsel olarak ulaşılması zor olan son derece saf doku yerleşik makrofajlara erişim sağlar ve bu da önemli bağışıklık hücresi popülasyonunun daha önce ulaşılmaz bir şekilde incelenmesine olanak sağlar.