Name: Arabidopsis thaliana Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-21T13:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 11 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis thaliana'da oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu ölçüm yöntemleriyle bitki bağışıklık yanıtlarını değerlendirmeyi. Bu hızlı ve güvenilir teknikler farklı genotiplerin karşılaştırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Laboratuvarımızda çalışmak, Kanada 'nın doğal kaynaklar ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC) Discovery programı, Kanadalı Inovasyon Vakfı John R. Evans Leader 'ın Fonu ve Kraliçe 'nin Üniversitesi aracılığıyla finanse edilmektedir. KS ve yüksek lisans öğrencileri (CGS-M) için tandem Ontario Lisansüstü Bursları ve NSERC Kanada lisansüstü Burslar tarafından desteklenir.

1. bağışıklık özelliğini takiben Arabidopsis yaprak DISKLERINDE Ros patlaması algılanması
<ol><li>Bitki büyüme ve bakım.<ol>
<li>Çimlenme senkronize etmek için, yaklaşık 50 tohumları askıya alarak Arabidopsis tohumları tabakalaşmak steril 0,1% agar [w/v] ve mağaza 4 °c (ışık yok) içinde 3-4 gün için 1 ml. Not: bir vahşi tür arka plan denetimi (örneğin, col-0) ve yüksek ve düşük bağışıklık çıkışları (örneğin, cpk28-1 ve BaK1-5, sırasıyla) ile genotipler iç denetimler olarak hizmet vermek için stratify.</li>
		<li>Toprak üzerinde tohum ekmek ve standart kısa gün koşulları altında çimlenme (22 °C, 10 h ışık, 150 mE/m2/s ışık yoğunluğu, ve 65-70% bağıl nem).</li>
		<li>Yaklaşık 7 gün sonra, tam rozet gelişimine izin vermek için en az 4 cm ayrılmış yeni tencere, bireysel fide nakli için forseps kullanın. Organ nakli 6-12, genottipe göre fide ve standart kısa gün koşullarına döner. Düzenli olarak su ve gübreleme bitkiler (1 g/L 20-20-20 gübre her 2 hafta).</li>
	</ol></li>
	<li>Gece kurtarma için 96-Well plakaları yaprak diskleri toplayın.<ol>
<li>4-5 hafta sonrası çimlenme (Şekil 1a), bitki başına bir yaprak disk kaldırmak için keskin bir 4 mm biyopsi Punch kullanın, orta damar kaçınarak ve daralan sınırlamak için dikkatli olmak (Şekil 1B). Bir kullanılmayan 96-Well Luminometre plaka içeren 100 μL DDH2O, eksene yan yukarı bakacak şekilde, kurutan22 (Şekil 1C) önlemek için yaprak diskleri yerleştirin. Birden fazla elicitors değerlendiriyorsanız, her elicitor tedavi için aynı yaprak 1 yaprak disk çıkarın. Not: örnek yaprakları tamamen genişledi, üçüncü beşinci rozet üst ve yaklaşık aynı boyut ve yaş değişkenlik sınırlamak için. Mümkünse, gece kurtarma öncesinde bir jilet kullanarak yarım yaprak diskleri kesme, bu elicitor çözüm23maruz yüzey alanı artar gibi.</li>
		<li>Yaprak disk toplama sırasında yaralama tarafından üretilen Ros müdahalesi önlemek için oda sıcaklığında bir gecede kurtarın. Buharlaşma önlemek için bir kapak ile kapak plakaları.</li>
	</ol></li>
	<li>Performans ve ölçme ROS üretimini gerçekleştirin.<ol>
<li>Bu ROS patlama başlangıcı ve kaydedilen ilk ölçümler arasındaki süreyi azaltacaktır gibi reaksiyon çözümü eklemeden önce plaka okuyucu programı. Plaka okuyucusu için uygun bir ticari yazılım kullanın. Bizim durumumuzda ( Içindekiler tablosunabakın), Ayarlar'ı tıklatın ve LUM96 Kartuşu ve Kinetic okuma türünü seçin. Okuma alanı kategorisini tıklatın ve kuyuların bir alt kümesini veya okunması gereken tüm plakası seçmek için sürükleyin. PMT ve optik sekmesinin altında, entegrasyon süresini 1.000 MS 'ye ayarlayın. zamanlama sekmesinin altında, toplam çalışma süresini 40-60 min ve Aralık 2 dakika olarak ayarlayın.</li>
		<li>Çok kanallı pipet kullanarak her bir kuyunun suyunu çıkarın. Not: Bu yaralama stres neden olabilir ve daha fazla değişken Ros çıkışları sonucu gibi yaprak diskleri delinmeyin.</li>
		<li>100 μM luminol, 10 μg/mL HRP ve istenilen konsantrasyonu içeren bir reaksiyon çözeltisi hazırlayın (örneğin: 1 nM, 10 nM, 100 nM, veya 1.000 nM) steril ddH2O, 1 96-Well plaka Için 10 ml solüsyonu kullanarak. Not: 10 mm 'lik bir stok, sıvı N2' de flaş dondurulması ve-80 °c ' de saklamak için düşük bağlayıcı tüplerde steril H2O 'da liyofilize peptidler çözülür. Kullanılmak üzere hazır olduğunda, steril H2O bir 100 μM çalışma stok ve mağaza-20 °c üretmek için stokları seyreltildi.</li>
		<li>Her bir kuyu için reaksiyon karışımı 100 μL dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın, aynı zamanda aynı tedavinin tüm yaprak diskler için çözüm ekleyerek22. Her bir genotip için bir kontrol reaksiyonu (hiçbir elicitor) dahil etme yokluğu bazal ROS düzeylerini değerlendirmek için. Bir Mikroplaka okuyucusu kullanarak görünür spektrumdaki tüm dalga boylarında ışık emisyonunu hemen ölçün. Not: luminol ve HRP 'nin ışığa duyarlı reaktifler olduğu gibi, reaksiyon çözümünü düşük ışıkta hazırlayın ve uygulayın. Kullanımda olmadıkça reaktifleri buzda veya-20 °C ' de tutun.</li>
		<li>Dinamik oksidatif patlaması (Şekil 1D) yakalamak için bir Mikroplaka okuyucuda 40-60 min aralığında bir 1.000 MS entegrasyon süresi ile ışık emisyonunu 2 dakika aralıklarla ölçün. Not: test hassasiyeti11' i iyileştirmek için daha uzun bir entegrasyon süresi kullanın, 96-Well plakalı tüm numunelerin bir Aralık içinde ölçülmesini sağlayarak.</li>
	</ol></li>
	<li>Veri yorumu.<ol>
<li>Her genotip için, her zaman noktasında ortalama foton sayımı ve standart hatayı hesaplamak için bir elektronik tablo uygulaması kullanın ve bir dağılım çizimi kullanarak ROS üretimini zaman işlevi olarak görüntüleyin. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq1.jpg"> Nerede t = her zaman noktası
</li>
		<li>Alternatif olarak, her yaprak disk için foton sayar ve standart hata çubukları veya bir kutu ve bıyık çizimi ile bir çubuk grafik kullanarak her genotip için bu değerlerin ortalamasını mevcut. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq2.jpg">
</li>
	</ol></li>
</ol>2. fide büyüme Inhibisyonu assay
<ol><li>, Tohumları sterilize ve Murashige ve Skoog (MS) plakaları üzerinde ekmek.<ol>
<li>Hazırlamak steril yarı mukavemet (0.5 x) MS Orta (2,16 g/L) içeren 0,8% agar [w/v]. Laminar akış kaputunda (90 x 15 mm) plakalara medya dökün.</li>
		<li>Sterilizasyon yaklaşık 100 tohum bir mikrosantrifüjlü tüp ile yıkayarak 1 mL 70% etanol 2 dakika ve aspirasyon ile çıkarın. Oda sıcaklığında 17 dakika için 1 mL 40% çamaşır suyu ve hafifçe kaya ekleyin. Aspirasyon ile çamaşır suyu çıkarın ve 5 dakika steril su 1 mL 'de üç kez yıkayın. 1 mL steril 0,1% agar içinde resuspend. Not: Alternatif olarak, klor gazı tohumu sterilizasyon Protokolü24kullanın.</li>
		<li>Bir laminar akış kaputu Micropore bant ile bir pipet ve mühür kullanarak MS agar plakaları üzerinde genotip başına yaklaşık 100 tohum Sow. Not: Bu nakli fide daha sonra zor hale gelecek gibi yakın tohum yerleştirme kaçının.</li>
		<li>3-4 gün boyunca 4 °C ' de (ışık yok) tabak koyarak çekirdekleri dikerek tohumlama (Şekil 2a).</li>
	</ol>
</li>
	<li>48 içine nakil fide-iyi plakalar bağışıklık elicitor peptidler içeren.<ol>
<li>Tabakalaşma sonrası, kısa gün koşullarında (22 °C, 10 h ışık, 150 mE/m2/s ışık yoğunluğu ve 65-70% bağıl nem) altında ışık için plakaları taşımak için 3-4 gün çimlenme izin.</li>
		<li>Bir laminar akış kaput, hazırlamak elicitor peptid seyreltme (0 Nm, 1 Nm, 10 Nm, 100 Nm, ve 1.000 Nm) steril 0.5 x MS sıvı medya içeren 1% sakaroz [w/v], kullanarak 25 ml MS her 48-kuyu plakası için. Pipetleme ile plakaları hazırlayın 500 μL MS sıvı orta veya MS orta içeren peptidler her iyi. Eğer varsa, işlemi hızlandırmak için plaka hazırlama için bir tekrarlama pipetör kullanın. Not: her genotip Için, fide büyüme herhangi bir içsel farklar için hesaba elicitor olmadan MS fide büyümek.</li>
		<li>Steril forseps kullanarak dikkatle aynı büyüklükte ve yaş her iyi bir fide nakli, orada tohum ya da köküne kırılma zarar ve kök medyada batık olduğunu sağlamak. Her genotip için, her peptit seyreltme içine en az 6-8 fide nakli (Şekil 2B). Not: nakil fidanları 4 gün sonrası çimlenme, kısa kökleri manipüle etmek daha kolaydır, ve eski fide daha az optimum sonuçlar verebilir.</li>
		<li>Micropore bant ile mühür plakaları ve standart kısa günlük koşullar altında ışığa geri hareket (22 °C, 10 h ışık, 150 mE/m2/s ışık yoğunluğu, ve 65-70% bağıl nem). Fidanların 8-12 gün boyunca büyümesine izin verin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yüzde büyüme inhibisyonu belirleyin.<ol>
<li>Dikkatle 48 gelen fide kaldırmak-kuyu plakaları ve kağıt havlu üzerinde dabbing tarafından kuru. Fidanları analitik ölçekte ve kayıt değerlerine göre tartın. Varsa, bir elektronik tabloya taze ağırlık değerleri kaydetmek için USB çıkışı ile donatılmış bir analitik ölçek kullanın. Fide Tartmadan önce, büyüme inhibisyonu görsel olarak görüntülemek için bir fotoğraf çekin (Şekil 2C).</li>
		<li>Sadece MS 'de yetiştirilen fide ile karşılaştırıldığında elicitor işlenmiş fide yüzde büyüme inhibisyonu belirlemek (Şekil 2D) aşağıdaki gibi: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/59437/59437eq3.jpg">
</li>
		<li>Standart hata çubukları ile bir çubuk grafik kullanarak veya daha iyi görüntüleme inter-deneysel varyans bir kutu ve bıyık Plot kullanarak veri çizmek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Bu yazıda, Arabidopsis'te desen tetiklenen immün tepkiler vermek için iki yöntem açıklanmaktadır, özel ekipman kullanmadan bağışıklık çıkışını değerlendirmek için nicel yaklaşımlar sunar. Kombinasyon halinde, çoğaltma tetikleyen ROS ve SGı, sırasıyla mikrobe algısına erken ve geç yanıt değerlendirmek için kullanılabilir.
Oksidatif patlama tahlil büyük sınırlama değişkenlik olduğunu. Tamamen anlaşılmayan nedenlerle, mutlak RLUs 'Lar genellikle deneyler arasındaki büyüklük sırasına göre...

Patojenlere karşı tespit etmek ve savunmak için, bitkiler mikroorganizma ilişkili moleküler desenler (MAMPs)1olarak bilinen hücrenin dışında bulunan mikrobiyal molekülleri algılayan membran bağlı desen tanıma reseptörleri (prrs) gelişti. MAMPs 'ın bilat PRRs 'larına bağlanması, geniş spektrumlu hastalık direnci2' ye neden olan protein kinaz aracılı bağışıklık sinyallerini başlatır. PRR aktivasyonunun ardından en erken yanıtlardan biri, ekstraselüler reaktif oksijen türlerinin (ROS) üretimini katalizleştiren entegre plazma membranı solunum PATLAMASı OKSIDAZ HOMOLOG (RBOH) proteinlerinin fosforilasyon ve aktivasyonu olduğunu3 , 4. Ros bağışıklık sinyalizasyon yanı sıra doğrudan antimikrobiyal ajanlar5yaymak için ikincil haberciler olarak hareket, hastalık direnci kurulması önemli bir rol oynamaktadır. Bağışıklık-elicited oksidatif patlama ilk gözlem CV patates yumrular kullanılarak tanımlanmıştır. Rishiri Phytophthora Mildiyö aşı takip6. ROS üretimi, yaprak diskler7, hücre süspansiyon kültürleri8ve protoplastlar6kullanarak çeşitli bitki türlerinde değerlendirildi. Burada açıklanan Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) yaprak DISKLER desen tetiklenen Ros üretimi için basit bir yöntemdir.
Mamp algı bir yanıt olarak, aktif rboh proteinleri superoksit radikallerin üretimini katalizler (o2-), hidroksil radikaller (• Oh), ve atlet oksijen (1o2) hidrojen peroksit dönüştürülür (H2o 2) ekstrellüler uzayda9. H2O2 oksitleyici ajanın varlığında luminol tabanlı kemiluminesans ile NICELIK olabilir (HRP)10. HRP oksitler H2O2 üreten bir HIDROKSIT iyon (Oh−) ve oksijen gazı (O2) hangi ışık bir foton bültenleri kararsız bir ara üretmek için luminol ile reaksiyon10. Foton emisyonu bağıl ışık üniteleri (RLUs) olarak, en moleküler laboratuvarlarda standart ekipman parçaları haline gelen Luminesans algılayabilen bir Mikroplaka Okuyucu veya görüntü kullanarak nicelik olabilir. 40-60 dakikalık bir Aralık üzerinde üretilen ışığı ölçerek, geçici bir oksidatif patlama, elicitor tedavisinden sonra 2-5 dakika kadar erken, 10-20 dakika içinde peaking ve ~ 60 dakika11' den sonra bazal seviyelere dönerek tespit edilebilir. Bu zaman kursunda üretilen birikimli ışık, RBOH proteinlerinin aktivasyonuna karşılık gelen bağışıklık gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir12. Uygun, bu tahlil özel ekipman veya hantal numune hazırlama gerektirmez.
MAMP algılama kısa bir süre sonra peaking, oksidatif patlama erken bağışıklık yanıtı olarak kabul edilir, MAPK aktivasyon ve etilen üretimi ile birlikte5. Daha sonra bağışıklık tepkiler transkripsiyonel yeniden programlama, evcikli kapatma ve kallose biriktirme2,5içerir. MAMPs 'a uzun süreli maruz kalma, bitki büyümesinin inhibisyonu ile sonuçlanan, kalkınma ve bağışıklık13arasında bir ticaret-off göstergesidir. Desen-tetiklenen fide büyüme inhibisyonu (SGI) yaygın Arabidopsis bağışıklık çıkışı değerlendirmek için kullanılan ve prrs dahil bağışıklık sinyalizasyon birkaç anahtar bileşenlerinin tanımlanması için ayrılmaz olmuştur14,15 ,16. Bu nedenle, bu kağıt Ayrıca model için bir tahlil sunuyor- Arabidopsisiçinde SGI tetikleyen, fidanlar çok iyi plakalar standart medya veya medya 8-12 gün için bir bağışıklık elicitor ile tamamlayıcı içeren yetiştirilen ve daha sonra tartılır analitik bir ölçek kullanarak.
ROS ve SGı 'nin PRR-aracılı sinyalizasyon izlemek için nasıl kullanıldığını göstermek için, farklı bağışıklık çıkışlarını temsil eden üç genotip seçilmiştir: (1) vahşi tip Arabidopsis üyeliği Columbia (col-0), (2) dominant-negatif BaK1-5 mutant içinde çok fonksiyonlu PRR Co-reseptör brassinosteroıd duyarsız 1-ilişkili kinase 1 (BAK1) bağışıklık sinyalizasyon fonksiyonel olmayan17,18, ve (3) resessive cpk28-1 mutant, hangi yoksun Düzenleyici protein kalsiyum bağımlı protein kinaz 28 (CPK28) ve görüntüler artmış bağışıklık tetiklenen tepkiler19,20. Ros ve SGI tanılar, PRR EF-tu reseptör (EFR)15ile Arabidopsis 'te tanınan, bakteri uzaması Factor tu (EF-tu) ' ın sentetik olarak üretilen elf18 peptid epitopu yanıtı ile sunulmuştur. Bu protokoller bakteriyel motilite protein flagellin14 veya endojen bitki Elicitor proteinleri (AtPeps)16gibi diğer immün elicitors ile kullanılabilir, ancak, bu bitki yanıt bağlı olarak farklılık unutulmamalıdır 21. ROS ve SGı desteği, erken ve geç PRR aracılı yanıtların hızlı ve nicel değerlendirilmesi için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>20-20-20 Gübre Bitki</td><td>Ürünü</td><td>10529</td><td>1 g/L suda karıştırın ve optimum büyüme için her 2 haftada bir bitkilere uygulayın.</td></tr><tr><td>4 mm Biyopsi Punch</td><td>Medical Mart</td><td>232-33-34-P</td><td>0,125 cm^2 yüzey alanına sahip mantar delici seti de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Kapaklı 48 Kuyulu Steril Plakalar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3548</td><td></td></tr><tr><td>Taslak Sheid'li Analitik Terazi</td><td>VWR</td><td>VWR-225AC</td><td>Büyüme başlatma testleri için herhangi bir standart analitik terazi kullanılabilir, ancak doğrudan bir bilgisayar çıktısı en uygunudur.</td></tr><tr><td>BioHit mLine Mekanik 12 Çok Kanallı Pipet (30-300 uL)</td><td>Sartorius</td><td>725240</td><td>Herhangi bir çok kanallı pipet kullanılabileceği gibi gerekirse tek bir pipetleyici de kullanılabilir.</td></tr><tr><td>elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG)</td><td>EZ Biolab</td><td>cp7211</td><td>Düşük protein bağlayıcı tüplerde -80 ° C'de 10 mM stok peptidi saklayın. Çözüldüğünde 100 uM çalışma stoğunu -20C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Forseps</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu Peroksidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6782</td><td>Saf suda çözünür. -20C'de ve ışıktan uzakta saklayınız.</td></tr><tr><td>Luminol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8511</td><td>DMSO'da çözünür. -20C'de ve ışıktan uzakta saklayınız.</td></tr><tr><td>Murisage ve Skoog Bazal Tuzları</td><td>Cedarlane Labs</td><td>MSP09-100LT</td><td>4C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Soil</td><td>SunGrow Horticulture</td><td>Sunshine Mix #1</td><td>Arabidopsis yetiştirmek için diğer toprak türleri de kullanılabilir. Tencereleri doldururken su ile karıştırın.</td></tr><tr><td>SpectraMax Paradigma LUM Modüllü Çok Modlu Mikroplaka Okuyucu</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Fiyat teklifi istemek zorundadır</td><td>Bu testler için lüminesansı tespit edebilen herhangi bir plaka okuyucu kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-1KG</td><td>Oda sıcaklığında saklayın.</td></tr><tr><td>Beyaz Polistiren 96 Kuyulu Plakalar</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-589</td><td></td></tr></tbody></table>

arabidopsis thaliana 'da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu asder

Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Bitkiler, patojenleri algılamak ve hastalığa karşı korumak için sağlam bir bağışıklık sistemi geliştirmiştir. Bu yazıda elicitor molekülleri ile tedavi sonrasında Arabidopsis thaliana bağışıklık aktivasyonunun gücünü ölçmek için kullanılabilecek iki asder açıklanmaktadır. İlk sunulan bir luminol tabanlı tahlil kullanılarak izlenebilir hızla indüklenen ve dinamik oksidatif patlama, yakalamak için bir yöntemdir. İkinci sundu fide büyüme bağışıklık kaynaklı inhibisyonu ölçmek için nasıl açıklayan bir yöntemdir. Bu protokoller hızlı ve güvenilirdir, özel eğitim veya ekipman gerektirmez ve bitki dokunulmazlığının genetik temelini anlamak için yaygın olarak kullanılır.

Mutant cpk28-119,25 ve BaK1-517,18 bitkiler oksidatif patlama ve sgi, sırasıyla, yüksek ve düşük immün tepkiler ile genotipler için beklenen sonuçları göstermek için kullanıldı bir vahşi tür arka plan denetimi (col-0) göreli olarak diyor. Doz bağımlı etkileri değerlendirmek için, 10 kat peptid seyreltme serisi (1-1000 nM) elf18 kullanılmıştır. Beklendiği ...

Bu yazıda bağışıklık elicitors maruz aşağıdaki Arabidopsis thaliana savunma tepkiler miktarının için iki yöntem açıklanmaktadır: geçici oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Plants have evolved a robust immune system to perceive pathogens and protect against disease. This paper describes two assays that can be used to measure ...

Bu tahliller değerlendirmek ve farklı bitki genotiplerinin bağışıklık çıktıları karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu tekniklerin en büyük avantajı, hızlı, güvenilir ve ortak laboratuvar ekipmanları kullanmak olmasıdır. Büyüme inhibisyonu töziçin, aynı boyutta ve yaştaki fideler, değişimi sınırlamak için tartılmadan önce nakledilmeli ve tamamen kurutulmalıdır.Çimlenmeden dört ila beş hafta sonra, Arabidopsis bitkibaşına göre bir yaprak diski çıkarmak için dört milimetrelik keskin bir biyopsi yumruğu kullanın, midveinden kaçının ve yaralanmayı sınırlamaya dikkat edin. Desiccation önlemek için, kuyu başına çift distile su 100 mikrolitre içeren kullanılmayan 96-iyi luminometer plaka bireysel kuyular halinde diskler toplayın, adaxial tarafı kadar. Birden fazla elicitors değerlendirirken, her elicitor tedavisi için aynı yaprak diski çıkarın ve yaprak diskler oda sıcaklığında bir gecede kurtarmak için izin vermek için kapağı ile plaka kapağı.Ertesi sabah, dinamik oksidatif patlamayı yakalamak için mikroplaka okuyucu parametrelerini 40 ila 60 dakikalık bir süre içinde iki dakikalık aralıklarla 1,000 milisaniyelik bir tümleştirme süresine ayarlayın. Daha sonra, her kuyudaki suyu 100 mikrolitre taze hazırlanmış reaksiyon çözeltisi ile değiştirmek için çok kanallı bir pipet kullanın, buna bir kontrol, her genotip için elicitor reaksiyonu olmadan, elicitation yokluğunda bazal reaksiyon oksijen türleri seviyelerini değerlendirin. Daha sonra, mikroplaka okuyucudaki görünür spektrumdaki tüm dalga boyları için ışık emisyonuna hemen görebilen.Çimlenme sonrası dört gün, elicitor peptid seyreltme ile birlikte MS orta 500 mikrolitre ile 48-iyi plaka her kuyu yükleyin. Daha sonra, her peptid seyreltme altı ila sekiz fide dikkatlice nakli için steril forceps kullanın, kök için fide veya kırılma hiçbir zarar olduğunu ve kök orta batık olduğunu dikkat. Tüm fideler kaplandığında, plakaları Mikropore bantla kapatın ve bitkileri 8 ila 12 gün boyunca standart kısa gün koşullarına yerleştirin.Yüzde büyüme inhibisyonu belirlemek için, dikkatle her kuyudan fide çıkarmadan önce büyüme inhibisyonu görsel olarak kaydetmek için bir fotoğraf çekmek. Sonra, kurubir kağıt havlu üzerinde kökleri dab ve analitik bir ölçekte her fide tartmak. Bu temsili deneyde, hiperaktif immün sinyalizasyonu olan mutant bitkiler yabani tip Arabidopsis bitkilerine göre daha yüksek kümülatif ve ortalama oksidatif patlama gösterirken, bağışıklık sinyali bozulmuş mutant bitkiler 10 ile 1000 nanomolar arasında konsantrasyonlarda azaltılmış oksidatif patlama göstermiştir.100 ve 1,000 nanomolar elicitor peptid konsantrasyonlarında yetişen tüm genotipler arasında fide büyüme inhibisyonunda beklenen farklılıklar da ayırt edilebilir. 1, 000 nanomolar peptid seyreltme büyüdü, hiperaktif bağışıklık sinyali ile mutantlar belirgin aynı koşullar altında yetiştirilen yabani tip bitkilerdaha küçüktü, bozulmuş bağışıklık sinyali ile mutantlar yabani tipi bitkilere göre büyüme zayıf bir inhibisyon gösterdi. Bu yöntemler erken ve geç immün yanıtlar için kanıt sağlar.MAP kiazaz tahlilleri, patojen kaynaklı gen ekspresyonu ve enfeksiyon tahlilleri de dahil olmak üzere diğer birçok teknik, bu yolları nitada etmek için kullanılabilir. Bu teknikler, patojen reseptör proteinlerini ve diğer bazı sinyal bileşenlerini başarıyla tanımlayan büyük ölçekli ekranlarda kullanılmak üzere değiştirilmiştir.

pattern-triggered-oxidative-burst-seedling-growth-inhibition-assays

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

PTI Nicotiana benthamiana bitkiler için bir hücre ölümü tabanlı test açıklanmıştır.

Patojen İlişkili Moleküler Desen (PAMP) Triggered Tesisleri Bağışıklık (PTI) için Testi

Hücre biyolojisinde temel bir arayış ökaryotik hücrelerin yapmak organellerin kimliği altında yatan mekanizmaları belirlemektir. Burada floresan mikroskobu ve yeni nesil dizileme araçlarını kullanarak bitki organel morfolojik ve fonksiyonel bütünlüğü sorumlu genleri tanımlamak için bir yöntem öneriyoruz.

Floresans-mikroskopi Tarama ve nesil Sekanslama: organel Bütünlüğü ile ilgilendim Genlerin belirlenmesi için Faydalı Araçlar

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

Bu video, immün elisyon üzerine Arabidopsis yapraklarındaki oksidatif patlamayı ölçmek için yapılan bir testi göstermektedir. Bitki yapraklarından kesilen yaprak diskleri, mikropla ilişkili moleküler desenler veya MAMP'lar olarak işlev gören bakteriyel peptitlerle inkübe edilir. MAMP'ların tespiti üzerine, bitki hücreleri, bir kemilüminesans testi kullanılarak tespit edilen hücre dışı ROS üretimini indükler.

İmmün Ortaya Çıkarma Üzerine Arabidopsis Yaprak Disklerinde Oksidatif Patlamayı Tespit Etmek İçin Bir Test

Bu video, Arabidopsis thaliana bitkisindeki fide büyüme inhibisyonu testini göstermektedir. Artan immün peptit elisitör konsantrasyonunun fide büyümesi üzerindeki etkisi belirlenir.

Fide büyümesinin bağışıklık kaynaklı inhibisyonunun ölçülmesi

Patojen büyümesinin niceliksel olarak belirlenmesi, çeşitli Arabidopsis thaliana (bundan böyle Arabidopsis olarak anılacaktır) bağışıklık tepkilerini karakterize etmek için güçlü bir araçtır. Burada açıklanan yöntem, Pseudomonas syringae pv'yi ölçmek için optimize edilmiş bir şırınga infiltrasyon testi sunar. maculicola ES4326 yetişkin Arabidopsis yapraklarında büyüme.

Kullanarak Bitki Savunma Yanıtları ince Karakterizasyonu için Bakteriyel Yaprak Sızma Deneyi<em&gt; Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae</em&gt; Pathosystem

Bu çalışmanın amacı çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon steril ortam üzerinde yetiştirilen bir aralığı Arabidopsis genotip tohum çimlenmesi üzerindeki etkilerini belirlemek için yapıldı. En iyi duruma getirilmiş sterilizasyon protokolleri tatmin edici tohum hayatta kalma sağlarken mikrobiyal kirleticiler gelişimini engellemek için geliştirilmiştir.

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) tohumlarının yüzey sterilizasyonu için yüksek verimli bir protokol sağlanır ve sıvı taşıma adımlarını vakum pompası ile inşa edilmiş basit bir emiş cihazı ile optimize eder. Bir günde yüzlerce tohum örneği yüzey sterilize edilebilir.

Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem

Burada, Arabidopsis fide de-etiolasyonunun erken aşamalarında klorofil biyosentezinin izlenmesi için tasarlanmış gelişmiş bir aracı açıklıyoruz. Yeni metodoloji, yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlükte non-invaziv gerçek zamanlı klorofil floresan görüntüleme sağlar.

Arabidopsis De-etiolasyonunun Erken Aşamalarında Klorofil Biyosentez Kinetiğinin Belirlenmesi için Non-İnvaziv Test

Burada, Arabidopsis thaliana'da bakteri istilasına karşı stoma yanıtlarının doğrudan gözlemlenmesi ve otomatik ölçümü için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, cihaz tarafından yakalanan yaprak görüntüleri için tasarlanmış bir görüntü analizi boru hattı ile birlikte taşınabilir bir stoma görüntüleme cihazından yararlanır.

Pseudomonas syringae pv'ye Stoma Yanıtlarının Doğrudan Gözlemi ve Otomatik Ölçümü. domates DC3000 içinde Arabidopsis thaliana

Bu protokol, aynı örnekte bitki iyon sızıntısı, peroksidaz aktivitesi ve kallos üretimini değerlendirmek için yüksek verimli bir yaklaşımı tanımlar.

Mikrobiyal İkincil Metabolitlere Yaprak Yanıtlarının Yüksek Verimlilikli Bir Formatla Değerlendirilmesi

Öğrenin, Arabidopsis thaliana'da oksidatif patlama ve fide büyüme inhibisyonu ölçüm yöntemleriyle bitki bağışıklık yanıtlarını değerlendirmeyi. Bu hızlı ve güvenilir teknikler farklı genotiplerin karşılaştırılmasına olanak tanır.

Arabidopsis thaliana 'Da desen tetiklenen oksidatif patlama ve fide büyüme Inhibisyonu asder

Daha fazla video keşfet