iPSC Kaynaklı Kas Atalarında Distrofin Ekspresyonunun Geri Kazanilmesinde CRISPR/Cas9 Teknolojisi

Duchenne kas atahücrelerinin erken tükenmesine neden olan bir kas distrofisidir. En şiddetli Kas Distrofilerinden biridir. Fonksiyonel bir kas rejenerasyonu teşvik etmek için, indüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı kas progenitor hücrelerinde distrofin ekspresyonu geri CRISPR / Cas9 aracılı gen düzenleme kullanın.

CRISPR-Cas9 gen düzenlemesi distrofin gen ekspresyonunu geri getirme potansiyeline sahiptir. Otolog iPSC türetilmiş kas atası hücreleri kök hücre gözeneklerini yenileyebilir, hasarı onarabilir ve bağışıklık yanıtına neden olmadan DMD'de daha fazla komplikasyonu önleyebilir. Miyojenik Progenitor Hücrelere iPS hücrelerinin farklı ajanları iPS hücrelerinde tümör yeniden ortaya çıkan riskini azalttı.

CRISPR-Cas9 aracılı genetik düzeltme ile otolog İndüklenen Pluripotent Kök Hücre kaynaklı kas progenitor hücreleri birleştiren çeşitli tedaviler Duchenne Musküler Distrofi tedavi stratejileri umut verici. Bu teknoloji genetik otolog kök hücreleri düzenleyerek birçok konjenital hastalıkların tedavisinde kullanılabilir, kalp de dahil olmak üzere, beyin, ve kan hastalığı. Bu yaklaşımın gösterilmesinin okuyuculara hücre yeniden programlama ve gen düzenleme konusunda deneyim kazandırabileceğini gösterdik, ki bu da bir sorun olmaya devam ediyor.

Ters bir mikroskop altında, enfekte fare embriyonik kök hücrelerinkolonileri inceleyin. Kendi kendine mürekkepli nesne işaretçisi ile yemeğin altındaki kolonileri işaretleyin. İşaretli hücre kolonilerini kapsayacak şekilde yağlanmış klonlama halkaları uygulayın.

Her klonlama halkasına %0,05 Tripsin-EDTA'dan 100 mikrolitre ekleyin ve plakayı 5 dakika boyunca 37 derecede bir kuvöze yerleştirin. Daha sonra, 100 mikrolitrelik pipet uçları ile sindirilmiş hücreleri 250 mililitre MES büyüme ortamı içeren 48 kuyulu kültür plakalarına aktarın. Hücreleri %5 Karbondioksit ve %85 nem oranıyla 37 Santigrat Derece kuvözde kuluçkaya yatırın.

%70 birleşimi okuduklarında, iyi yetiştirilen hücrelere sahip kuyuları seçin ve 30 dakika sindirmek için 250 mililitre TVP çözeltisi ekleyin. Daha sonra hücre kültürünü her kuyudan altı santimetrelik bir tabağa aktarın. Üniforma, yurt şeklindeki klonlar elde edilene kadar klonlama halkaları ve kuluçka uygulamalarını birkaç kez tekrarlayın.

Şimdi, bir mililitre TVP çözeltisi ekleyerek hazırlanan fare iPSC'lerini sindirin. Hücre kültürünü Fibronektin ve Jelatin ile kaplanmış 24 kuyulu bir tabağa aktarın ve %5 Karbondioksit ile 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. Hücreler %50 birleştiğinde, mililitre Polibrene başına sekiz mikrogram içeren 500 mikrolitre taze kültür ortamına geçin.

Daha sonra fare iPSC'lerine 100 mikrolitre merceksi partikül çözeltisi ekleyin. Hücreleri %5 Karbondioksit le 37 derecede üç gün kuluçkaya yatırın. Sonra, Blasticidin ve Hygromycin B'nin minimum konsantrasyonunun 24 saat içinde yarı ölüm hızında olduğunu belirleyin.

Hücrelere mililitre Blasticidin başına 2,5 mikrogram ve mililitre Hygromycin B başına 100 mikrogram medya ekleyin, üç gün bekleyin, ve enfekte hücreleri stabling olarak yapışık kalan hücreleri seçin. Seçilen fare iPSC'lerini 0,5 mililitre TVP çözeltisi ile sindirin, her biri yeni 24 kuyulu bir plakada, ve hücreleri %5 Karbondioksitle 37 derecede 30 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, pipet tek hücrelere iPSCs ve bir hücre sayma odası ile hücreleri saymak.

Yaklaşık 150 sindirilmiş tek hücre seçin ve MES orta ile seyreltmek 10 santimetre çanak, kültür 37 derece santigrat ile% 5 Karbondioksit. Yaklaşık 10 gün sonra, ters bir mikroskop altında, tek koloniler almak ve 96-iyi plaka TVP çözeltisi 50 mikrolitre içine her koloni aktarmak için 10 mikrolitre steril pipet ipuçları kullanın. 37 derecede 30 dakika sindirin.

Güvenilir manuel klonlama toplama CRISPR/Cas9-düzenlenmiş İndüklenen Pluripotent Kök Hücreleri hasat başarısı için önemlidir. Daha sonra, aktarılan hücreleri her kuyudan başka bir 96-well kültür plakaları içine bölmek. 37 derecede %70'e kadar kuluçkaya yat.

Hücre kolonilerinin %70'inin birleştiği yerde, 96 kuyulu plakadaki ortayı çıkarın. Her kuyuya %1 Proteinaz K çözeltisi içeren 25 mikrolitre Lysis reaktifi ekleyin ve lysate'yi başka bir 96 kuyulu PCR plakasına aktarın. PCR plakasını yapışkan contalarla kapatın ve plakayı 55 santigrat derecede 30 dakika, sonra 95 derecede 45 derecede inkübe ederek hücreleri inceleyin ve Proteinase K.Then'i denatüre edinin. bir PCR tüpünde, iki mikrolitre lysate, 10 mikrolitre 2x DNA Polimeraz Premix, 7 mikrolitre DNase içermeyen su ekleyin , ve DMD Exon23 astar bir mikrolitre.

El yazmasına göre PCR reaksiyonuna başlayın. Daha sonra, %2'lik agarose jelüzerine 2,2 mikrolitre yükleme tamponu ile birlikte verilen PCR reaksiyonu yükleyin. Jeli 100 ila 150 voltta 30 dakika çalıştırın ve jeli UV ışığı altında inceleyin.

Bu protokolde, mutant Exon23'ü çevreleyen iki kılavuz RNA tasarlanmıştır. Cas9 aracılı çift iplikçikli molalar ve homolog olmayan son birleştirme sonrasında mutant Exon23 silinerek kesilmiş ancak fonksiyonel Distrofin üretimine olanak sağladı. Trypsin çözeltisinin sızmasını önlemek için halkaların altına eşit yağ uygulamamız gerekir.

CRISPR/Cas9 genom düzenlemesinin tacked-on MyoD aktivasyon sistemi ile birleşimi, gen kurtarma bazal progenitor hücreleri olan Duchenne Musküler Distrofi hastalarında otolog transplantasyon için güvenli, uygulanabilir ve etkili bir strateji sağlar.