Sağlam dokulara ve standart nicel Western Blot kullanarak geliştirme boyunca Protein düzeylerinin karşılaştırılması

Bu protokol, farklı doku ve zaman noktaları arasında protein ekspresyonuna bakarak temel ve klinik araştırmalardaki önemli soruları ele almak için kullanılabilir. Güvenilir kantitatif Batı lekeleme gerçekleştirmek için, bir iç yükleme kontrolü ile floresan toplam protein lekesi birleştirir. Bu deneysel koşullar arasında çeşitli dokular karşılaştırArak ortaya çıkan sınırlamalar üstesinden.

Dondurulmuş hücre veya doku örneklerinden protein elde etmek için, tabloya göre numuneleri uygun şekilde yıkamadan önce eksi 80 derecelik numuneleri buz üzerinde eritin. Polipropilen havaneli el ele elektrif homojen kullanarak, yıkanmış numuneleri homojenize edin, havaneleri çift distile suda durulayın ve numuneler arasında temiz bir doku ile kurutun. Örnekleri 10 dakika buzda bırakın, ardından santrifüj.

Daha sonra, protein içeren süpernatant'ı, peleti bozmadan buz üzerinde yeni bir tüpe aktarın. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi için, üç aylık konsantrasyonları artırarak sığır serum albumin standartları ayarlayın ve 96 kuyulu optik plakanın uygun kuyularına her protein örneğinden bir mikrolitre ekleyin. Protein konsantrasyonu düşük olması bekleniyor sayılsa 10 dakika veya daha uzun bir süre için 60 derece santigrat ısı bloğu üzerinde protein kuluçka ve bir plaka okuyucu üzerinde 560 nanometre emilimini ölçmek.

Plaka okuyucu ölçümlerini aktarın ve her numunenin ortalama emicilik değerlerini protein standardı kullanılarak elde edilen standart bir eğriyle karşılaştırarak protein konsantrasyonu hesaplayın. Protein miktarını normalleştirmek için, numune tamponu ve ultra saf sudaki protein örneklerinin seyreltmelerini hazırlayın ve numuneleri 70 derecelik bir ısı bloğunda 10 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, girdap ve kısaca santrifüj önce buz üzerinde örnekleri yerleştirin.

Elektroforez için, jel elektroforez odası sisteminde bir prekast dört ila % 12 Bis-Tris gradyan jel kurmak ve kuyuya bir protein standardının 3,5 mikrolitre yük. Membran arası normalizasyon için bir iç standart kullanırken, protein merdiveninin yanındaki ilk üç kuyuya diğer örneklere eşit bir miktar yükleyin ve her numunenin 30 mikrogramını kalan kuyulara yükleyin. Daha sonra, 10 dakika boyunca 80 volt istifleme jel istifleme jel ile örnekleri çalıştırın ek bir 45-60 dakika için 150 volt izledi.

Elektroforezsonunda, transfer yığını monte etmek için, filtre kağıdı takip polivinilidendiit membran içeren alt yığını üzerine protein jeli yerleştirin. Hava kabarcıklarını kaldırmak için blotrulokullanın ve hava kabarcıkları kaldırmak için tekrar yığını haddeleme önce filtre kağıdının üstüne üst yığını yerleştirin. Cihazın sol tarafındaki elektrotla tüm desteyi transfer cihazına aktarın ve jel süngeri, cihazın üzerindeki ilgili elektrik kontamıyla hizalandır diye yığının üstüne yerleştirin.

Kapağı kapattıktan sonra, uygun programı seçin ve başlatın. Programın sonunda, jel boyutuna membran kesilmiş ve toplam protein lekesi ile devam etmeden önce çift distile su ile hızlı bir şekilde kesilmiş membran yıkayın. Toplam protein boyama için, protein tarafı içe bakacak şekilde 50 mililitrelik bir tüp içine membran rulo ve bir duman kaputunda oda sıcaklığında beş dakika boyunca bir rulo üzerinde protein leke çözeltisi beş mililitre ile membran etiket.

Kuluçka sonunda, membranı beş mililitre yıkama çözeltisi ile hızlı bir şekilde yıkayın, tüpü yıkama arasındaki ruloya kısa bir süreliğine geri döndürün ve ardından ultra saf suyla kısa bir durulama layın. Membrana üç mililitre bloke tampon ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca silindir membran dönmek. Engelleme tamponu uygun optimize konsantrasyonda birincil ilgi antikorile değiştirin ve dört santigrat derece de rulo üzerinde membran kuluçka.

Ertesi gün, oda sıcaklığında rulo üzerinde yıkama başına taze PBS beş mililitre ile beş dakika boyunca membran altı kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca silindir üzerinde uygun ikincil antikor solüsyonu ile membran ı kuluçkaya yatırın ve yıkama başına 30 dakika üç yıkama. Son yıkamadan sonra membranı kurutun ve membranı ışıktan korumak için alüminyum folyo kullanın.

Görüntü edinimi için, protein tarafı aşağı bakacak şekilde membranı tarayıcıya yerleştirin ve yazılımdaki tarama alanını seçin. Ardından, her iki kanalda da görüntü edinin ve görüntüleri uygun bir görüntü analiz programına aktarın. Toplam protein boyama sonucunu göstermek için 700 nanometrekanalını görüntüleyin ve normalleştirme için ilgi alanını tanımlamak için Analiz ve Draw Rectangle'yi seçin.

Ardından, tanımlanan bölgenin analiz edilen şeritlerin tümü için aynı boyutta olduğundan emin olmak için ilk dikdörtgen alanını her bir örneğe kopyalayıp yapıştırın. Her şeritteki protein konsantrasyonu ölçmek için, hem toplam protein lekesi hem de ilgi proteininin sonuçlarını bir elektronik tablo programına kopyalayın ve en yüksek toplam protein leke sinyalini belirleyin. Daha sonra, normalleştirilmiş protein yükleme değerini elde etmek için her toplam protein leke savardırizasyon değerini bu değere bölün ve farklı örneklerdeki göreli protein ifade oranını hesaplamak için her bir örneklemdeki 800 nanometrelik sinyal değerini karşılık gelen normalleştirilmiş protein değerine bölün.

Bu temsili Batı lekeleri, doğum sonrası beş fareler den elde edilen dokulardan elde edilen proteinler 10 haftalık yetişkin farelerden elde edilen proteinler ile karşılaştırılır. Toplam protein lekesinin floresan yoğunluğunun ölçülmesi, her şeritteki dikdörtgen kutunun içindeki floresan yoğunluğunun ölçülmesi ile elde edilmiştir. Tüm şeritler analiz edildiğinde, floresan yoğunluğu örnekler arasında nispeten benzer kalır, normalleştirme için toplam protein lekesinin kullanılması nın bu amaca uygun olduğunu gösterir.

Floresan total protein lekesi de farklı gelişimsel zaman noktalarında protein düzeylerini karşılaştırmak için kullanılabilir. Örneğin, farelerde yaşla birlikte sağkalım motor nöron protein düzeyleri açıkça azalsa da, toplam protein lekeli nicelik sabit kalır. İç standartların kullanımı, floresan tabanlı normalizasyon ve yeterli istatistikler farklı koşullar arasında karmaşık protein ekspresyonu analizinin sağlamlığını artırır.

Bu protokol, geleneksel Batı leke tekniklerine katkıda, deneysel gruplar arasında uygun yükleme kontrolleri ve karşılaştırmalar sorunlarının üstesinden gelmek ve protein ekspresyonu analizi için esneklikler sağlamak. Bu yaklaşım, diğer deneysel koşullar altında protein ekspresyonunu karşılaştırmaya kadar genişletilebilir.