Embriyonik desen ölçekleme çalışma için zebrafish cerrahi boyutu azaltma
May 3rd, 2019
Burada, biz normal gelişimsel süreçleri bozmadan zebra balığı embriyo boyutunu azaltmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, boyut değişikliklere karşı desen ölçekleme ve gelişimsel sağlamlık etüdünü sağlar.
Ölçekleme gelişim sistemlerinin evrensel ve temel özelliklerinden biri olmasına rağmen, altta yatan mekanizmalar birçok organ ve dokuda anlaşılamamıştır. Bu videoda sunulan zebra balığının boyut küçültme tekniği, dinamik ölçekleme süreçlerinin altında yatan mekanizmaları anlamanızı sağlayacaktır. Zebra balıkları ile çalışmanın avantajları canlı görüntüleme, genetik ve kantitatif analiz yapmak kolay olmasıdır.
Tekniğimiz de çok basit ve herhangi bir özel ekipman veya yoğun eğitim olmadan uygulamak kolaydır. Embriyoların sağlığı bu teknikle başarının anahtarıdır. Anne olarak genç balık kullanın ve chorions kaldırarak hasarı en aza indirmek için dikkatli olun.
Ve ayrıca sarısı üzerindeki yaranın boyutunda oynayın, ve kaç hücre çıkarılır. Kullandığımız embriyolar çok genç ve kırılgan olduğundan, transfer ve doğrama yaparken çok dikkatli bir şekilde ele almalısınız. Aynı zamanda, prosedür geliştirme doğru zaman penceresinde yapılabilir, böylece hızlı olması gerekir.
Görsel gösteri nasıl etkili küçük embriyolar üretmek için iyi bir fikir verebilir. Embriyo doğrama için bir tel döngü yapmak için, bir cam kılcal damar ile 20 santimetre uzunluğunda sert ve aşındırıcı olmayan paslanmaz çelik tel beslemek, üst kısmında küçük, bir milimetre uzunluğunda döngü yapma. Sınıf kılcal damar ucuüzerine açık oje küçük bir damlacık yerleştirin, kılcal ve tel döngü arasında yerinde tutmak için, döngü kısmına herhangi bir oje almak için emin olun, bu embriyolar zarar verebilir gibi.
Sonra da kurusun. Cam kılcal damarı tahta bir çubuk üzerine takmak için laboratuvar bandı kullanın, böylece aletin çubuk parçası daha sonra suya daldırma değil, çubuk ötesine uzanan cam kılcal yaklaşık iki buçuk santimetre bırakarak. Plastik bir spatula ile 100 milimetrelik cam Petri çanak, yaklaşık 0.5% metil selüloz% 2 metil selüloz yaklaşık 0.5 mililitre alt merkezi yakınında ince ve eşit olarak yaklaşık 0,5 milimetre kalınlığında yayıldı.
Yemeğin yan tarafına üçte bir Ringer çözeltisi yaklaşık 30 mililitre dökün ve yemeğin geri kalanına yayMak ve metil selüloz kapağı sağlar. Daha önce de-chorionated embriyolar yerleştirin 256 hücre bir K hücre evresine 2% metil selüloz üzerinde, emin embriyolar kendi tarafına yönelik olduğundan emin olun. Blastula doğramak için, hayvan direğine dik hayvan direğine yakın kesmek ve blastoderm hücrelerinin yaklaşık% 30-40 kesmek için tel döngü kullanın.
Ardından, kalan hücrelerin geri kalmasına yardımcı olmak için uçları hafifçe birbirine dokunun. Sarısı için, yumurta zarı nicking tarafından vegetal kutup yakınında küçük bir yara yapmak için monte tel kullanın, hangi sarısı birkaç dakika için dışarı sızmak neden olur, ve sonra iyileşmek. Sarısı dışarı sızma durduğunda, iyileşme için aynı çanak metil selüloz dışında embriyo taşımak için bir pipet kullanın.
Tüm embriyolar için blastula ve sarısı doğrama tekrarlayın ve embriyolar iyileşirken 30 dakika boyunca çanak rahatsız edilmeden bırakın. Daha sonra, embriyoları daha önce hazırlanmış 35 milimetrelik cam çanağı taze üçte bir Ringer çözeltisi içeren cam çanağı aktarmak için cam bir pipet kullanın ve görüntülemeye devam etmeden önce tam iyileşme sağlamak için 28,5 derece lik bir kantinde yerleştirin. Blastula ve sarısı ile iki adım doğrama yaptıktan sonra, embriyolar boyut farkı dışında, kontrol embriyoları ile karşılaştırıldığında gelişim aşamalarında görünüşte normal genel morfoloji gösterdi.
Öte yandan, blastula sadece doğranmış embriyolar tuhaf bir morfoloji gösterdi, özellikle erken aşamalarında. Epiboly sırasında, embriyolar dar ve girintili bir görünüme sahipti. Aşağıdaki somite evresinde orta hat yapılarının birçok eksenel düzeyde düzleştirilmiş olduğu bulunmuştur.
Daha sonraki aşamalarda, sarısı bitişik vücut yapıları, orta ve arka beyin gibi hala nispeten düzleştirilmiş bir şekil gösterdi, muhtemelen nispeten daha büyük sarısı artan gerginlik nedeniyle. Somit oluşumunun zaman atlamalı görüntülemesi, hem kontrol hem de doğranmış embriyolarda, daha sonraki evrelerde oluşan somitlerin boyutlarının önceki aşamalara göre daha küçük olduğunu göstermiştir. Ayrıca, somit oluşum aşamaları boyunca, doğranmış embriyolar kontrol embriyoları olanlara göre daha küçük somites vardı.
Membran mCherry enjekte edilen embriyolarda iki adım doğrama tekniği yapıldığında, omuriliklerinin döllenme sonrası 20 saat sonra görüntülenmesi, boyut küçültme nedeniyle nöral tüp yüksekliklerinde azalma göstermiştir. İki adım doğrama çok yüksek verimlilik ile küçük ama aksi takdirde normal embriyolar elde etmek önemlidir. Blastuladan hücreleri keserken sarısını doğramamayı unutmamak önemlidir.
Sarısı için, içeriği dışarı sızmak için üzerinde küçük bir yara yapmak. Ve sarısı membran uygun tampon doğal olarak iyileşir. Doğranmış embriyolar hızlı bir şekilde kurtarılabildiği için, normal embriyolara herhangi bir yöntem veya analiz uygulanabilir.
Bu tekniğin sadeliği ve çok yönlülüğü çok güçlüdür, çünkü herkes zebrabalığındaki herhangi bir doku veya organdaki ölçekleme problemini incelemek için bu tekniği tanıtabilir. Bu teknikle araştırmacıların daha önce el değmemiş çeşitli sistemlerde ölçekleme sorunlarını çözebileceğine inanıyoruz. Biz zaten somit ve nöral tüp desenölçekleme önemli keşifler yaptık.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu makale, normal gelişim süreçlerini korurken zebra balığı embriyolarının boyutunu azaltmak için bir yöntemi açıklar. Teknik, boyut değişikliklerine tepki olarak desen ölçeklendirme ve gelişim sağlamlığı çalışmalarını kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Gelişimsel Biyoloji
- Zebra Balığı Araştırması
- Embriyoloji
Arka Plan
- Ölçeklendirme, gelişim sistemlerinin temel bir özelliğidir.
- Çeşitli organ ve dokulardaki ölçeklendirme mekanizmalarını anlamak çok önemlidir.
- Zebra balıkları, canlı görüntüleme ve genetik çalışmalar için avantajlıdır.
- Embriyoların sağlığı, boyut azaltma tekniğinin başarılı uygulanması için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Gelişim biyolojisindeki dinamik ölçeklendirme süreçlerine olan anlamayı geliştirmek.
- Zebra balığı embriyolarında boyut azaltma için basit bir yöntem sağlamak.
- Gelişim sağlamlığının nicel analizini mümkün kılmak.
Kullanılan Yöntemler
- Zebra balığı embriyoları için boyut azaltma tekniği.
- Gelişim süreçlerini gözlemlemek için canlı görüntüleme.
- Gelişmiş analiz için genetik manipülasyon.
- Koroyon çıkarılması sırasında hasarı en aza indirgemek için dikkatli kullanım.
Ana Sonuçlar
- Teknik, gelişimi bozmadan etkili boyut azaltmasına izin verir.
- Embriyo sağlığı, yöntemin başarısı için esastır.
- En iyi sonuçlar için genç balıkların ebeveyn olarak kullanılması gerekir.
- Yöntem basittir ve özel ekipman gerektirmez.
Sonuçlar
- Boyut azaltma tekniği, gelişim süreçlerini incelemek için değerli bir araçtır.
- Zebra balıklarındaki ölçeklendirme mekanizmalarının anlaşılmasını artırır.
- Bu yaklaşım, gelişimsel biyoloji araştırmalarında geniş çapta uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding embryonic pattern scaling is critical for de-risking target validation in developmental biology and regenerative medicine. The zebrafish size reduction technique enables quantitative assessment of morphogen-mediated patterning robustness, supporting predictive confidence in early discovery. This approach addresses a key inflection point in portfolio triage by linking size perturbation to functional readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by testing whether body patterning scales proportionally with embryo size.
- Operational Value: Provides a simple, equipment-free method to generate smaller embryos for high-throughput phenotypic screening.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by revealing whether morphogen gradients adjust dynamically to tissue size.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates size-matched biological systems for standardized assay conditions across genetic or chemical perturbations.
- Operational Value: Facilitates reproducible live imaging and quantitative analysis of developmental dynamics in scaled systems.
- Scalability: The technique’s simplicity allows adaptation across laboratories without specialized training or infrastructure.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables disease-relevant scaling studies in zebrafish models of congenital disorders involving body plan abnormalities.
- Preclinical Model: Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying patterning fidelity under size stress.
- Biomarker Alignment: Facilitates correlation of morphological readouts with molecular markers in scaled embryos.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from hypothesis testing to lead identification by providing scalable embryonic systems for mechanistic insight.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by testing scaling behavior in mutants or drug-treated embryos.
- Screening: Delivers assay-ready, size-reduced embryos with recovered morphology for compound evaluation.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as somite size, neural tube height, and midline structure integrity.
- Translational Research: Connects to preclinical work through conserved scaling mechanisms in vertebrate development.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying scaling in multiple tissues and organs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in size-dependent patterning mechanisms.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility across labs through a simple, low-cost procedure.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of scaling failures in candidate pathways.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on developmental robustness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology and microsurgical techniques.
- Needs standard laboratory tools: glass capillaries, stainless steel wire, methyl cellulose, and Ringer’s solution.
- Demands cross-team standardization of embryo staging and wound size for consistent results.
- Involves adaptation considerations when applying to different genetic backgrounds or environmental conditions.
- Limited by embryo fragility and the narrow time window for blastula-stage manipulation.
